甜菜堿對大鼠肝癌的作用及其抗氧化機制研究

杜艷平，區俊文，王軍花，習文韜，唐艷輝

廣東祈福醫院營養科，廣東廣州510000

原發性肝癌(primary hepatic carcinoma，PHC)簡稱肝癌，嚴重威脅我國居民身體健康，是我國排名第四位的常見惡性腫瘤。肝癌死亡率高，在我國惡性腫瘤中死亡順位僅次于胃癌和食道癌而居第三位[1]。肝癌的形成是一個多因素的復雜過程，發病過程隱匿，不利于早期防治。

甜菜堿(Betaine)是季胺鹽型水溶性生物堿，具有多種生物學功能，可以降低毒物所導致的肝臟毒性，改善肝臟脂質過氧化狀態，對肝臟起到保護作用，這在一定程度上可減弱外來化合物誘發肝癌的效應[2-4]。為探討甜菜堿在肝癌發生過程的作用，本研究以Sprague-Dawley(SD)大鼠為研究對象，二乙基亞硝胺(DEN)誘發大鼠產生肝癌，并用不同劑量的甜菜堿進行干預，以觀察甜菜堿對肝癌形成的影響，并探討其可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 動物受試物及試劑甜菜堿(純度＞96%)，購自Finnfeeds Finland Ltd(芬蘭)公司；DEN(純度＞95%)，購自Sigma公司；血清肝功能相關酶所用試劑購自中生北控生物技術股份有限公司；肝勻漿脂質過氧化及抗氧化指標所用試劑盒購自南京建成生物工程研究所。

1.2 實驗動物及處理44只SPF級健康雄性SD大鼠，體質量(150±10)g，購自廣東省醫學動物實驗中心(合格證號：0015571)。適應環境3 d后進入實驗，將大鼠按照體質量編號后采用完全隨機與分層隨機相結合的方法分為三個組：正常組12只、DEN組18只、DEN+1%甜菜堿組(DEN+1%Bet組)14只。正常組、DEN組給予AIN-93G基礎飼料，在基礎飼料基礎上，甜菜堿干預劑量參考既往研究，DEN+1%Bet組添加1%甜菜堿。所有大鼠代謝籠飼養，自由攝食飲水，除正常組外，另外兩個組均給予0.01%DEN水置于避光飲水瓶中任其自由飲用。在實驗第8周，各組隨機選取5只大鼠，股動脈取血后脫臼處死，取肝、脾、肺、腎，稱重后-80℃保存，計算臟器指數(臟器重量與其體質量之比值，g/100 g)。DEN組在實驗第14周和15周各隨機選取2只大鼠處死以觀察肝癌形成情況，第15周末肝癌出現時處死各組所有大鼠。

1.3 指標測定

1.3.1 肝臟病理切片的制備對已發生肝癌的大鼠取肝結節及周圍組織，沒發生肝癌大鼠取右1/4肝上葉，10%中性福爾馬林固定，經脫水、透明、浸蠟、常規石蠟包埋、制備成5 μm左右的切片，蘇木素伊紅(HE)染色，進行常規組織學檢查。

1.3.2 血清肝功能相關酶測定全自動生化分析儀檢測血清丙氨酸轉氨酶(ALT)、天冬氨酸轉氨酶(AST)、堿性磷酸酶(ALP)、γ-谷氨酰轉移酶(GGT)。

1.3.3 肝勻漿脂質過氧化及抗氧化指標的測定稱取0.5 g肝臟，轉移至預冷的玻璃勻漿器中，加9倍(4.5 mL)冰冷的生理鹽水，冰上將肝臟研磨至10%勻漿，4 000×g離心20 min，取上清，分裝后-20℃保存待測。按試劑盒方法分別測定丙二醛(MDA)含量、谷胱苷肽硫轉移酶(GST)、超氧化物歧化酶(SOD)酶活性、以及總抗氧化能力(T-AOC)，考馬斯亮藍法測定肝勻漿蛋白質含量。

1.4 統計學方法應用SPSS22.0軟件進行數據統計分析，計量資料符合正態分布，以均數±標準差(±s)表示，多組計量資料比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，兩兩比較采用LSD-t檢驗。不符合正態分布的計量資料，以中位數[M(P25，P75)]表示，采用秩和檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 實驗動物的一般狀況給予DEN的兩個組大鼠從第2周開始體質量低于正常組；第4周之后逐漸出現被毛蓬松污穢、毛色黯淡，眼睛無神，精神萎靡，拱背等變化；DEN+1%Bet組上述癥狀比DEN組輕。DEN+1%Bet組第15周有一只大鼠死亡，解剖發現肝癌結節有破裂。從第2周開始DEN組、DEN+1%Bet組體質量低于正常組，差異均有統計學意義(P＜0.05)，而DEN組、DEN+1%Bet組體質量比較差異無統計學意義(P＞0.05)，見圖1。

圖1 各組大鼠體質量變化曲線圖

2.2 各組大鼠不同時間的臟器指數比較DEN組在第8周及第15周均有多個臟器指數升高，而DEN+1%Bet組只在第8周出現肺臟指數升高，差異均有統計學意義(P＜0.05)，見表1。

表1 各組大鼠不同時間的臟器指數比較(±s，g/100 g)

表1 各組大鼠不同時間的臟器指數比較(±s，g/100 g)

注：與正常組比較，aP＜0.05。

時間8周15周組別正常組DEN組DEN+1%Bet組F值P值正常組DEN組DEN+1%Bet組F值P值例數5 5 5 7 9 8肝臟指數2.530±0.191 2.519±0.094 2.204±0.193 2.292 0.144 2.148±0.180 3.506±0.511a 2.485±0.444 13.59 0.001脾臟指數0.150±0.032 0.206±0.035 0.202±0.044 3.561 0.061 0.157±0.024 0.219±0.035a 0.184±0.024 5.670 0.018肺臟指數0.416±0.038 0.836±0.206a 0.854±0.291a 7.926 0.006 0.371±0.103 1.417±0.907a 0.734±0.251 15.33 0.001腎臟指數0.650±0.021 0.789±0.161a 0.612±0.027 12.56 0.001 0.551±0.024 0.614±0.107 0.584±0.026 0.308 0.740

2.3 各組大鼠肝臟形態學觀察大體觀見圖2。第8周DEN+1%Bet組肝臟肉眼觀無明顯變化，DEN組肝臟腫大，表面粗糙暗淡、部分可見灰白色點狀斑點；第15周給予DEN的兩個組所有大鼠均有灰白色或灰黃色結節出現，但結節病變程度并不相同，DEN組肝臟多出現彌漫性大結節(直徑多為5 mm左右)，DEN+1%Bet組結節較小(直徑1 mm左右)、個數也比DEN組少。鏡下觀見圖3。第8周DEN+1%Bet組肝細胞結構輕微破壞，出現部分肝細胞肥大增生、少量空泡變性；DEN組肝細胞明顯空泡變性，局灶性壞死，纖維組織增生。第15周DEN+1%Bet組肝細胞核增大，染色質深染，呈現不典型增生；DEN組肝小葉結構完全破壞，結節內肝細胞異型性增生明顯，胞質染色不均勻，核大，核仁清楚，核分裂像多見。

圖2 大鼠肝臟大體觀

圖3 大鼠肝臟鏡下觀(10×40倍)

2.4甜菜堿在DEN致大鼠肝癌過程中對血清肝功能相關酶的影響由表2可知，DEN組無論在第8周還是第15周，ALT、AST、ALP、GGT均高于正常組，差異均有統計學意義(P＜0.05)；第8周，DEN+1% Bet組大鼠ALP和GGT均高于正常組，而AST卻低于DEN組，差異均有統計學意義(P＜0.05)；第15周，DEN+1%Bet組ALT、ALP、GGT均高于正常組，而ALT、AST卻低于DEN組，差異均有統計學意義(P＜0.05)。

表2 各組大鼠血清肝功能相關酶含量比較[±s，M(P25，P75)，U/L]

表2 各組大鼠血清肝功能相關酶含量比較[±s，M(P25，P75)，U/L]

注：與正常組比較，aP＜0.05；與DEN組比較，bP＜0.05。

時間8周15周組別正常組DEN組DEN+1%Bet組F/H值P值正常組DEN組DEN+1%Bet組F/H值P值例數5 5 5 7 9 8 ALT 24.00±2.12 37.50±1.91a 30.80±4.32 4.064 0.045 28.50±3.08 60.14±11.47a 41.33±4.55ab 39.46 0.001 AST 197.60±12.09 247.00±15.16a 196.00±11.87b 5.700 0.018 215.17±17.88 291.00±24.48a 235.33±19.12b 4.918 0.028 ALP 120.80±10.47 219.50±22.28a 210.60±19.60a 41.13 0.001 126.67±15.86 232.86±14.33a 233.67±19.15a 19.16 0.001 GGT 33(25，44.5)102(75，219)a 79(62.5，140)a 9.62 0.008 41(29，52)148(119，260)a 146(107，314.5)a 9.38 0.009

2.5 甜菜堿在DEN致大鼠肝癌過程中對肝臟脂質過氧化及抗氧化功能的影響由表3可知，第8周，DEN組MDA含量、GST酶活性、及T-AOC水平均高于正常組，而DEN+1%Bet組MDA含量低于DEN組，差異均有統計學意義(P＜0.05)。第15周，各組間各指標比較差異無統計學意義(P＞0.05)。

表3 各組大鼠肝勻漿脂質過氧化及抗氧化指標[±s，M(P25，P75)]

表3 各組大鼠肝勻漿脂質過氧化及抗氧化指標[±s，M(P25，P75)]

注：與正常組比較，aP＜0.05；與DEN組比較，bP＜0.05。

時間8周15周組別正常組DEN組DEN+1%Bet組F/H值P值正常組DEN組DEN+1%Bet組F/H值P值例數5 5 5 7 9 8 MDA含量(nmol/mg·prot)0.166±0.055 0.357±0.152a 0.145±0.068b 20.18 0.001 0.236±0.088 0.299±0.087 0.222±0.032 2.799 0.101 SOD酶活性(U/mg·prot)163.3(152.2，191.4)166.5(134.1，195.1)188.6(155.3，227.6)1.22 0.543 155.6(141.4，200.1)151.4(128.9，171.5)155.3(138.7，188.2)0.980 0.613 GST酶活性(U/mg·prot)27.37±2.63 38.62±2.55a 31.36±3.10 8.16 0.006 27.79±6.73 29.29±4.23 26.41±3.46 0.152 0.861 T-AOC(U/mg·prot)0.293(0.208，0.319)0.585(0.481，0.749)a 0.505(0.383，0.655)8.85 0.012 0.301(0.185，0.581)0.992(0.601，1.183)0.405(0.298，0.909)5.325 0.07

3 討論

DEN是一種對動物有較強致癌作用的化學物，在自然界中廣泛存在，在機體內代謝時發揮其致癌作用。經口攝入DEN可導致嚴重的肝損傷，并最終形成肝癌，與人類肝癌有相似的發病軌跡[5]。本研究以0.01% DEN通過長期飲水法誘發大鼠肝臟癌變。第15周實驗結束時，經病理檢查證實模型組全部出現肝癌，說明造模成功。肝癌形成之后，肝結節的破裂易導致大鼠死亡，第15周DEN+1% Bet組死亡1只大鼠。DEN在誘導大鼠肝癌形成過程中，肝細胞遭到嚴重破壞，導致DEN組血清ALT、AST、ALP、GGT均顯著升高，這與以往的研究結果相一致[6]。

甜菜堿是甘氨酸的三甲基衍生物，主要通過食物攝入，對肝臟具有一定的保護作用，可減弱酒精、脂多糖、四氯化碳等所導致的肝臟毒性[2]。越來越多證據表明，甜菜堿可能對癌癥有保護作用，甜菜堿的攝入可降低癌癥發病率，但需要進一步的研究來驗證這一結果[7]。本研究結果顯示，DEN+1%Bet組大鼠第8周AST低于DEN組，第15周ALT、AST均低于DEN組，這提示1%甜菜堿對DEN引起的肝臟損傷起到一定的保護作用。

有證據表明，甜菜堿在多種疾病中具有抗炎作用，可改善含硫氨基酸的代謝來應對機體的脂質過氧化[7]。機體正常代謝過程中能夠維持體內脂質過氧化和抗氧化系統的動態平衡，當機體處于病理狀態時，平衡被破壞，過多的自由基堆積并奪取細胞膜不飽和脂肪酸側鏈上的氫原子而啟動脂質過氧化鏈式反應，產生過多的MDA等醛類代謝產物而損傷細胞結構，引起蛋白質交聯變性、DNA損傷而促進腫瘤的形成[8]。研究發現，甜菜堿可減少MDA等脂質過氧化物，并提高SOD、GST等抗氧化產物濃度，以減少DEN對肝臟的損傷[3-4]。本研究的第8周，DEN+1%Bet組MDA含量低于DEN組，提示1%甜菜堿可減少體內脂質過氧化產物以減輕DEN對肝臟所致的損傷，在DEN誘發大鼠肝癌的過程中起到保護肝臟的作用。

GST是一類與解毒功能有關的酶，當機體受到DEN等化學致癌物的影響時，GST酶活性代償性增高，以此來代謝化學致癌物。肝臟癌前病變時肝細胞膜的通透性增加，GST釋放到肝細胞外，導致肝勻漿中GST濃度增多、酶活性升高[9]。第8周的實驗結果提示在一定程度上，肝勻漿中GST酶活性升高情況與肝臟損傷狀況有關。T-AOC測定組織中各種抗氧化物質和抗氧化酶等構成的總抗氧化水平，在本研究中，可反映肝臟的總抗氧化能力，第8周，DEN組T-AOC水平高于正常組，這提示在DEN誘導肝癌早期，肝臟在受損過程中，增強了代償能力，以減少有毒物質對肝臟的影響。SOD是機體清除自由基，降低脂質過氧化反應的主要酶系，但在本研究中，各組間SOD的比較均無統計學意義，還需進一步探明原因。

第15周，各組間MDA、SOD、GST和T-AOC比較差異無統計學意義，這提示脂質過氧化與抗氧化系統失衡在肝癌發生早期起重要作用，但隨著癌變程度的加重，DEN破壞了肝臟的抗氧化系統，也損傷了肝臟的代謝能力，甜菜堿不能在肝臟充分代謝以發揮其抗脂質過氧化作用，這可能是第15周甜菜堿不能改善肝臟抗氧化能力的原因，具體機制還有待于更深入的研究。

本研究通過成功運用DEN誘發大鼠肝癌模型，重點從甜菜堿的抗氧化功能探討了其在大鼠肝癌發生過程中的作用及機制。結果表明，在肝癌發生早期，1%甜菜堿具有抗脂質過氧化的作用，能夠減弱DEN對大鼠肝臟的損傷，在DEN致大鼠肝癌過程中起到一定的保護作用。但由于試劑盒檢測過程中，影響因素太多，靈敏性較差，還需要采用更靈敏的檢測手段進一步驗證。此外，甜菜堿作為高效的甲基供體，在調節基因甲基化過程中發揮重要作用，因此，我們擬檢測甜菜堿在預防肝癌發生過程中對基因甲基化的作用，進一步探討其作用機制。