外源GA3和ABA對烤煙內源激素調控效應和常規化學成分的影響

李波，陳小翔，張文軍，翟爭光，劉化冰，江智敏，徐志強*，

(1.浙江中煙工業有限責任公司 技術開發分公司，浙江 杭州 310008；2.湖南省煙草公司 長沙市公司，湖南 長沙 410000)

赤霉素生物合成前體物質柯巴基焦磷酸和脫落酸生物合成前體物C40環氧類胡蘿卜素(epoxycarotenoid)均是由質體中甲基赤蘚醇-4-磷酸(methylerythritol-4-phosphate pathway，MEP)途徑合成的香葉基香葉基焦磷酸(geranylgeranyl-PP，GGPP)產生的。在赤霉素合成代謝途徑中GGPP在柯巴基焦磷酸合酶(ent-copalyl diphosphate synthase，CPS)、內-貝殼杉烯合成酶(ent-kaurene synthase，KS)催化作用下形成內-貝殼杉烯(ent-kaurene)；在內-貝殼杉烯氧化酶(ent-kaurene oxidase，KO)、內-貝殼杉烯酸氧化酶(ent-kaurenoic acid oxidase，KAO)氧化作用下轉化為GA12；之后通過GA20-氧化酶 (GA20-oxidase，GA20ox)、GA2-氧化酶 (GA2-oxidase，GA2ox)等合成具有生物活性的赤霉素[1-3]

GA3是赤霉素應用最為廣泛的一種，已有研究表明GA3能夠提高作物株高[4]，在多種農作物上的推廣應用已產生了巨大的經濟效益和社會效益[5-6]。煙草內源激素的水平是影響煙草生長發育的重要因素，噴施外源激素能誘導作物內源赤霉素、脫落酸變化，對植物激素信號轉導體系產生影響[7]，從而影響植物對礦質元素的吸收和碳氮的代謝，改變烤煙的生長和煙葉常規化學成分。王林等[8]探究外源激素對中部煙葉品質的影響發現，增施赤霉素及生長素均可改善烤后煙葉理化性質，且濃度越高效果越優。陳富彩[9]通過外源噴施 GA3和生長素(IAA)，發現無論單施還是配施都對烤煙上部葉碳氮代謝產生顯著影響，使其還原糖含量增加，煙堿含量降低。

脫落酸合成代謝途徑中，玉米黃素在玉米黃素環氧酶(zeathanxinepoxidase，ZEP)兩步環氧化作用催化下轉變成紫黃素(violaxanthin)，隨后紫黃素進一步轉化為兩種9-順式-環氧類胡蘿卜素(9-cis-epoxy carotenoid)，形式-9-順式新黃素(9-cis-neoxanthin)或9-順式-紫黃素(9-cis-violaxanthin)[10]。在9-順式-環氧類胡蘿卜素雙加氧酶(enzyme 9-cis-epoxy carotenoid dioxygenase，NCED)的作用下，形成黃氧素(xanthoxin)并從葉綠體(質體)運出到細胞質基質中，進一步形成脫落酸醛(ABA-aldehyde)和最終的脫落酸[11]。

有研究表明，脫落酸位于赤霉素生物合成途徑的上游，負調控赤霉素生物合成基因的表達，調節植物生長，脫落酸和赤霉素拮抗調控種子的萌發和休眠，赤霉素可以解除脫落酸對植株地上部生長的抑制[11-12]。秦華等[13]的實驗表明，高稈型的水稻品種中內源脫落酸含量低，矮稈型的水稻品種中脫落酸含量高，且水稻的株高和苗高與水稻內的脫落酸含量呈相反的線性關系。

赤霉素和脫落酸作為植物體內的重要植物激素，在植物的生長發育過程中發揮重要作用，赤霉素和脫落酸在生物合成的過程中存在相互作用[14]，有研究表明從種子休眠到萌發過程中，ABA和GA可能作為因果相互影響。精確控制合成ABA和GA含量變化的分子機制尚不清楚，但研究發現部分轉錄因子起到關鍵作用，如MYB96、ABI4、CHOTTO1等也參與調控了GA的合成。MYB96轉錄激活ABA 生物合成過程中的關鍵基因NCED2和NCED6，同時也抑制GA生物合成基因GA3ox1和GA20ox1的表達。

煙草內源激素的水平是影響煙草生長發育的重要因素，噴施外源激素能誘導作物內源赤霉素、生長素和脫落酸變化[15]，從而對植物激素信號轉導體系以及植物對礦質元素吸收和碳氮代謝產生影響，改變烤煙的生長和煙葉常規化學成分。在植物激素信號轉導體系中，DELLA蛋白一般被認為是GA3信號途徑中一類重要的負調節因子，但越來越多的研究認為其是調節多種激素發揮作用的生長抑制因子[16]。GAI基因是DELLA蛋白重要的控制基因之一，其表達量在植物生長發育過程中受到多種激素如生長素、赤霉素等激素共同調節。圍繞外源激素對煙草生長調控及品質影響，前人已開展了一些研究。如周繼華[17]在煙草外施一定濃度的GA3能使煙株莖尖內源激素GA與IAA含量提高，顯著促進煙草株高與節間距的增長。前人在煙草上對品質研究多于對株高調控研究，且株高研究中激素不同濃度梯度對煙草株高研究較少，而綜合研究外源激素對內源激素機理、烤煙生長發育和品質影響得更少。本試驗研究苗床期噴施赤霉素(GA3)和脫落酸(ABA)對烤煙品種中煙100和NC71在生長發育期間赤霉素和脫落酸含量的動態變化及相關生理特性變化和烤后煙葉產量和質量的影響，以期為噴施外源生長調節劑提高烤煙產量和品質提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料為烤煙品種中煙100和NC71，由河南農業大學煙草學院育種實驗室提供。試驗于2019年在許昌襄縣王洛鎮開展，試驗地土壤為褐土，選擇有代表性、前茬一致、土壤肥力均勻、地面平整、排灌方便、肥力中上等水平的生茬地塊。2019年3月1日播種，5月1日移栽，7月10日打頂，其他栽培措施按照當地優質煙葉生產技術規范執行。

5月1日移栽時對準煙草株心噴施赤霉素和脫落酸，噴施時間為17：30-18：30，噴施時液滴要細小、均勻，藥液用量以噴施部位濕潤為度，為了減少表面張力，在藥液中加入20 mL·L-1表面活性劑吐溫80，赤霉素濃度為100 mg·L-1，脫落酸的濃度為6 mg·L-1。

1.2 試驗設計

試驗共設置6個處理，分別為未經噴施赤霉素處理的中煙100(ZY100)、NC71(NC71)，經噴施赤霉素處理的中煙100(ZY100G)、NC71(NC71G)和噴施脫落酸處理的中煙100(ZY100A)、NC71(NC71A)。

1.3 測定項目及方法

1.3.1 內源激素分析測定

于噴施后0、10、20、30、40、50、60、70 d采集各處理中部葉0.5 g 新鮮煙草樣品，用液氮速凍后，存放于-80 ℃冰箱中保存，采用間接酶聯免疫吸附法 (ELISA)(酶免疫試劑盒由中國農業大學化控中心提供)對赤霉素、脫落酸進行測定。

1.3.2 農藝性狀測量

根據《煙草農藝性狀調查測量方法》 (YC/T 142-2010)進行煙草農藝性狀調查，于噴施后0、10、20、30、40、50、60、70 d測定并記錄株高，每個處理選擇有代表性的5株。

1.3.3 生理指標測定

葉綠素含量采用95%乙醇浸提比色法進行測定；可溶性蛋白含量采用考馬斯亮藍比色法進行測定；丙二醛含量使用索來寶試劑盒進行測定。

1.3.4 常規化學成分測定

根據《煙草及煙草制品 總植物堿的測定 連續流動法》 (YC/T 468-2021)、《煙草及煙草制品 水溶性糖的測定 連續流動法》 (YC/T 159-2019)、《煙草及煙草制品 鉀的測定 連續流動法》(YC/T 217-2007)和《煙草及煙草制品 氯的測定 連續流動法》(YC/T 162-2011)標準測定煙葉煙堿、總糖、鉀和氯含量。鉀氯比為鉀含量除以氯含量。

1.3.5 經濟性狀統計

根據《烤煙》(GB 2635-1992)對烤后煙葉分級，統計各處理產量，以2019年當地的煙葉收購價格計算產值，統計各處理各等級煙葉比例。

1.3.6 煙草葉片總RNA的提取

RNA提取：采用Plant RNA isolation Aid提取參試材料葉片總RNA，將提取的RNA加入適量DEPC水溶解，于-80 ℃保存。逆轉錄：利用HiScript Ⅱ Q RT SuperMix for qPCR(+gDNA wiper)(Vazyme，R223-01)將待測RNA逆轉錄成cDNA，逆轉錄完畢后加入90 μL Nuclease-free H2O儲存在-20 ℃冰箱備用。引物設計：引物采用Roche LCPDS2軟件設計(表1)，并由上海捷瑞生物工程有限公司合成。熒光定量PCR：利用ChamQ SYBR qPCR Master Mix試劑盒(Q311-03，Vazyme)在LightCycler? 480 Ⅱ型熒光定量PCR儀(Roche，Swiss)上進行反應。體系：2×ChamQ SYBR qPCR Master Mix，5 μL；10 μmol·L-1Forward primer，0.2 μL；10 μmol·L-1Reverse primer，0.2 μL；cDNA，1 μL；Nuclease-free H2O，3.6 μL。PCR程序：95 ℃ 30 s；95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，40個循環。循環結束后利用熔解曲線檢測產物特異性：從60 ℃緩慢升溫至97 ℃，每攝氏度采集5次熒光信號。依據CT值，計算相對表達量并作圖。

表1 熒光定量引物序列Table 1 Fluorescence quantitative primer sequences

1.4 數據處理

使用DPS 7.05軟件，采用Duncan新復極差法比較不同處理間各種指標之間的差異；使用Origin Pro 8.5進行相關數據統計分析。

2 結果與分析

2.1 不同外源GA3和ABA處理對烤煙株高的影響

如圖1所示，噴施赤霉素前10 d各處理間株高差異不顯著，20 d和30 d NC71株高顯著低于其他處理，40～70 d株高出現差異，其中ZY100G顯著高于其他處理，70 d時株高為113.24 cm，相比對照(ZY100)升高20%，NC71G相對于NC71升高31%，ZY100、NC71在70 d時株高分別為105.73、80.66 cm。在先噴赤霉素再噴脫落酸處理后，40～70 d ZY100A低于ZY100，NC71A低于NC71。說明噴施赤霉素后能顯著增加株高，且處理后的NC71株高與未處理的中煙100相近，而噴施脫落酸能夠抑制赤霉素對煙株株高的促進作用。

同時期不同處理柱上無相同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。圖2、4～6同。圖1 不同處理對烤煙株高的影響Fig.1 Effect of different treatments on the plant height of flue-cured tobacco

2.2 不同外源GA3和ABA處理對烤煙內源激素的影響

根據圖2中A可知，噴施赤霉素的NC71G、ZY100G較未噴施赤霉素的NC71、ZY100的內源赤霉素顯著增加，先噴赤霉素再噴脫落酸后NC71A、ZY100A較噴施赤霉素的NC71G、ZY100G內源赤霉素顯著減少。NC71G在處理20 d后內源赤霉素含量比NC71升高30%，表明苗期噴施赤霉素有助于增加植株內源赤霉素的含量，而噴施脫落酸會抑制植株內源赤霉素的含量，并且品種間對外源赤霉素的響應快慢存在差異。

圖2 不同處理對烤煙內源激素含量的影響Fig.2 Effect of different treatments on the content of endogenous hormones in flue-cured tobacco

根據圖2中B可知，6個處理脫落酸含量隨時間逐漸升高，前30 d差異不顯著，處理后40 d時ZY100A脫落酸含量高于ZY100G，60 d以后噴施赤霉素的NC71G、ZY100G較未噴施赤霉素的NC71、ZY100內源脫落酸顯著減少，表明苗期噴施赤霉素在還苗期、旺長期對脫落酸影響較小，在成熟期影響較大。并且噴施外源脫落酸后可以提高內源脫落酸的含量。

根據圖2中C可知，處理后10～50 d，噴施赤霉素的NC71G、ZY100G較未噴施赤霉素的NC71、ZY100赤霉素與脫落酸的比值均顯著增加，未噴施赤霉素的NC71、ZY100較噴施脫落酸的NC71A、ZY100A的赤霉素與脫落酸的比值均顯著增加。

2.3 不同外源GA3和ABA處理對內源激素相關基因表達的影響

根據圖3可知，噴施外源赤霉素后CPS、GA20ox和PSY的基因表達量均上調，GA2ox基因表達量下調。在ZY100中CPS和PSY的表達量與對照無顯著差異，GA20ox和GA2ox的基因表達量均與對照有顯著差異。在NC71中除PSY的基因表達量與對照無顯著差異外，其他基因在噴施赤霉素后均與對照有極顯著差異，在噴施脫落酸對各基因表達量的影響與噴施赤霉素處理呈現明顯的相反作用。

“*”和“**”分別表示同一基因不同處理在0.05和0.01水平差異顯著。圖3 不同處理對烤煙赤霉素和脫落酸相關基因表達量的影響Fig.3 Effect of different treatments on the expression of gibberellin and abscisic acid related genes in flue-cured tobacco

2.4 不同外源GA3和ABA處理對烤煙生理特性的影響

2.4.1 不同外源GA3和ABA處理對葉綠素含量的影響

如圖4所示，噴施后前10 d各處理間葉綠素含量差異不顯著，從30 d開始噴施赤霉素的處理葉綠素含量顯著高于同品種未噴施的處理。其中，NC71A葉綠素含量顯著低于其他處理，ZY100G顯著高于其他處理，說明噴施赤霉素后葉片葉綠素含量顯著增高，且處理后的NC71葉綠素含量與未處理的中煙100相近，噴施脫落酸會降低外源赤霉素對葉片葉綠素含量的影響。

圖4 不同處理對烤煙葉綠素含量的影響Fig.4 Effect of different treatments on chlorophyll content in flue-cured tobacco

2.4.2 不同外源GA3和ABA處理對丙二醛的影響

根據圖5可知，噴施后前10 d經噴施處理后同品種間丙二醛含量差異不顯著，20 d和30 d ZY100G丙二醛含量顯著低于其他處理，40 d開始噴施赤霉素處理的丙二醛含量顯著低于同品種未噴施處理，噴施脫落酸處理的丙二醛含量顯著高于對照，其中，ZY100G丙二醛含量顯著低于其他處理，NC71A顯著高于其他處理，說明噴施赤霉素后葉片丙二醛含量顯著降低，處理后的NC71丙二醛含量與未處理的中煙100相近，且噴施脫落酸后丙二醛的含量顯著升高。

圖5 不同處理對烤煙丙二醛含量的影響Fig.5 Effect of different treatments on the content of malondialdehyde in flue-cured tobacco

2.4.3 不同外源GA3和ABA處理對可溶性蛋白的影響

根據圖6可知，噴施后前20 d各處理間可溶性蛋白含量差異不顯著，噴施赤霉素后30 d和40 d的相同品種間可溶性蛋白含量差異不顯著，但含量高于未噴施處理，噴施脫落酸后各品種可溶性蛋白含量顯著降低，50 d開始噴施赤霉素處理的可溶性蛋白含量顯著高于同品種未噴施的處理。其中，NC71A可溶性蛋白含量顯著低于其他處理，ZY100G顯著高于其他處理，說明噴施赤霉素后葉片可溶性蛋白含量顯著提高，處理后的NC71可溶性蛋白含量與未處理的中煙100相近，噴施脫落酸后葉片中可溶性蛋白的含量顯著降低。

圖6 不同處理對烤煙可溶性蛋白含量的影響Fig.6 Effect of different treatments on the content of soluble protein in flue-cured tobacco

2.5 不同外源GA3和ABA處理對烤后煙葉常規化學成分的影響

根據表2可知，噴施外源赤霉素后中煙100和NC71的烤后煙葉總糖含量、鉀含量、鉀氯比均有所增加，其中噴施外源赤霉素后中煙100和NC71的總糖含量顯著增加，而煙堿含量和氯含量均顯著下降，噴施外源脫落酸與噴施外源赤霉素的結果截然相反。

表2 不同處理對烤后煙葉常規化學成分的影響Table 2 Effects of different treatments on the conventional chemical components of flue-cured tobacco leaves

2.6 不同外源GA3和ABA處理對經濟性狀的影響

根據表3可知，噴施外源赤霉素后烤煙各經濟性狀表現較好，各指標顯著上升，以ZY100G最優，其次是NC71G和ZY100，兩者各性狀差異不顯著，而噴施脫落酸后兩個品種的經濟性狀最差。

表3 不同處理對烤煙經濟性狀的影響Table 3 Effects of different treatments on economic characters of flue-cured tobacco

3 結論與討論

3.1 討論

試驗結果表明，在對株高的影響上，經過外源赤霉素處理的ZY100的株高顯著高于其他3個處理，經過外源脫落酸處理的NC71A的株高最低，未經處理的ZY100與經過外源赤霉素處理的NC71兩組的株高接近。NC71G的株高也顯著高于NC71，噴施脫落酸處理的NC71A、中煙100A株高均顯著低于對照。說明100 mg·L-1的外源赤霉素噴施可以增加煙株株高[18]，6 mg·L-1的外源脫落酸噴施可以降低煙株的株高，脫落酸與赤霉素之間存在明顯的拮抗作用。

在對葉綠素含量和可溶性蛋白含量的影響上，經過外源赤霉素處理的ZY100的葉綠素含量和可溶性蛋白含量最高，經過脫落酸處理的NC71A含量最低，未經處理的ZY100與經過外源赤霉素處理的NC71含量接近，經過外源赤霉素處理的NC71顯著高于未經外源赤霉素處理的NC71，說明100 mg·L-1的外源赤霉素與煙草葉片葉綠素和可溶性蛋白含量呈正相關[19]，對煙株的生長發育有著積極的作用，6 mg·L-1的外源脫落酸與葉片葉綠素和可溶性蛋白含量呈負相關，對煙株的生長發育存在抑制作用，與赤霉素相互拮抗。

在對丙二醛含量的影響上，經過外源赤霉素處理的ZY100的丙二醛含量最低，而經過脫落酸處理的NC71A的丙二醛含量最高，未經外源赤霉素處理的ZY100與經過外源赤霉素處理的NC71含量接近，經過外源赤霉素處理的NC71的丙二醛含量顯著高于未經處理的NC71。因為丙二醛反映的是細胞膜的損傷程度，其含量越高煙草葉片受損就越嚴重。根據試驗結果可知，100 mg·L-1的外源赤霉素可以有效降低煙草葉片丙二醛含量[20]，從而保證煙草葉片的發育，對煙草的生長發育有著積極的作用，且赤霉素和脫落酸之間存在明顯的拮抗作用。

在對內源赤霉素含量的影響上，經過100 mg·L-1的外源赤霉素處理的ZY100G與NC71G的內源赤霉素含量顯著高于未經過處理的ZY100與NC71，且ZY100G顯著高于其他處理組，NC71G在20 d后顯著高于NC71，而經脫落酸處理的NC71A、中煙100A的內源赤霉素含量最低，表明在苗床期噴施100 mg·L-1的外源赤霉素可以有效增加煙草葉片內源赤霉素的含量[21]，并且該含量的增加在不同的品種間存在差異，且噴施赤霉素和噴施脫落酸在影響植株株高以及內源化學物質方面存在明顯的拮抗作用[22]。

3.2 結論

赤霉素是植物幼苗發育常用的生長調節劑，調控植物生長發育整個過程，脫落酸是植物體內與赤霉素存在拮抗作用的植物激素。本研究通過對中煙100和NC71苗床期噴施100 mg·L-1外源赤霉素(GA3)和6 mg·L-1外源脫落酸(ABA)的研究中發現，噴施外源赤霉素可以改善煙草葉綠素、可溶性蛋白、丙二醛和內源赤霉素的含量，從而增強煙株的光合作用，加強其對營養物質的吸收和干物質的積累；提高細胞的保水能力，降低膜質的過氧化程度，減少細胞的受損程度，噴施外源脫落酸后抑制了內源赤霉素的含量，提高了內源脫落酸的含量，表明脫落酸和赤霉素在煙株生長發育和內源激素方面存在明顯的拮抗作用，同時噴施外源赤霉素使烤后煙葉化學成分更加協調從而提高煙葉品質，并且可以提高經濟產量。綜上所述，可在煙草種植苗期噴施適宜濃度的赤霉素來提高煙草的品質和產量，提高煙草農業綜合生產能力。