APP、PIP在兒童支氣管哮喘中的作用

李 明 劉華清 畢雅茹

支氣管哮喘是常發(fā)生在兒童身上的慢性呼吸道系統(tǒng)疾病，并且隨著目前空氣不斷惡化，發(fā)病率呈現(xiàn)逐年上升的趨勢[1]。由于支氣管哮喘發(fā)病原因復雜，影響因素較多，所以導致兒童支氣管哮喘的控制效果并不理想，治療效果反復，給患兒生活及學業(yè)帶來了諸多不便，嚴重影響了患兒家庭，給患者家庭及社會帶來了極大的負擔。哮喘臨床表現(xiàn)為氣道炎癥、氣道高反應性和吸入性抗原引起的可變氣流阻塞[2]。目前認為哮喘的發(fā)病機制與免疫、神經(jīng)、精神、內分泌因素、遺傳學背景和神經(jīng)信號通路密切相關。在哮喘中，一些由組織細胞產(chǎn)生的特定蛋白質可能被分泌到血液循環(huán)中。因此，蛋白質組學可能是一種有用的方法來檢測和定量這些血清蛋白，并確定他們是否在哮喘中有差異表達，并可能成為潛在的治療靶點[3]。

APP（淀粉樣前體蛋白）屬于I型跨膜糖蛋白，分子量在110～130 KD，分布于人體的心、腦、肺、腎等組織器官中；其構成包含一個大型的N端膜外（氨基端）結構域和較小的C 端胞尾區(qū)（胞內羧基端）；APP蛋白從N端到C端共分成三個區(qū)域（E1、E2、E3），這三個區(qū)域都是高度保守的區(qū)域；其中，E1 和E2 兩個區(qū)域為胞外結構部分，E3 區(qū)域為胞內結構部分；APP經(jīng)β、γ分泌酶依次剪切后產(chǎn)生可溶性 APPβ（sAPPβ）和CTF99，以及導致阿爾茲海默癥發(fā)病主要原因的β淀粉樣肽（Aβ）[4]；APP的糖化可以影響其在細胞內的轉運定位和成熟加工[5]。PIP（催乳素誘導蛋白）基因位于7 號染色體長臂3 區(qū)4 帶（7q34），編碼含146 個氨基酸殘基組成的前體蛋白，成熟產(chǎn)物為17KD的單鏈糖蛋白。本文選擇APP、PIP兩個蛋白組學進行分析，研究二者血清蛋白組學與兒童支氣管哮喘之間的關系，報告如下：

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2021年10月-2022年10月本醫(yī)院東區(qū)兒科收治的40 例哮喘患兒作為觀察組。①納入標準：年齡3～14 歲；確診依據(jù)《兒童支氣管哮喘診斷與防治指南》（2016年版）；均未診斷為免疫性疾病、慢性和其他影響血清蛋白的疾病；入組前3 個月內未服用相關益生菌制劑；且1 周內均未接受過激素治療。②排除標準：排除合并過敏性鼻炎、急性呼吸道感染、肺部疾病、異物以及其他慢性疾病者；未參與其他的臨床研究。嚴格按照納入及排除標準，對納入患兒及其家屬進行哮喘護理指導及健康培訓，告知其相關注意事項及研究過程中可能存在的風險，簽署知情同意書；觀察組共納入40 例患者進行隨機編號，其中男性20 例，女性20 例，年齡3～14 歲。對照組：選擇同期體檢正常的40 例兒童作為對照組，對兒童進行隨機編號，其中男20 例，女20 例，年齡3～14 歲。兩組兒童在性別構成、年齡分布等一般資料方面組間比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），具有可比性。本研究經(jīng)本院倫理委員會審核同意，研究對象入選后由其家屬代替簽署知情同意書。

1.2 標本采集及指標檢測 ①標本采集：患兒入院后第2 天上午，抽取靜脈血4 mL，置于室溫22 ℃～25 ℃黑暗1 h、上清液用移液管轉移至新管中，置于-80 ℃保存，采用ProteoExtract白蛋白/IgG去除試劑盒（Merck Co）提取血清樣本，各血清樣品總蛋白提取量均在400 μg以上，蛋白條帶清晰、完整、均勻。將蛋白溶液加入Bradford蛋白分析工作溶液。②指標檢測：檢測總蛋白量后，采用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）和考馬斯藍染色評價樣品質量。使用iTRAQ技術標記酶解后的肽段，蛋白定量后，將60 μg蛋白溶液置于離心管中，加入5 μL二硫蘇糖醇溶液，37 ℃靜置1 h，加入碘乙酰胺溶液20 μL，室溫避光1 h，離心，棄上清。用100 μL尿酸緩沖液（8 M尿素，100 mM Tris-HCl；pH值8.0）。用NH4HCO3（50 mM，100 μL）洗滌樣品三次，在超濾管中加入胰蛋白酶（蛋白與酶的比例為50：1）。樣品在37 ℃下酶解12～16 h。最后，用C18 標記并脫鹽利用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測關鍵蛋白葡萄糖-6-磷酸脫氫酶（G6PD）；顯微鏡直接計數(shù)嗜酸性粒細胞。

1.3 數(shù)據(jù)指標收集 ①肺功能測量工具：德國耶格小兒肺功能儀。測量指標：第一秒用力呼氣量（FEV1）、第一秒用力呼氣量/用力肺活量（FEV1/FVC）、用力呼氣中期流量（FEF）25%～75%、FEF 50%、FEF 75%；FEV1%是第一秒用力肺活量（FEV1）/用力肺活量（FEV）的比值。當FEV1%＜70%時即為降低，70%-60%-40%分別為輕、中、重度降低。正常狀態(tài)，F(xiàn)EV1%大于80%，低于80%表明氣道阻塞性通氣障礙的存在，如哮喘。PEF是指測量用力肺活量時，呼氣流量最快時的瞬間流速，主要反映呼吸肌的力量及氣道是否被阻塞。MMEF%是用力呼氣曲線中間一半的平均用力呼氣流量的測量值與預測值之比，正常為＞70%，主要對反映小氣道病變，具有較高的準確性及敏感性。測量頻次：每項指標測定3 次，計算平均值。注意事項：測量前詳細告知兒童及家長相關注意事宜，測量前行容量校準，4 歲以上1～3 L定量筒，3 歲以下為0.1 L定量筒。②嗜酸性粒細胞百分比：嗜酸性粒細胞百分比主要反映過敏性疾病中氣道炎癥發(fā)生、發(fā)展和黏膜損傷修復等方面具有重要的臨床意義，其數(shù)值越高，提示氣道高反應越明顯（正常值為0.4%～4%）。

1.4 APP、PIP相關蛋白表達 使用LC-MS/MS光譜系統(tǒng)鑒定了兩組之間的差異表達蛋白（DEPs）。標記樣品在40 μL 0.1%甲酸水溶液中重新溶解后，采用LC -MS/MS進行分析。流動相為A相（2%乙腈/0.1%甲酸/98%水）和B相（80%乙腈/0.08%甲酸/20%水）。柱與95%液相A液相平衡。從B開始的梯度調整如下：0～80 min，從0%線性增加到40%；80～80.1 min，增至95%；80.1～85 min，維持在95%；85～88 min，降至6%。分離樣品使用Q萃取HF-X質譜儀（Thermo Fisher Scientific）進行分析。使用Proteome Discover軟件，版本2.2.0.388，以FASTA格式搜索Uniport Human數(shù)據(jù)庫。

1.5 統(tǒng)計學方法 采用SigmaPlot軟件進行雙尾Mann-Whitney檢驗。分類變量（僅性別數(shù)據(jù)）比較采用Fisher精確檢驗卡方檢驗。計量資料使用（±s）表示，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。蛋白質折疊變化（FC）≥1.5，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。FC＞1.5 表示蛋白上調，F(xiàn)C＜0.667 表示蛋白下調；FC在0.667～1.5 表明兩組之間的蛋白表達沒有明顯變化。

2 結 果

2.1 兩組患兒肺功能指標比較 觀察組患兒的FEV1、FEV1/FVC、FEF 25%～75%、FEF 50%、FEF 75%等肺功能指標及含量均明顯低于對照組，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見表1。

表1 兩組患兒肺功能指標檢測結果比較（±s）

表1 兩組患兒肺功能指標檢測結果比較（±s）

組別nFEV1(L)FEV1/FVCFEF 25%～75%FEF 75%FEF 50%對照組4090.43±6.3779.17±13.2574.53±13.2771.46±13.4273.64±13.46觀察組4086.15±5.2560.37±11.4652.57±14.3741.38±14.2517.32±10.37 t 3.3036.8357.1419.77512.09 P 0.001＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001

2.2 兩組患兒G-6-PD和嗜酸性粒細胞各組檢測結果比較 觀察組患兒G-6-PD均低于對照組，而嗜酸性粒細胞數(shù)均高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見表2。組別n 嗜酸性粒細胞(106/L) G-6-PD(u/g Hb)

表2 兩組患兒嗜酸性粒細胞數(shù)及G-6-PD數(shù)據(jù)比較

2.3 APP、PIP的相關性分析 APP、PIP的表達與觀察組患兒的FEV1、FEV1/FVC、FEF 25%～75%、FEF 50%、FEF 75%及G-6-PD呈負相關（P＜0.05），與嗜酸性細胞數(shù)呈正相關，故二者在有或沒有哮喘的兒童血清中蛋白表達水平有顯著差異，見表3。

表3 APP、PIP的相關性分析

3 討 論

支氣管哮喘是由多種原因相互作用引起的慢性氣道炎癥。呼吸道慢性炎癥初始可引起呼吸道功能改變，由于炎性的慢性刺激可引起呼吸道結構性改變?yōu)闅獾乐厮躘6]。哮喘的炎性涉及多種活化細胞，這些細胞釋放促炎癥細胞因子介質升高，炎癥效應引起不可逆的氣道結構及功能上改變，其結構性特征是氣道壁增厚、平滑肌細胞增生肥大等，引起氣道高反應性及氣道阻塞，從而出現(xiàn)呼吸困難、喘息、胸悶等癥狀[7]。而新的哮喘管理范式，即通過使用“生物標志物”對哮喘患者進行分類，并開出靶向治療處方，將取代“一刀切”的哮喘管理方法[8]。

在哮喘發(fā)病過程中，炎性細胞在氣道組織中的浸潤、聚集、激活和釋放是其主要特征，在氣道重塑的過程中這些細胞因子發(fā)揮重要作用[9]，在本研究中，觀察組患兒APP、PIP的表達與其FEV1、FEV1/FVC、FEF 25%～75%、FEF 50%、FEF 75%及G-6-PD呈負相關（P＜0.05），與嗜酸性細胞數(shù)呈正相關。APP是一種廣泛表達的跨膜蛋白，在神經(jīng)元功能中起到不可或缺的作用，現(xiàn)已被證明可以促進突觸形成、樹突狀發(fā)芽和神經(jīng)元遷移等作用，而在最新研究表明該蛋白參與了哮喘表達的上調，另外還通過了以下途徑：神經(jīng)元生長、粘附、軸突生成、細胞遷移、蛋白運動調節(jié)、細胞凋亡、與細胞外基質成分結合。有些研究還表明APP參與了腫瘤細胞的過度生長，如乳腺癌、前列腺癌、鼻咽癌、肺癌等多種癌癥中具有顯著的功能[10]。APP通過β-分泌酶和γ-分泌酶參與的淀粉樣蛋白途徑水解后的主要產(chǎn)物，Aβ40 及Aβ42 是一種致病性淀粉樣蛋白，是阿爾茨海默病老年斑的主要成分[11]。致病性淀粉樣蛋白在腦組織中的沉積是導致阿爾茨海默病的病理基礎。PIP是一種小的分泌糖蛋白，為單條多肽鏈。在唾液腺、汗腺和淚腺等腺體中表達，存在于體液中。PIP在乳腺腫瘤患者的預后中具有重要價值，PIP高表達的乳腺腫瘤患者五年生存率及十年生存率更高。PIP在干眼病中表達過強，與干眼病的嚴重程度相關[12]。該蛋白亦具有免疫調節(jié)功能，并在細胞介導的過繼免疫中發(fā)揮重要作用，PIP與來自幾個屬的細菌結合，表明該蛋白可能也參與先天免疫和保護宿主免受微生物感染[13]，該蛋白也參與了哮喘表達的上調，對自然免疫細胞有調節(jié)作用。PIP可以特異性降解纖維連接蛋白，幫助宿主抵抗感染，并在癌細胞的遷移、粘附和侵襲中發(fā)揮作用。

綜上所述，本研究顯示淀粉樣前體蛋白和泌乳素誘導蛋白在兒童哮喘中表達上調，與臨床相關指標及參數(shù)密切相關，表明了APP、PIP與哮喘患兒的疾病特異性密切相關。這些研究結果均提示APP、PIP可能成為兒童哮喘潛在的檢測標志物和新的治療靶點，但需進一步闡述APP、PIP在兒童哮喘產(chǎn)生發(fā)展的確切分子機制。