藍莓葉提取物對2型糖尿病小鼠糖脂代謝的調節

王怡婷, 蒲首丞, 劉芬芬, 趙雯靚, 徐麗珊,2

(1.浙江師范大學 生命科學學院,浙江 金華 321004;2.浙江師范大學 浙江省特色經濟植物生物技術研究重點實驗室,浙江 金華 321004)

糖尿病是一種以持續性的高血糖癥為典型病癥的內分泌疾病,由胰島素分泌水平下降和胰島素敏感度下降導致,可致使機體糖脂代謝紊亂[1].2型糖尿病(type 2 diabetic,T2D)為發病率最高的一種糖尿病類型,若血糖得不到嚴格的控制,機體氧化應激反應激活的炎癥反應將引發一系列的慢性并發癥,給患者生活質量帶來嚴重的影響[2].研究表明,糖尿病及其并發癥的發生與氧化應激導致的炎癥反應息息相關[3-4].目前,臨床口服降血糖藥物多種多樣,因我國多以淀粉類食物為主食,α-葡萄糖苷酶(α-glucosidase,AG)抑制劑可延緩小腸中的糖苷酶對碳水化合物的水解,從而可有效控制患者餐后血糖[5-6].阿卡波糖作為典型的α-葡萄糖苷酶抑制劑(α-glucosidase inhibitor,AGI)類降血糖藥物,因其作用強、起效快等優勢被我國廣泛使用,但同時也存在缺乏治療的整體協調性和長期服用可能產生胃腸不適等不良反應等缺點[7-9].近年來,隨著對植物來源降糖物質研究的不斷深入,發現AGI不僅具有來源廣泛、毒副作用小的優勢,同時兼具多成分、多途徑、多靶點、多環節的整體調節優勢,在糖尿病的預防及治療中受到了廣泛的重視[10].

藍莓是杜鵑花科(Ericaceae)越橘屬(Vacciniumspp.)植物,每年定期整形修剪植株將產生大量的藍莓葉,因對藍莓葉的相關研究較少,且仍未得到有效利用,只能將其廢棄處理[11].早在我國古代,越橘屬植物葉子可作藥茶,具有解毒、消炎之功效[12].研究顯示,藍莓葉富含多酚、黃酮、花青素等活性成分,且藍莓葉多酚的平均含量約為藍莓果實的30倍,有望將其應用于糖尿病、癌癥、病毒抵抗等治療[13-14].因此,本實驗室前期已對12個常見栽培藍莓品種4個季節葉子進行體外保健活性的比對分析,其中冬季‘杰兔’藍莓葉在AG抑制活性及抗氧化活性方面脫穎而出,有望深入動物模型進行抗糖尿病的相關研究[15].目前,有關藍莓葉活性成分分析及其體外生物活性方面報道較多,但對改善糖尿病方面卻鮮有研究.

本研究通過分析冬季‘杰兔’藍莓葉提取物(blueberry leaf extract,BLE)對高糖高脂飲食聯合鏈脲佐菌素(streptozotocin,STZ)法誘導的T2D小鼠的生化指標、組織病理變化,以期評估其對T2D小鼠胰島素抵抗、糖脂代謝的改善作用,并通過分析機體氧化應激水平的變化以初步探究改善機制,為藍莓葉未來應用于降糖產品的開發提供理論依據.

1 材料與方法

1.1 實驗材料與試劑

12月‘杰兔’藍莓葉采自浙江金華浙江師范大學藍莓基地,于80 ℃殺青5 min,50 ℃鼓風干燥至恒質量,粉碎后通過40目篩網過篩得藍莓葉粉末,以1/20的料液比(g/mL)加入去離子水,于70 ℃水浴鍋中熱水浸提1.5 h,趁熱抽濾,減壓旋蒸濃縮,真空干燥至恒質量,即得BLE,于-4 ℃冰箱中保存備用[15].

高糖高脂飼料和普通飼料均購于南京盛民科研動物養殖場;STZ購于美國Sigma公司,WXBD5718V;阿卡波糖購于德國Bayer公司,H20010716;血清胰島素(fasting insulin,FINS)水平、血脂水平、糖代謝水平、氧化應激水平、TUNEL細胞凋亡原位檢測試劑盒均購于南京建成生物工程研究所;其他化學試劑均購于國藥集團.

1.2 動物造模與分組干預

SPF級雄性ICR小鼠,體質量(20±2) g,購于浙江省醫學科學院,合格證號：SYXK(浙)2019—0011.動物操作符合浙江師范大學實驗動物福利倫理審查要求,受理編號：ZSDW2022012.將適應性飼養7 d的ICR小鼠根據體質量隨機分為正常組(n=10,飼以基礎飼料)和造模組(n=100,飼以高糖高脂飼料),飲食誘導28 d.禁食不禁水12 h后給予造模組小鼠STZ腹腔注射,注射劑量為125 mg·kg-1,注射次數為1次.STZ注射后的3 d和7 d,對造模組小鼠進行12 h禁食不禁水的處理,剪尾取血測定空腹血糖值(fasting blood glucose,FBG),若2次均≥11.1 mmol·L-1,則認定T2D小鼠模型建成可用于后續實驗,將其以每組10只,按FBG隨機分為5組：模型組、陽性組、BLE低劑量組(BLEL)、BLE中劑量組(BLEM)、BLE高劑量組(BLEH),分別按25 mL·kg-1·d-1去離子水、20 mg·kg-1·d-1阿卡波糖、200 mg·kg-1·d-1BLE、400 mg·kg-1·d-1BLE和800 mg·kg-1·d-1BLE灌胃干預35 d;正常組以25 mL·kg-1·d-1去離子水灌胃干預35 d.

1.3 血糖指標的測定

灌胃干預期間每隔7 d,禁食不禁水12 h后,對各實驗組小鼠進行剪尾取血測定其FBG.讓小鼠自由進食2 h,測定小鼠餐后2 h血糖值(2-hours postprandial blood glucose,2 h PG).根據療效評定標準中的總有效率標準,評價BLE對降低T2D小鼠2 h PG的療效,按文獻[16]計算總有效率.顯效率為實驗組2 h PG相對模型組下降30%及以上的小鼠占比;有效率為實驗組2 h PG相對模型組下降10%～29%的小鼠占比;無效率為實驗組2 h PG無變化或相對模型組下降10%以內的小鼠占比.

1.4 FINS與血脂指標的測定

末次灌胃干預后對各實驗組小鼠進行禁食不禁水12 h的處理,小鼠乙醚麻醉后眼眶靜脈叢采血.將采集的血液樣品靜置于4 ℃冰箱過夜分層,以1 500 r·min-1離心15 min取上層血清.根據試劑盒操作流程完成FINS、總膽固醇(total cholesterol,TC)、甘油三酯(triglyceride,TG)、高密度脂蛋白膽固醇(high-density lipoprotein cholesterol,HDL-C)和低密度脂蛋白膽固醇(low-density lipoprotein cholesterol,LDL-C)測定.根據FINS和FBG,按文獻[17]計算胰島素抵抗指數(homeostasis model assessment for insulin resistance,HOMA-IR).

1.5 肝臟糖代謝途徑相關指標的測定

將取血后的小鼠立即脊椎脫臼處死,置于冰袋上快速解剖取肝臟保存于-80 ℃超低溫冰箱中備用.按預實驗所得稀釋比例,于肝臟組織中加入0.9%生理鹽水.根據試劑盒操作流程,取組織勻漿上清液完成葡萄糖激酶(glucokinase,GCK)、葡萄糖-6-磷酸酶(glucose-6-phosphatase,G-6-Pase)和肝糖原測定.

1.6 胰臟、肝臟氧化應激途徑相關指標的測定

將取血后的小鼠立即脊椎脫臼處死,置于冰袋上快速解剖取胰臟保存于-80 ℃超低溫冰箱中備用.于儲存備用的胰臟和肝臟組織中,按預實驗所得稀釋比例加入0.9%生理鹽水制得勻漿.根據試劑盒操作流程,取組織勻漿上清液完成總超氧化物歧化酶(total superoxide dismutase,T-SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-PX)和丙二醛(malondialdehyde,MDA)測定.

1.7 胰臟、肝臟病理切片制作及觀察分析

將解剖取得的胰臟和肝臟迅速固定于4%的多聚甲醛中,制作石蠟切片,切片厚度為4 μm.常規蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin staining,H&E)染色,根據試劑盒操作流程完成TUNEL細胞凋亡原位檢測,顯微鏡觀察組織的病理學變化情況,使用Image-Pro Plus軟件分析計算細胞凋亡率.

1.8 數據處理

2 結果與分析

2.1 BLE對T2D小鼠FBG和2 h PG的影響

灌胃干預前,造模組小鼠血糖值分布集中,均極顯著高于正常組(P<0.01),表明T2D小鼠模型建立成功.干預35 d后,與模型組相比,BLE干預組小鼠血糖均極顯著下降(P<0.01),且隨劑量增大FBG下降程度增大,說明BLE能劑量依賴性地降低T2D小鼠的FBG水平(見圖1).

注：與模型組相比,*表示差異顯著(P<0.05),**表示差異極顯著(P<0.01);與正常組相比,#表示差異顯著(P<0.05),##表示差異極顯著(P<0.01);與陽性組相比,+表示差異顯著(P<0.05),++表示差異極顯著(P<0.01).下同

BLE干預前,與正常組相比,造模組小鼠的2 h PG均極顯著升高(P<0.01),說明T2D小鼠餐后血糖調節功能出現異常.干預28 d后,與模型組相比,BLE干預組小鼠血糖水平均極顯著下降(P<0.01),且隨劑量增大,2 h PG下降程度增大,說明BLE能劑量依賴性地降低T2D小鼠的2 h PG(見圖2).且BLEM組和BLEH組小鼠治療總有效率均達100%,與陽性組總有效率一致,說明BLE可有效降低T2D小鼠2 h PG(見表1).

圖2 BLE對T2D小鼠2 h PG的影響(n=10)

表1 BLE對T2D小鼠2 h PG的總有效率的影響(n=10) 單位：%

2.2 BLE對T2D小鼠FINS和HOMA-IR的影響

模型組小鼠的FINS含量與正常組相比顯著下降(P<0.05),結合FBG含量計算可知,模型組HOMA-IR較正常組顯著升高(P<0.05),說明模型組小鼠的胰島素分泌水平下降且伴隨機體胰島素抵抗現象.與模型組相比,BLE干預組小鼠的FINS含量增加,其中BLEH組呈極顯著增加(P<0.01),與正常組無顯著性差異,說明BLE可有效改善T2D小鼠胰島素分泌水平.與模型組相比,BLE干預組小鼠的HOMA-IR均極顯著降低(P<0.01),且隨劑量上升呈梯度下降,說明BLE可極顯著改善T2D小鼠胰島素抵抗癥狀,且具有劑量依賴效應(見表2).

表2 BLE對T2D小鼠FINS和HOMA-IR的影響(1U=1.67×10-8 kat,n=6)

2.3 BLE對T2D小鼠血脂水平的影響

BLE灌胃干預T2D小鼠35 d后,模型組小鼠血清中TC,TG和LDL-C濃度均顯著高于正常組(P<0.05),HDL-C濃度顯著低于正常組(P<0.05),說明T2D小鼠血脂異常.BLE干預組小鼠血清的TC,TG和LDL-C濃度隨BLE灌胃劑量的上升呈梯度下降,HDL-C濃度隨BLE灌胃劑量的上升呈梯度上升;BLEH組小鼠的TC,TG,HDL-C和LDL-C濃度與模型組呈極顯著差異(P<0.01),其中TC濃度與正常組無顯著性差異,HDL-C濃度顯著高于正常組(P<0.05),說明BLE可有效改善T2D小鼠的血脂異常癥狀(見表3).

表3 BLE對T2D小鼠TC,TG,HDL-C和LDL-C的影響(n=6) 單位：mmol·L-1

2.4 BLE對T2D小鼠肝臟糖代謝水平的影響

酶水平及中間代謝產物水平是探究糖代謝的一種重要途徑,肝臟中GCK和G-6-Pase的活性及肝糖原濃度則可作為重要指標.干預35 d后,與正常組相比,模型組小鼠的GCK活性和肝糖原濃度極顯著下降(P<0.01),G-6-Pase活性極顯著升高(P<0.01),說明T2D小鼠糖代謝過程發生異常.與模型組相比,BLE干預組小鼠的GCK活性和肝糖原濃度均極顯著升高(P<0.01),且隨劑量的增加呈梯度上升,說明BLE可劑量依賴性地抑制糖異生途徑,促進肝糖原的合成,從而使肝糖原的儲備量增多;BLEM組和BLEH組小鼠的G-6-Pase活性極顯著下降(P<0.01),且隨劑量的增加呈梯度下降,說明BLE可劑量依賴性地增強糖酵解途徑.綜上表明,BLE可綜合多條途徑改善T2D小鼠糖代謝異常癥狀(見表4).

表4 BLE對T2D小鼠GCK,G-6-Pase和肝糖原的影響(n=6)

2.5 BLE對T2D小鼠胰臟和肝臟抗氧化水平的影響

模型組小鼠胰臟和肝臟的T-SOD活性和GSH-PX質量摩爾濃度與正常組相比均極顯著下降(P<0.01),MDA濃度極顯著升高(P<0.01),說明T2D小鼠胰臟和肝臟的抗氧化水平極顯著下降,組織細胞氧化應激損傷嚴重.BLE干預組小鼠胰臟和肝臟的T-SOD活性和GSH-PX質量摩爾濃度隨BLE灌胃劑量的增加呈梯度增加,其中BLEH組小鼠胰臟和肝臟的T-SOD活性和GSH-PX質量摩爾濃度極顯著高于正常組(P<0.01);胰臟和肝臟的MDA濃度隨BLE灌胃劑量的增加呈梯度下降,其中BLEM組和BLEH組胰臟的MDA已降低至與正常組無顯著性差異,BLEH組肝臟的MDA已降低至與模型組產生極顯著差異(P<0.01).說明BLE可劑量依賴性地增強T2D小鼠胰臟和肝臟的抗氧化水平,減輕其氧化應激損傷(見表5).

表5 BLE對T2D小鼠胰臟和肝臟T-SOD,GSH-PX和MDA的影響(n=6)

2.6 BLE對T2D小鼠胰臟和肝臟抗氧化水平的影響

正常組小鼠胰臟胰島邊界清晰,胰島體積較大,島內細胞數量多且分布均勻,胞質豐盈,核圓均勻.模型組小鼠胰臟出現明顯的病理變化,箭頭所指為典型病變處,表現為嚴重的胰島萎縮,島內只可見少數細胞,且中心部細胞出現空泡化現象.BLE干預組隨BLE灌胃劑量增加,小鼠胰臟病理癥狀呈梯度減輕,說明BLE可減輕糖尿病對胰臟的損傷,并呈現出一定的劑量依賴性(見圖3).

正常組小鼠TUNEL染色切片中只可見少量細胞核出現棕染現象,清晰可見較大體積的胰島,凋亡率僅為1.02%;模型組顯示大部分細胞核存在棕染現象,胰島萎縮嚴重,島內細胞較少,凋亡率可達24.38%;陽性組、BLEL組、BLEM組、BLEH組的細胞凋亡率分別為11.52%,24.21%,17.49%,1.67%.BLE干預組細胞核的棕染現象隨灌胃劑量增加而減少,凋亡率呈下降趨勢,說明BLE可劑量依賴性地減輕糖尿病帶來的胰臟細胞凋亡現象,緩解胰臟器官損傷(見圖4).

正常組小鼠肝臟細胞邊界清晰,均圍繞中央靜脈呈放射狀排列,細胞核與細胞質均一,幾乎無脂滴液泡.模型組小鼠肝臟出現較嚴重的形態變化,主要表現為細胞排列紊亂,肝細胞體積明顯增大,細胞核質疏松模糊,出現大量脂滴空泡.BLE干預組隨BLE灌胃劑量增加肝臟細胞排列更為整齊,脂滴液泡減少,說明BLE可減輕T2D小鼠肝臟損傷(見圖5).

正常組小鼠細胞凋亡率僅為0.87%,僅有少數細胞發生核棕染現象;模型組小鼠TUNEL染色切片顯示大多數細胞呈現陽性反應,凋亡率可達39.91%;陽性組、BLEL組、BLEM組、BLEH組的TUNEL染色細胞凋亡率分別為29.56%,36.86%,26.43%,15.81%.BLE干預組細胞核的棕染現象隨灌胃劑量增加而減少,凋亡率呈下降趨勢,說明BLE可減輕糖尿病帶來的肝臟細胞凋亡現象,緩解肝臟器官損傷,并呈現一定的劑量依賴性(見圖6).

3 討 論

據本實驗室前期研究,BLE對AG活性具有良好的抑制作用[15],可將其作為AGI類型的降血糖物質進行研發[18].純化分離BLE后發現,其多酚類物質中的槲皮素及其衍生物不僅含量高,且為最優活性的體外降血糖化合物[15],該類物質可通過協同疏水作用與氫鍵作用改變AG的內聚模式,從而競爭性地抑制AG活性[19].基于體外降血糖活性實驗,本文進一步以糖尿病小鼠模型探究BLE的體內降血糖活性,結果顯示,BLE可劑量依賴性地降低T2D小鼠2 h PG,且治療總有效率與陽性組相一致,提示BLE與陽性組阿卡波糖的降糖機制相似,在體內競爭性地抑制AG活性阻斷葡萄糖來源,從而達到降餐后血糖的作用.

此外,BLE作為天然來源的降血糖物質,同時還具備了阿卡波糖所缺乏的整體性調節糖尿病病癥的能力[10].糖尿病最典型的病癥之一為持續性高血糖癥,血糖水平持高不下可使FINS水平代償性升高,導致機體對胰島素的敏感性降低;隨病情發展,胰島β細胞進入超負荷耗竭狀態使胰島素分泌水平下降,機體最終產生胰島素抵抗[20].本實驗中,BLE能有效降低T2D小鼠的FBG、升高FINS、降低機體的HOMA-IR,提示BLE相較阿卡波糖可更為快速的改善糖尿病FBG水平和FINS分泌水平,減輕胰島素抵抗癥狀,推測其可通過多條途徑,更快速地改善糖尿病典型癥狀.

a：正常組;b：模型組;c：陽性組;d：BLEL組;e：BLEM組;f：BLEH組圖3 BLE對T2D小鼠胰臟病理形態影響

a：正常組;b：模型組;c：陽性組;d：BLEL組;e：BLEM組;f：BLEH組圖4 BLE對T2D小鼠胰臟細胞凋亡的影響

a：正常組;b：模型組;c：陽性組;d：BLEL組;e：BLEM組;f：BLEH組圖5 BLE對T2D小鼠肝臟病理形態的影響

a：正常組;b：模型組;c：陽性組;d：BLEL組;e：BLEM組;f：BLEH組圖6 BLE對T2D小鼠肝臟細胞凋亡的影響

氧化應激系統可與不同炎癥通路中的促炎因子和轉錄調節因子相互作用影響糖尿病的發生[21].正常人在血糖水平升高時,機體可通過激活AMPK/SIRT1通路,下調NOX2/NOX4通路中NADPH的表達,升高SOD和GSH-PX等抗氧化酶的活性,同時降低MDA等具有細胞毒性的脂質過氧化終產物濃度[22].本實驗顯示,BLE可通過提高T2D小鼠胰臟和肝臟中SOD活性和GSH-PX濃度增強機體活細胞抗氧化能力,使機體維持在氧化還原自穩態,同時降低胰臟和肝臟中MDA濃度減輕其氧化應激損傷,從而有效保護胰臟和肝臟正常生理形態結構,這與胰臟和肝臟組織HE染色切片觀測結果相一致.本實驗室前期研究[15]顯示,冬季‘杰兔’品種藍莓葉多酚含量高,其提取物具有優良的體外抗氧化活性(DPPH·,ABTS+和·OH清除能力).體內外實驗相結合表明,BLE可作為抗氧化劑在減弱所攝入的食物氧化作用的同時,通過提升T2D小鼠胰臟和肝臟的抗氧化水平,減少脂質過氧化帶來的氧化應激損傷,保護臟器正常生理形態結構,使其正常行使生化功能.

目前認為,胰島β細胞是機體內唯一能產生降血糖激素——胰島素的組織細胞.而肝臟是胰島素調節糖代謝的主要靶器官之一,其維穩血糖主要是以協調糖異生、糖酵解及糖原的合成分解三大過程實現的,肝臟糖代謝異?？芍苯芋w現在糖代謝酶活性和糖代謝產物濃度的變化中[23].GCK作為糖酵解和肝糖原合成過程的第1個關鍵酶,其活性的升高可提升感知和響應胰島素主要信號通路IRS1/PI3K/AKT調控的能力,促進糖酵解過程,并啟動肝糖原的合成以增加肝糖原儲存量;G-6-Pase是糖異生過程的關鍵限速酶,GCK活性的升高可同步下調G6PC等基因的表達以抑制糖異生過程,維持血糖穩態[24].本實驗結果顯示,BLE能有效提高T2D小鼠肝臟中的GCK活性和肝糖原濃度,降低G-6-Pase活性,提高T2D小鼠血清FINS水平,表明BLE可改善肝臟的糖代謝功能,同時增強胰腺的胰島素分泌功能,從而達到顯著的體內降血糖功效.

糖尿病常因糖代謝紊亂聯動導致脂代謝紊亂,從而引起高脂血癥,血脂異?？芍苯芋w現在TC,TG,LDL-C和HDL-C的濃度變化中.本實驗結果顯示,BLE能有效降低T2D小鼠TC,TG和LDL-C水平,同時升高HDL-C水平,表明BLE可有效改善糖尿病高血脂癥狀,對脂質代謝具有很好的調節作用.長期高血脂狀態可在動脈管腔內壁形成斑塊堵塞,致使動脈粥樣硬化、冠心病、肢體壞死等嚴重的糖尿病并發癥,因此,BLE對脂質代謝的改善和脂毒性的清除可成為預防、改善糖尿病的一種重要手段[25].

BLE中富含多酚類物質,作為新型AGI,推測其可通過競爭性抑制小腸黏膜上的AG活性,阻斷葡萄糖的來源,達到降低餐后血糖的作用;BLE同時具有優良的抗氧化活性,可作為新型抗氧化劑,其不僅可與小鼠消化道中的食物反應減弱其氧化作用,還可通過提高T2D小鼠主要胰島素靶器官——胰臟和肝臟的抗氧化水平,減輕其氧化應激損傷,保護組織細胞的生理形態結構,增強胰腺胰島素分泌功能的同時維穩肝臟糖代謝功能.綜上所述,BLE可綜合多條途徑、多個環節、多項靶點,整體性地對機體血糖和血脂水平進行有效調節.

本研究從小鼠生理生化指標的變化入手,揭示了BLE對T2D小鼠糖脂代謝的調節作用,根據對氧化應激途徑和糖脂代謝途徑中酶水平和中間代謝產物水平的分析,初步解釋了BLE對T2D小鼠糖脂代謝的調節機制,為藍莓葉在預防治療糖尿病方面的應用提供理論基礎.為了更好地探究BLE對T2D小鼠的降血糖機制,可從PI3K/AKT/mTOR信號通路結合AMPK/SIRT1/NOX4信號通路,進一步從分子水平綜合探究BLE對T2D小鼠的胰臟和肝臟的氧化應激反應、炎癥反應和臟器細胞變性等的影響機制.