飛龍掌血通過調控大鼠M1/M2型小膠質細胞極化減輕腦缺血再灌注損傷*

高建紅，王 剛，楊 丹，趙方毓，何一多，陳顯兵

（風濕性疾病發生與干預湖北省重點實驗室，湖北省腎臟病臨床醫學研究中心，湖北民族大學醫學部，湖北 恩施 445000）

缺血性腦卒中是一種急性腦血管疾病，其特征是大腦局部血流突然中斷。現階段，治療缺血性腦卒中的方法主要包括溶栓和血栓清除，但治療窗口較狹窄，腦血液循環的恢復會進一步導致腦缺血再灌注損傷（cerebral ischemia-reperfusion injury，CIRI），加重神經功能的缺損［1-3］。小膠質細胞（microglia）是腦內巨噬細胞類型之一，是免疫系統的第一道防線，維持腦神經細胞的內環境穩態。機體損傷后，小膠質細胞被激活，M1 型小膠質細胞釋放炎癥因子，介導神經炎癥的發生；而M2型小膠質細胞釋放抑炎因子，減輕炎癥反應。通過抑制M1型小膠質細胞和促進M2型小膠質細胞的極化，可以減輕炎癥［4-5］。因此調控M1/M2型小膠質細胞的極化平衡對于減輕CIRI具有重要意義。

飛龍掌血（Toddaliaasiatica，TA）又名三百棒，為蕓香科植物的根，是一種天然藥物，也是具有地區的民族特色藥。現代藥理表明，TA 具有重要的拮抗炎癥作用［6-7］。但是，TA 能否通過調控M1/M2型極化來減輕炎癥反應，尚未得到系統的研究。因此，本研究通過制備大鼠CIRI模型，探究TA對小膠質細胞中M1/M2 表型極化的影響，深入探討Toll 樣受體介導的神經炎癥，以期為TA 減輕CIRI 的作用機理提供依據。

材 料 和 方 法

1 實驗動物

80 只2 月齡（體重約200～250 g）的SPF 級雄性SD 大鼠，飼養于清潔級動物房，保持相對濕度在55%、溫度在24 ℃，由遼寧省實驗動物中心提供，合格證號為SCXK（遼）2020-0001。

2 主要試劑與儀器

主要試劑：尼氏染色液、SDS-PAGE 快速配制試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司；免疫組化試劑盒購自福州邁新生物技術開發有限公司；TUNEL 細胞凋亡試劑盒購自武漢伊萊瑞特生物技術有限公司；Toll 樣受體4（Toll-like receptor 4，TLR4）抗體、髓樣分化因子88（myeloid differentiation factor 88，MyD88）抗體、核因子κB（nuclear factor-κB，NFκB） p65 抗體、p-NF-κB p65 抗體、NF-κB 抑制因子（NF-κB inhibitory factor，IκB）抗體、p-IκB 抗體、離子鈣結合銜接分子1（ionized calcium-binding adapter molecule 1，Iba1）抗體、精氨酸酶1（arginase 1，Arg1）抗體和白細胞介素6（interleukin-6，IL-6）抗體購自上海Abmart 醫藥科技有限公司；IL-4 和IL-10 抗體購自武漢愛博泰克生物科技有限公司；β-actin 抗體購自武漢三鷹生物技術有限公司。

主要儀器：Tanon-5200 全自動化學發光成像系統購自上海天能科技有限公司、Western blot 電泳裝置購自Bio-Rad。

3 主要方法

3.1 藥物配制 TA 購自湖北民族大學附屬民大醫院中藥房，經中藥實驗室專家鑒定為蕓香科植物TA的干燥根莖。取飛龍掌血適量，打粉，70%乙醇超聲提取，旋轉蒸發儀濃縮藥液并真空干燥，得TA 醇提物，稱重計算收得率為15%，使用時配制成所需濃度。據記載TA 生藥成人內服的劑量為：9～15 g/d，取劑量12 g/d。根據實驗動物與人體體表面積比例進行計量換算，最終換算為TA 1.08 g·kg-1·d-1。鹽酸多奈哌齊片的成人用量為5 mg/d，換算得大鼠劑量為0.45 mg·kg-1·d-1。

3.2 動物分組及造模 基于課題組前期研究［8］造模組選用線栓法行大腦中動脈栓塞術制備CIRI大鼠模型。具體操作：手術前所有大鼠禁食不禁水，麻醉，頸部備皮、消毒，逐層分離左側皮膚、皮下組織、頸總動脈、頸外動脈和頸內動脈，結扎翼腭動脈。將魚線栓（長為5 cm、直徑為0.4 mm）插入頸總動脈，后經頸內動脈到達大腦中動脈前端。從頸內動脈、頸外動脈Y 型交叉口計算，保證插入18.5 mm。2 h后將線栓拔出，線栓頭部到頸內動脈為宜。行為學評分1～3 分表明大鼠造模成功，隨機分為模型（model）組、飛龍掌血（TA）組和鹽酸多奈哌齊（donepezil，DON）組，并增設假手術（sham）組（僅分離血管），每組16 只。再灌注24 h 后，各組予以對應藥物灌胃，分為兩個時間段取材：（1）給藥7 d，每組6 只大鼠，3只用于病理學觀察，3只用于免疫組化檢測；（2）給藥14 d，每組10 只大鼠，3 只用于病理學觀察，3 只用于免疫組化檢測，4只用于蛋白含量測定。

3.3 動物一般情況觀察 術后觀察各組大鼠的基本情況。

3.4 大鼠神經功能評分 造模后，對1、3、7 和14 d的大鼠進行神經功能缺損評分。

3.5 HE、Nissl 和TUNEL 染色 分別給藥7 和14 d后，各組隨機取3 只大鼠。麻醉，依次進行生理鹽水灌注、多聚甲醛灌注，取材后腦組織進行多聚甲醛24 h固定、脫水、石蠟包埋、4 μm 切片，分別進行HE、Nissl和TUNEL染色。

3.6 免疫組織化學法檢測Iba1、Arg1 和TLR4 陽性細胞表達情況 分別給藥7、14 d 后，各組隨機取3只大鼠。麻醉，依次進行生理鹽水灌注、多聚甲醛灌注，取材后腦組織進行多聚甲醛24 h 固定、脫水、包埋、4 μm 切片，烤片過夜，二甲苯、無水乙醇梯度脫蠟、水化。檸檬酸抗原修復20 min，PBS 清洗3 min、3次。根據試劑盒說明書，滴加試劑1 和試劑2，滴加I抗Iba1抗體、Arg1抗體、TLR4抗體（比例均為1∶300）靜置1.5 h，PBS 清洗3 min、3 次，然后滴加試劑3 靜置15 min，PBS 清洗3 min 3 次，滴加試劑4 靜置20 min，滴加DAB 顯色液避光靜置3 min，純水洗滌后蘇木精復染1 min，純水洗滌1 min，醋酸15 s，純水洗滌1 min，碳酸鋰15 s，純水洗滌1 min，無水乙醇2 min，二甲苯透明化處理2 min，中性樹膠固定。

3.7 Western blot 檢測相關蛋白含量的表達 給藥14 d 后，每組取4 只大鼠。麻醉，取海馬置于-80 ℃冰箱備用；稱取20 mg組織放入EP管中，加入200 μL裂解混合液，裂解液與PMSF 比例100∶1，依次進行剪碎、研磨、超聲、裂解、離心、取上清液、配平每組蛋白，再依次配制凝膠、電泳、轉膜、封閉，隨后加入抗體TLR4、MyD88、p-NF-κB p65、IκB、p-IκB、IL-6、Arg1（比例均為1∶1 000），IL-4、IL-10、Iba1（比例均為1∶750），NF-κB p65（比例為1∶7 500），孵育Ⅰ抗過夜，孵育Ⅱ抗1 h，顯影并計算灰度值。

4 統計學處理

利用SPSS 26.0 軟件進行統計分析。正態性分布數據用均值±標準差（mean±SD）表示。組間均數比較采用單因素方差分析。以P＜0.05 為差異有統計學意義。

結 果

1 TA對CIRI大鼠一般情況的影響

術后大鼠左側眼瞼呈半張開狀態，眼瞼瘀血結痂，嚴重者左眼不睜，并伴有不同程度的肢體運動障礙，活動量減少，部分大鼠尾尖出現瘀血青紫甚至枯萎。

2 TA對CIRI大鼠神經功能評分影響

CIRI 術后1 d、3 d、 7 d 及14 d 的大鼠神經功能評分均較sham 組升高（P＜0.01）；與model組相比，給藥后3 d、7 d、14 d TA 組及DON 組評分顯著降低（P＜0.01），見圖1。

Figure 1. Comparison of neurological function scores of the rats in each group. Mean±SD. n=10. **P＜0.01 vs sham group； ##P＜0.01 vs model group.圖1 各組大鼠神經功能評分

3 TA對CIRI大鼠形態學影響

分別給藥7、14 d，與sham 組大鼠相比，model 組海馬CA1 區和皮質區神經元數量顯著減少，神經元和尼氏小體排列較松散紊亂，尼氏小體減少甚至溶解，細胞出現嚴重的核固縮、空泡化現象；與model組相比，TA 組及DON 組大鼠神經元增多，細胞排列的相對整齊緊密，空泡化及核固縮現象減輕，尼氏小體較多，見圖2、3。

Figure 2. Pathological changes of the brain tissue of rats in each group at 7 d after CIRI （HE and Nissl staining，scale bar=100 μm）.CA1： hippocampal CA1 region； CTX： cortex.圖2 各組大鼠術后7 d腦組織病理變化

Figure 3. Pathological changes of the brain tissue of rats in each group at 14 d after CIRI （HE and Nissl staining，scale bar=100 μm）. CA1： hippocampal CA1 region； CTX： cortex.圖3 各組大鼠術后14 d腦組織病理變化

4 TA對CIRI大鼠神經元凋亡的影響

給藥14 d，與sham 組大鼠相比，model 組的神經元凋亡增多（P＜0.01）；與model 組相比，TA 組及DON組大鼠神經元凋亡降低（P＜0.05），見圖4。

Figure 4. Neuronal apoptosis in rats of each group （TUNEL staining，scale bar=100 μm）. Mean±SD. n=3. **P＜0.01 vs sham group；#P＜0.05 vs model group.圖4 各組大鼠神經元凋亡情況

5 TA 對CIRI大鼠Iba1、Arg1和TLR4陽性表達的影響

5.1 TA 對M1 型小膠質細胞標志物Iba1 和M2 型小膠質細胞標志物Arg1 的影響 給藥7、14 d，與sham組相比，model組大鼠Iba1陽性細胞在皮質區表達較為顯著，胞體明顯增大，突起回縮，呈現出阿米巴樣；Arg1 陽性表達細胞數量增加。與model 組相比，TA組及DON 組大鼠Iba1 表達減少，胞體較小，突起較長；Arg1陽性細胞表達有所增加，見圖5、6。

Figure 5. Localization and expression of Iba1 protein in the brain tissue of rats at 7 and 14 d after CIRI in each group （scale bar=100 μm）. CA3： hippocampal CA3 region； CTX： cortex.圖5 各組大鼠7、14 d腦組織Iba1蛋白定位表達

Figure 6. Localization and expression of Arg1 protein in the brain tissue of rats at 7 and 14 d after CIRI in each group （scale bar=100 μm）. CTX： cortex.圖6 各組大鼠腦組織Arg1蛋白定位表達

5.2 TA 對TLR4/MyD88/NF-κB 通路中TLR4 的陽性表達的影響 給藥14 d，與sham 組相比，model 組大鼠TLR4 陽性細胞表達增加；與model 組相比，TA 組及DON組大鼠TLR4表達有所降低，見圖7。

Figure 7. Localization and expression of TLR4 protein in the brain tissue of rats at 14 d after CIRI in each group （scale bar=100 μm）. CTX： cortex.圖7 各組大鼠14 d腦組織TLR4蛋白定位表達

6 Western blot法測定結果

6.1 TA 對CIRI 大鼠Iba1、Arg1、IL-6、IL-4 和IL-10蛋白表達的影響 與sham 組相比，model 組大鼠海馬Iba1、IL-6 和Arg1 表達量升高（P＜0.01），IL-4 和IL-10 表達量降低（P＜0.05）；與model 組相比，TA 組和DON 組Iba1 和IL-6 表達顯著降低（P＜0.01），Arg1、IL-4和IL-10蛋白表達升高（P＜0.05），見圖8。

Figure 8. Protein expression in hippocampal tissue of rats in each group. Mean±SD. n=4. *P＜0.05，**P＜0.01 vs sham group； #P＜0.05，##P＜0.01 vs model group.圖8 各組大鼠海馬組織相關蛋白的表達

6.2 TA 對CIRI 大鼠TLR4/MyD88/NF-κB 通路相關蛋白表達的影響 與sham 組相比，model 組大鼠海馬的TLR4、MyD88、NF-κB p65、p-NF-κB p65和p-IκB表達量增多（P＜0.05）；與model 組相比，TA 組和DON組各指標表達量降低（P＜0.05），見圖9。

Figure 9. The levels of TLR4/MyD88/NF-κB pathway-related proteins in the hippocampal tissue of rats in each group. Mean±SD. n=4. *P＜0.05，**P＜0.01 vs sham group； #P＜0.05，##P＜0.01 vs model group.圖9 各組大鼠海馬組織TLR4/MyD88/NF-κB通路相關蛋白的表達

討 論

小膠質細胞是中樞神經系統重要的免疫細胞，通常處于靜態。小膠質細胞具有三個基本功能，參與并不斷監測內環境變化，促進神經元的修復，以及必要的防御功能，從而為神經提供保護作用［9］。當有神經元損傷或其他損傷時，小膠質細胞將被激活，激活的小膠質細胞會成為一把雙刃劍，具有鮮明表型變化的神經損害型M1 和神經保護型M2。M1 型將損害周圍的健康神經組織，并且通過死亡或正在死亡的神經元反過來加劇M1型小膠質細胞的活化，引起神經元的漸進性喪失［10-11］。而M2型可以減少局部組織的損傷，并促進損傷區域的修復和再生。因此，促進M1型小膠質細胞到M2型的極化形式，已然成為一種新的治療策略。研究表明調控小膠質細胞極化對于減輕腦缺血后神經元凋亡，促進神經發育和功能恢復至關重要［12］。本研究中CIRI大鼠細胞凋亡數量增多，神經功能評分降低，病理損傷嚴重，TA可有效緩解這一狀態，說明TA 有明確的保護腦神經功能作用，具有抗凋亡功能。

為明確TA 對M1/M2型小膠質細胞極化的影響，我們進行了相關指標的檢測。機體損傷后，M1 型小膠質細胞被激活，胞體變大，出現不規則突起，呈阿米巴狀，并且釋放TNF-α、IL-6等促炎細胞因子，參與神經炎癥的發生發展，導致病情加重。Iba1 作為小膠質細胞的特異性標志物，可判斷小膠質細胞的激活情況［13-15］。小膠質細胞的另一種狀態M2 型，以Arg1 為標志物，產生IL-4 和IL-10 等抑炎因子，可促進組織的修復及再生，具有神經保護作用［16-17］。本研究中，CIRI 大鼠M1 型小膠質細胞被激活，炎癥因子IL-6 表達升高，抑炎因子IL-4 和IL-10 表達降低；TA降低了炎癥因子分泌，促進了抑炎因子釋放，同時，抑制了M1型小膠質細胞，激活了M2型小膠質細胞。這提示TA對CIRI炎癥損傷具有一定的治療作用，可能是通過抑制促炎M1型，促進抗炎M2型極化，從而發揮抗炎作用。

在中樞神經系統中，Toll樣受體是一類模式識別受體的重要成員，小膠質細胞是中樞神經系統中Toll樣受體表達最豐富的細胞類型，其中TLR4具有特異性識別病原體分子的作用。TLR4 的激活可以通過MyD88 依賴和非依賴途徑，磷酸化并降解IκB 蛋白，繼而激活NF-κB 通路，增加炎癥因子的表達，引起炎癥反應，導致細胞凋亡［15，18-19］。有研究表明，降低小膠質細胞中TLR4 和MyD88 的表達可以有效抑制NF-κB 的激活，減輕炎癥反應，并減少神經功能損傷［18］。本研究指標中，CIRI 大鼠TLR4、MyD88、NFκB p65、p-NF-κB p65 等蛋白含量顯著升高，TA 顯著降低了各項指標的表達。這提示TA 可能通過抑制TLR4/MyD88/NF-κB通路發揮抗炎作用。

綜上所述，TA 對腦缺血再灌注大鼠具有神經保護作用，減少神經元的凋亡，降低炎癥因子IL-6 的分泌，增強抑炎因子IL-4、IL-10 釋放，其機制可能與調控M1/M2 型小膠質細胞、抑制TLR4/MyD88/NF-κB介導的炎性通路有關。