紫云英苷誘導(dǎo)炎性痛小鼠前扣帶回皮質(zhì)星形膠質(zhì)細(xì)胞自噬*

林佳泓，王姝涵，張潤恒，楊翠珠，楊雅琪，周 暢，唐 佩，劉 靖，馬宇昕

（廣東藥科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院人體解剖與組織胚胎學(xué)系，廣東 廣州 510006）

炎癥性疼痛是臨床中常見的慢性疼痛類型，主要是由創(chuàng)傷、細(xì)菌或病毒感染及外科手術(shù)引起組織損傷所導(dǎo)致［1］。當(dāng)組織發(fā)生炎癥時(shí)，炎癥介質(zhì)和細(xì)胞因子的釋放會(huì)刺激痛覺神經(jīng)末梢，將疼痛信號(hào)通過背根神經(jīng)傳入腦干和大腦皮層［2］。前扣帶回皮質(zhì)（anterior cingulate cortex）作為大腦皮層的一部分，是胼胝體吻部周圍高度連接的皮質(zhì)區(qū)域［3］，參與疼痛以及痛情緒信息的傳導(dǎo)與調(diào)控，對痛覺處理至關(guān)重要［4］。

神經(jīng)炎癥激活是中樞敏化的一個(gè)重要特征，包括炎性介質(zhì)產(chǎn)生增多和膠質(zhì)細(xì)胞的活化［5］。活化的星形膠質(zhì)細(xì)胞可以調(diào)節(jié)神經(jīng)營養(yǎng)因子，炎性介質(zhì)，趨化因子和神經(jīng)遞質(zhì)的釋放，介導(dǎo)疼痛的發(fā)生［6］。研究表明，自噬可通過調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)、抑制膠質(zhì)細(xì)胞活化和調(diào)節(jié)細(xì)胞代謝等方式，從而對炎癥性疼痛的產(chǎn)生和發(fā)展起調(diào)控作用［7-8］。因此，通過藥物治療增強(qiáng)自噬，抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞活化可能是疼痛治療的有效措施。

紫云英苷（astragalin，AST），化學(xué)名為3，5，7，4'-四羥基黃酮-3-葡萄糖（kaempferol-3-O-β-D-glucoside），是多種傳統(tǒng)中藥的生物活性成分，具有抗炎、抗腫瘤、抗氧化、神經(jīng)保護(hù)等藥理特性，并具有修復(fù)受損DNA、營養(yǎng)心肌等作用［9］。

已有研究證實(shí)，AST 可下調(diào)P2X4 受體并抑制膠質(zhì)細(xì)胞活化，進(jìn)而緩解小鼠神經(jīng)病理性疼痛［10］，但對炎癥性疼痛的影響及作用機(jī)制仍不清楚。因此，我們通過向小鼠踝關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射完全弗氏佐劑（complete Freund's adjuvant，CFA）構(gòu)建經(jīng)典的炎癥性疼痛動(dòng)物模型，借以觀察AST 對CFA 小鼠前扣帶回皮質(zhì)自噬相關(guān)因子表達(dá)及對星形膠質(zhì)細(xì)胞活化的影響，為進(jìn)一步探討AST 對炎癥性疼痛的作用機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

材 料 和 方 法

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF 級雄性C57BL/6 小鼠，6 月齡，20～23 g，共24 只，均購自廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào)為SCXK（粵）2021-0059。所有動(dòng)物均飼養(yǎng)于廣東藥科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF 級屏障環(huán)境：12 h光照循環(huán)，飲水進(jìn)食自由，室溫（22±2） ℃，相對濕度（55±5）%。本實(shí)驗(yàn)所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)操作經(jīng)廣東藥科大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（批準(zhǔn)使用號(hào)為：SPF2017591）。

1.2 主要試劑與儀器 紫云英苷（99.02%，wkq20032506）購于四川省維克奇生物科技有限公司；CFA 購于Sigma；GFAP 抗體（16825-1-AP）購于Proteintech；LC3 抗 體（ab51520）、p62 抗 體（ab91526）、beclin-1 抗體（ab217179）、ATG12 抗體（ab155589）、GAPDH 抗體（ab9485）、熒光兔Ⅱ抗（ab150077）、熒光小鼠Ⅱ抗（ab150116）和辣根過氧化物酶標(biāo)記的兔Ⅱ抗（ab205718）均購于Abcam。von Frey 纖維絲套件購于Aesthesio；化學(xué)發(fā)光成像與分析系統(tǒng)Tanon-5200 購于上海天能科技有限公司；光學(xué)顯微鏡及成像系統(tǒng)AX-10購于ZEISS。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 構(gòu)建炎癥性疼痛模型 根據(jù)參考文獻(xiàn)方法［11］，小鼠經(jīng)2%異氟烷麻醉，定位右側(cè)腓骨外踝窩位置，用22 號(hào)針頭插至脛腓骨與跗骨間的關(guān)節(jié)腔內(nèi)，當(dāng)有明顯突破感時(shí)，注入10 μL CFA 構(gòu)建炎癥性疼痛模型。生理鹽水（saline）組小鼠給予注射等量生理鹽水。

2.2 實(shí)驗(yàn)分組及給藥處理 將炎性痛模型小鼠隨機(jī)分為CFA 模型組及60 mg/kg AST 給藥組，并設(shè)置對照（control）組及saline組，每組各6只小鼠。

給藥處理：根據(jù)已有研究［12］及本研究預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選取60 mg/kg AST 作為給藥劑量，將AST 溶于10 ml/L DMSO溶液中制成60 mg/kg混懸液，給藥組小鼠按體重給予腹腔注射60 mg/kg AST。確定炎性痛模型小鼠構(gòu)建成功后進(jìn)行給藥，每日1 次，連續(xù)腹腔注射給藥21 d，于給藥結(jié)束后取材。

2.3 機(jī)械痛閾值測定實(shí)驗(yàn) 根據(jù)參考文獻(xiàn)方法［13］，安靜環(huán)境里，將小鼠置于透明正方體玻璃箱中，底為1 cm × 1 cm 孔徑的鐵絲網(wǎng)，適應(yīng)環(huán)境30 min 后，用von Frey 纖維觸絲垂直剌激小鼠右側(cè)后肢足底正中，持續(xù)時(shí)間≤6 s，小鼠出現(xiàn)舔足或者抬足等行為視為陽性反應(yīng)。每次測試重復(fù)3 次，計(jì)算平均值。于造模前后及AST給藥后1、3、5、7、14和21 d測定各組小鼠痛閾值。

2.4 免疫熒光多重染色 每組隨機(jī)選取3 只小鼠進(jìn)行免疫熒光染色。參考課題組前期實(shí)驗(yàn)方法［14］，采用50 ml/L 戊巴比妥鈉麻醉小鼠，斷頭取出大腦，置于多聚甲醛溶液固定48 h 后進(jìn)行流水沖洗，梯度脫水、包埋、切片。選取完整的組織蠟塊切片，常規(guī)脫水脫蠟后，將組織切片浸于0.1 mol/L 的檸檬酸鹽緩沖液中進(jìn)行抗原修復(fù)20 min，采用快速免疫封閉液37 ℃封閉20 min，去除封閉液后，分別滴加鼠抗GFAP（1∶500）和 兔抗LC3（1∶500）、兔抗p62（1∶200）、兔抗beclin-1（1∶200）、兔抗ATG12（1∶200），于4 ℃孵育過夜，復(fù)溫20 min后用PBST溶液沖洗，每次5 min，沖洗3次，于組織上滴加山羊抗小鼠熒光Ⅱ抗（1∶300）和山羊抗兔熒光Ⅱ抗（1∶300），置于37 ℃烘箱中孵育2 h。PBST 沖洗后用DAPI 染液進(jìn)行核染色，隨后滴加防熒光淬滅劑，封片，最后用光學(xué)顯微鏡進(jìn)行拍照并觀察。

2.5 Western blot 每組隨機(jī)選取3 只小鼠進(jìn)行Western blot 檢測。參考課題組前期實(shí)驗(yàn)方法［14］，采用50 ml/L 戊巴比妥鈉麻醉小鼠，斷頭取腦，于冰上快速分離大腦前扣帶回皮質(zhì)組織。根據(jù)組織質(zhì)量，按照100∶1 加入RIPA 和PMSF 進(jìn)行組織裂解，冰上研磨皮質(zhì)組織，4 ℃離心取上清液，BCA 蛋白定量試劑盒進(jìn)行各組蛋白濃度測定，制備蛋白樣品。隨后進(jìn)行電泳、轉(zhuǎn)膜、50 g/L 脫脂奶粉封閉2 h，封閉完成后分別孵育下述Ⅰ抗：兔抗LC3（1∶5 000）、兔抗p62（1∶3 000）、兔抗beclin-1（1∶3 000）、兔抗ATG12（1∶5 000），置于4 ℃孵育過夜。TBST清洗3次后再滴加山羊抗兔Ⅱ抗（1∶10 000）于搖床孵育2 h，TBST 沖洗。ECL 超敏發(fā)光液顯影，ImageJ 軟件進(jìn)行蛋白灰度值測定。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有數(shù)據(jù)均用GraphPad Prism 8.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean ±SD）表示，所有定量資料滿足正態(tài)分布，且通過方差齊性檢驗(yàn)后采用單因素方差分析（one way-ANOVA）。組間兩兩進(jìn)行比較采用Turkey 法進(jìn)行分析。P＜0.05 認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 紫云英苷緩解CFA小鼠的炎癥性疼痛

由機(jī)械痛閾值測定實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，各組小鼠基線疼痛閾值無顯著性差異（P＞0.05）。經(jīng)CFA注射后1 d，與control 組和saline 組相比，CFA 小鼠患側(cè)后爪機(jī)械痛閾值顯著降低（P＜0.01），證明炎性痛模型小鼠構(gòu)建成功。確定模型構(gòu)建成功后進(jìn)行AST 給藥，結(jié)果表明經(jīng)60 mg/kg AST 給藥處理后，CFA 小鼠機(jī)械痛閾值顯著增加（P＜0.05），見圖1。

Figure 1. Astragalin （AST） increased the ipsilateral hind paw withdrawal threshold （PWT） of complete Freund's adjuvant （CFA）-treated mice. Mean±SD. n=6. *P＜0.05，**P＜0.01 vs control group； #P＜0.05，##P＜0.01 vs CFA+60 mg/kg AST group.圖1 紫云英苷增加CFA小鼠患側(cè)后爪機(jī)械縮足閾值

2 紫云英苷對CFA 小鼠前扣帶回皮質(zhì)內(nèi)自噬相關(guān)因子表達(dá)及星形膠質(zhì)細(xì)胞活化的影響

由免疫熒光染色結(jié)果可知，與control 組和saline組相比，CFA 組小鼠前扣帶回皮質(zhì)內(nèi)LC3（P＜0.01）、ATG12（P＜0.01）和beclin-1（P＜0.05）的平均熒光強(qiáng)度顯著減弱，p62（P＜0.01）平均熒光強(qiáng)度顯著增強(qiáng)；而經(jīng)60 mg/kg AST 給藥處理后，CFA 小鼠前扣帶回皮質(zhì)內(nèi)LC3（P＜0.01）、ATG12（P＜0.01）和beclin-1（P＜0.05）的平均熒光強(qiáng)度顯著增強(qiáng)，p62（P＜0.05）平均熒光強(qiáng)度顯著減弱。

此外，與control 組和saline 組相比，CFA 組小鼠前扣帶回皮質(zhì)內(nèi)星形膠質(zhì)細(xì)胞活化明顯，平均熒光強(qiáng)度均顯著增強(qiáng)（P＜0.01），活化的星形膠質(zhì)細(xì)胞胞體變大，突起增粗。經(jīng)60 mg/kg AST 給藥處理后，CFA 小鼠前扣帶回皮質(zhì)內(nèi)星形膠質(zhì)細(xì)胞平均熒光強(qiáng)度均顯著減弱（P＜0.05），且胞體變小，突起較細(xì)，激活的星形膠質(zhì)細(xì)胞與自噬相關(guān)因子表達(dá)存在共定位，見圖2～5。

Figure 2. Multiple immunofluorescence staining was used to detect the effect of astragalin （AST） on mean fluorescence intensity of LC3 and GFAP in the anterior cingulate cortex of complete Freund's adjuvant （CFA）-treated mice（scale bar=100 or 20 μm）. Mean±SD. n=3. **P＜0.01 vs control group； ##P＜0.01 vs CFA group.圖2 免疫熒光染色檢測紫云英苷對CFA小鼠腦前扣帶回皮質(zhì)內(nèi)LC3與GFAP平均熒光強(qiáng)度的影響

Figure 3. Multiple immunofluorescence staining was used to detect the effect of astragalin （AST） on mean fluorescence intensity of p62 and GFAP in the anterior cingulate cortex of complete Freund's adjuvant （CFA）-treated mice （scale bar=100 or 20 μm）. Mean±SD. n=3. **P＜0.01 vs control group； #P＜0.05 vs CFA group.圖3 免疫熒光染色檢測紫云英苷對CFA小鼠腦前扣帶回皮質(zhì)內(nèi)p62與GFAP平均熒光強(qiáng)度的影響

3 紫云英苷激活CFA小鼠前扣帶回皮質(zhì)自噬

Western blot 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與control 組相比，CFA 組小鼠前扣帶回皮質(zhì)內(nèi)自噬相關(guān)蛋白LC3（P＜0.01）、ATG12（P＜0.01）和beclin-1（P＜0.01）表達(dá)水平顯著下降，p62（P＜0.05）表達(dá)水平顯著上升；與CFA 組相比，經(jīng)60 mg/kg AST 給藥處理后，CFA 小鼠前扣帶回皮質(zhì)內(nèi)自噬相關(guān)蛋白LC3（P＜0.01）、ATG12（P＜0.01）和beclin-1（P＜0.01）的表達(dá)量均顯著上升；而p62（P＜0.05）表達(dá)量顯著下降，且control組和saline組之間無顯著差異，見圖6。

Figure 6. Astragalin （AST） increased the protein expression levels of LC3，ATG12 and beclin-1，and decreased the protein expression of p62 in the anterior cingulate cortex of complete Freund's adjuvant （CFA）-treated mice. Mean±SD. n=3. *P＜0.05，**P＜0.01 vs control group； #P＜0.05，##P＜0.01 vs CFA group.圖6 紫云英苷上調(diào)CFA小鼠腦前扣帶回皮質(zhì)內(nèi)LC3、ATG12和beclin-1蛋白表達(dá)水平，下調(diào)p62蛋白表達(dá)水平

討 論

疼痛是影響人類健康的嚴(yán)重疾病之一，近年來眾多研究都在尋找有效且安全的藥物來改善炎癥性疼痛，但至今仍未有好的解決手段。因此，亟需研究治療炎癥性疼痛的新途徑［15］。

炎癥性疼痛的發(fā)病機(jī)制主要包括炎癥介質(zhì)釋放刺激周圍神經(jīng)和免疫細(xì)胞。因此，抑制炎癥介質(zhì)釋放可作為緩解疼痛的有效治療靶點(diǎn)［5，16］。AST 作為天然黃酮類化合物，具有抗炎、抗腫瘤、抗氧化等廣泛的藥理特性，且尚未顯示其存在細(xì)胞毒性。相關(guān)研究證實(shí)，AST 可抑制促炎細(xì)胞因子的表達(dá)，進(jìn)而減輕鉤端螺旋體感染引起的炎癥反應(yīng)［12］。

鉤吻素子通過激活星形膠質(zhì)細(xì)胞自噬，抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞活化及促炎因子（IL-1β 和TNF-α）釋放，進(jìn)而緩解大鼠慢性壓迫性損傷引起的神經(jīng)性疼痛［17］；3，5 DCQA 通過增強(qiáng)膠質(zhì)細(xì)胞自噬改善CFA 小鼠炎癥性疼痛［18］；AST能夠抑制NF-κB通路，降低IL-6、IL-8 和TNF-α 的產(chǎn)生，進(jìn)而改善小鼠結(jié)腸炎［19］。但AST 對炎癥性疼痛的作用及其機(jī)制仍不清晰，基于炎癥、自噬及星形膠質(zhì)細(xì)胞之間的密切關(guān)系，本研究選用CFA 構(gòu)建最經(jīng)典的炎性痛小鼠模型，旨在探討AST 能否促進(jìn)CFA 小鼠前扣帶回皮質(zhì)自噬，抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞的活化，進(jìn)而緩解CFA 小鼠炎癥性疼痛。

本研究通過機(jī)械痛閾值測定實(shí)驗(yàn)表明AST 可顯著上調(diào)CFA 小鼠痛閾值，緩解炎癥性疼痛。免疫熒光染色證實(shí)了AST 能夠促進(jìn)CFA 小鼠前扣帶回皮質(zhì)星形膠質(zhì)細(xì)胞自噬，并抑制其活化，且星形膠質(zhì)細(xì)胞與自噬相關(guān)因子表達(dá)存在共定位，表明AST 誘發(fā)的自噬相關(guān)機(jī)制與星形膠質(zhì)細(xì)胞有關(guān)。并通過Western blot法進(jìn)一步證明AST顯著降低CFA小鼠前扣帶回皮質(zhì)中p62 蛋白表達(dá)，上調(diào)LC3、ATG12、beclin-1蛋白表達(dá)。總之，AST 可緩解CFA 小鼠的炎癥性疼痛，其作用機(jī)制可能與AST 抑制CFA 小鼠前扣帶回皮質(zhì)星形膠質(zhì)細(xì)胞活化，并促進(jìn)其發(fā)生自噬有關(guān)。

自噬可通過調(diào)節(jié)星形膠質(zhì)細(xì)胞的活性和功能，影響疼痛的進(jìn)展過程，阻斷星形膠質(zhì)細(xì)胞活化可以有效預(yù)防或逆轉(zhuǎn)慢性疼痛［20］。因此本研究通過AST 抑制CFA 小鼠前扣帶回皮質(zhì)星形膠質(zhì)細(xì)胞活化，并促進(jìn)其發(fā)生自噬的分子作用機(jī)制進(jìn)行初步探討，有望為AST 作為抗炎鎮(zhèn)痛藥物提供潛在的治療靶點(diǎn)，但具體的自噬相關(guān)作用機(jī)制仍待深入研究。