香辛料體外阻斷NDMA 及清除自由基的研究

陳瑤綿，羅詩茵，潘子強，李 琳

（1.電子科技大學中山學院，廣東中山 528402；2.佛山科學技術學院，廣東佛山 528200）

0 引言

N- 亞硝基化合物（NDMA） 是一類危害性極高的化學致癌物，流行病學調查表明，人類很多癌癥如胃腸癌[1]、食道癌[2]、肝癌[3]等可能與亞硝胺有關。因此，采用適宜且科學的方法有效阻斷亞硝胺的生成具有重要的健康效應。

目前，雖有不少有關亞硝胺致癌機理的研究，但尚無成熟觀點，有學者提出自由基反應可能與亞硝胺致癌機理有關[4]；亞硝酸鹽作為合成亞硝胺的重要前體物質之一，有研究認為抑制或降低亞硝酸鹽也可阻斷亞硝胺的合成。有研究表明，香辛料具有阻斷亞硝胺生成的效果，但其阻斷機理尚不明晰。香辛料在食品加工發揮著獨特的調味作用，并因其所含的生物活性物質而表現出健康效應[5]。因此，確定常見香辛料對亞硝胺的阻斷效應并探討其抑制機理值得深入開展。

以常見的香辛料（丁香、石榴皮、烏梅、八角、鼠尾草、大蒜及生姜） 為原料，采用不同提取方式（水浸提法、醇浸提法） 對其活性成分進行提取，在體外模擬胃液環境下，比較不同香辛料提取物對NDMA 的阻斷率，選出最適宜的提取方法。同時，通過香辛料提取液清除亞硝胺的前體物質（亞硝酸鹽） 和抗氧化能力探索其可能存在的阻斷機理。在此基礎上，選擇阻斷率最佳的香辛料進行復配，探索適宜的復配組合并考查其可能存在的協同效應。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

八角、丁香、烏梅、石榴皮、鼠尾草、大蒜及生姜，廣東寶元堂藥業有限公司提供。

試驗試劑：鹽酸二甲胺、鹽酸萘乙二胺、α - 萘胺、焦性沒食子酸、鄰苯三酚、α - 核糖，上海阿拉丁公司提供；鹽酸，廣州化學試劑廠提供；檸檬酸鈉、碳酸鈉、對氨基苯磺酸、無水乙醇、95%乙醇，天津市百世化工有限公司提供；亞硝酸鈉、EDTA，天津市永大化學試劑有限公司提供；維C，天津市鼎盛鑫化工有限公司提供；硫酸亞鐵，國藥集團化學試劑有限公司提供；磷酸緩沖液、過氧化氫，自配。

1.2 儀器與設備

N-1210B 型旋轉蒸發儀、NVP-1000 型隔膜真空泵、CCA-1112A 型冷卻水循環裝置，上海愛朗儀器有限公司產品；HH-6 型恒溫水浴鍋，宏華儀器廠產品；YP6002 型電子天平，衡正電子儀器有限公司產品；超凈工作臺，博迅實業有限公司產品；高速冷凍離心機，廣州格盧瑞生命科學有限公司產品；V1100 型可見分光光度計，上海三信儀器有限公司產品。

1.3 試驗方法

1.3.1 香辛料提取物的制備

參照張強等人[6]的提取方法并略作修改，將各香辛料破碎成粉狀后過40 目篩，按所選提取溶劑分為水浸提法組和醇浸提法組（見圖1），制得的香辛料提取液質量濃度相當于100 mg 原藥/ mL。

圖1 香辛料的不同提取方法

香辛料的不同提取方法見圖1。

1.3.2 體外模擬硝化體系的制備和測定

參考馬驪珍等人[7]的方法，并略作修改，得到下述方法：反應體系是10 mL，分為空白對照組和試驗組。吸取1.0 mL 的香辛料提取液至10 mL 具塞試管中，加入0.5 mol/L 檸檬酸鈉- 鹽酸緩沖液5.0 mL， 1 mmol/L 亞硝酸鈉1.0 mL，1 mmol/L 二甲胺鹽酸鹽溶液0.5 mL，檸檬酸鈉- 鹽酸緩沖溶液將反應體系定容至10 mL，于37 ℃下水浴反應1 h（空白對照組用1.0 mL 去離子水代替香辛料提取液）。

取1.0 mL 上述反應的溶液至玻璃器皿中，加入0.5%碳酸鈉溶液0.5 mL 終止其反應，紫外燈下放置15 min（液面距燈約15 cm），取出立即加入質量分數為1%的無水對氨基苯磺酸溶液1.5 mL，質量分數為0.1%的α - 萘胺溶液1.5 mL，用去離子水精確定容至5.0 mL，搖勻，室溫下靜置20 min 顯色，于波長525 nm 處測定其吸光度。再測出空白對照組的吸光度，空白對照組為不加香辛料的濃縮液，每組平行測定3 次。阻斷率的計算見公式（1）。

式中：A0——空白組的吸光度；Ax——樣品的吸光度。

1.3.3 抑制亞硝胺的當量體系的制備和測定

以維C 為標準物質，分別按照0.4，0.6，0.8，1.0，1.2，1.6，1.8，2.0 mg/mL 的質量濃度加入在體外硝化體系，比較不同質量濃度維C 抑制亞硝胺的情況并繪制其抑制曲線，建立抑制曲線模型。

1.3.4 清除亞硝酸鹽的體系制備和測定

參考黃仕彬等人[8]的試驗方法并稍作修改：吸取0.2 mL 的7 種香辛料提取液分別加入25 mL 的具塞試管中，先后加入1.0 mL 檸檬酸鈉- 鹽酸緩沖溶液（pH 值為3） 和1.0 mL 的亞硝酸鈉標準溶液混勻后放置于37 ℃的恒溫水浴鍋中水浴30 min。取出后立即加入質量分數為0.4%的對氨基苯磺酸溶液1.0 mL，4 min 后加入質量分數為0.2%的鹽酸萘乙二胺溶液0.5 mL，并用去離子水定容到刻度線，混勻放置15 min。用分光光度計于波長546 nm 處測其吸光度，根據公式（2） 計算：

式中：A1——未加香辛料提取液時亞硝酸鈉的吸光度，即對照值；

A——加入各香辛料提取液的吸光度。

1.3.5 不同香辛料提取液的抗氧化活性

（1） 不同香辛料清除DPPH 自由基能力的研究。取1.5 mL DPPH（1 mmol/L） 溶液置于具塞試管中，加入1.5 mL 待測液（去離子水1.3 mL 和1 mg/mL 香辛料提取液0.2 mL），振蕩混勻，室溫避光放置45 min，于波長517 nm 處測其吸光度（Ax），空白調零是體積分數為95%乙醇1.5 mL 加1.5 mL 去離子水，對照為1.5 mL DPPH 溶液加1.5 mL 去離子水，于波長517 nm 處測其吸光度（Ac）。分別以2，1，0.2，0.1 mg/mL 的維C 為參照。樣品液對DPPH 自由基的清除能力用清除率A*表示。

（2） 不同香辛料清除·OH 能力的研究。運用Deoxyribose 篩選法，取1.0 mL 香辛料提取液（質量濃度50 mg/mL） 于具塞試管中，加入濃度為5 mmol/L FeSO4·EDTA 混合溶液0.2 mL，再加入0.5 mL α-核糖（10 mmol/L），然后加pH 值7.4 的磷酸緩沖液1 mL，用5 mmol/L H2O2定容至2.9 mL，搖勻開啟反應，于37 ℃條件下水浴反應1 h 后，取出加入質量分數為2.8%的TCA 溶液1 mL，質量分數為1.0%的TBA 溶液1 mL，冷卻后于波長532 nm 處測定吸光度Rx，對照組不加香辛料提取液R'，空白管用磷酸緩沖液2 mL 加去離子水2 mL 調零。

香辛料提取液對于·OH 的清除能力用R 表示：

（3） 不同香辛料清除超氧陰離子自由基（O2-·）能力的研究。采用鄰苯三酚自氧法研究超氧陰離子自由基的清除能力，在試管中加入2.8 mL pH 值8.2，50 mmol/L Tris-HCl 緩沖液，其中空白組加0.1 mL去離子水，25 ℃下保溫10 min，取出后加入0.1 mL 10 mmol/L HCl 溶液；對照組（F'） 加0.1 mL 去離子水，25 ℃保溫10 min，取出后加0.1 mL 鄰苯三酚溶液；樣品組（Fx） 加入0.1 mL 香辛料提取液（50 mg/mL），在25 ℃條件下保溫10 min，取出后加入0.1 mL 鄰苯三酚溶液。

香辛料提取液對于超氧陰離子自由基（O2-·） 的清除能力用F 表示：

1.3.6 復配香辛料提取液

綜合香辛料對自由基、在模擬體系及對亞硝酸鹽的清除率結果，確定石榴皮、丁香、鼠尾草和八角4 種香辛料進行1∶1 復配，分別考查復配香辛料對NDMA 的阻斷效果及其對亞硝酸鹽的清除效果。

2 結果與分析

2.1 香辛料對NDMA 的阻斷能力

2.1.1 不同提取方式對NDMA 的阻斷效應

不同香辛料不同提取溶劑的提取液抑制NDMA生成的影響見圖2。

圖2 不同香辛料不同提取溶劑的提取液抑制NDMA 生成的影響

活性物質具有不同的溶解性，圖2 比較了不同提取溶劑對香辛料提取液在NDMA 抑制率的影響。由圖2 可知，石榴皮無論采用水浸提法還是醇浸提法，對NDMA 的生成均有較好的阻斷效果（阻斷率＞90%）；鼠尾草、八角和丁香的水浸提液對NDMA 的阻斷率較高；烏梅、生姜和大蒜等的醇浸提液表現出更好的NDMA 抑制作用。

不同香辛料提取液抑制亞硝胺生成（X±s） 見圖3。

圖3 不同香辛料提取液抑制亞硝胺生成（X±s）

將香辛料用最適的溶劑進行提取，比較不同香辛料提取液對NDMA 的作用。由圖3 可知，7 種香辛料提取液的抑制率均＞50%，其中鼠尾草、丁香、八角和石榴皮4 種提取液均達到90%以上，石榴皮含有大量的多酚類物質，對于N - 亞硝胺有抑制的作用；八角含有的茴香醛具有抗氧化性，可能抑制NDMA 生成；丁香中含有丁香酚，鼠尾草中含有迷迭香酸、單寧酸等黃酮類化合物，這些活性物質可能是抑制NDMA 生成的原因。

2.1.2 香辛料抑制NDMA 的維C 當量水平

維C 抑制率曲線及其S 型擬合曲線見圖4。

圖4 維C 抑制率曲線及其S 型擬合曲線

選擇維C 為陽性對照，測定不同質量濃度維C對NDMA 的阻斷能力并建立數學模型，得到Logistic擬合曲線為Y=88.37-73.91/(1+X/0.88)(R2=0.973 5)，利用該模型確定不同香辛料在阻斷NDMA 生成方面的維C 當量水平。

不同香辛料在阻斷NDMA 的維C 當量見表1。

表1 不同香辛料在阻斷NDMA 的維C 當量

2.1.3 不同香辛料對亞硝胺前提物質- 亞硝酸鹽的清除效應

亞硝酸鹽作為亞硝胺的前體物質之一，清除亞硝酸鹽可能是香辛料具有阻斷NDMA 生成的原因。

不同香辛料提取液對亞硝酸鹽的清除率（X±s）見圖5。

圖5 不同香辛料提取液對亞硝酸鹽的清除率（X±s）

由圖5 可知，7 種香辛料提取液在體外對亞硝酸鹽具有不同的清除能力，說明香辛料提取液中的活性物質均能夠與體系中的亞硝酸根發生相互作用，清除NDMA 最強的是石榴皮提取液，而清除亞硝酸鹽能力最強的是丁香，清除能力最弱的是生姜。

2.2 不同香辛料對不同自由基的清除效應

自由基是生命活動時產生的一種帶有未成對電子的基團，對調節機能的平衡方面發揮著重要作用。研究發現，香辛料提取物對清除自由基有一定作用，如生姜汁對亞硝胺的合成有顯著的阻斷作用且具有較強的熱穩定性[9]，還能減少由亞硝胺代謝產生的自由基[10]。姚瑤等人[11]發現丁香、桂皮和生姜的水浸提物對于醬牛肉抗氧化能力也較強，其中香辛料水浸提物的總酚含量與抗氧化能力呈正相關。朱妙琴等人[12]發現大蒜和生姜提取液在中性或偏酸性條件下對自由基有一定的清除率。敬小波[13]研究發現常見的花椒、生姜及丁香均有良好的抗氧化能力。

比較7 種樣品液對3 種自由基（DPPH·、·OH 、O2-·） 的清除能力.

不同樣品液對DPPH·的清除能力（X±s） 見表2，不同香辛料提取液對自由基的清除能力（X±s）見圖6。

表2 不同樣品液對DPPH·的清除能力（X±s）

圖6 不同香辛料提取液對自由基的清除能力（X±S）

由表2 可知，7 種香辛料提取液在一定程度上都具有清除DPPH 自由基的效果，其中1 mg/mL 的丁香和石榴皮效果最好，分別為（46.18±0.78） %，（61.46±2.53） %，與0.1 mg/mL 的維C 相當。

由圖6 可知，7 種香辛料（50 mg/mL） 對于生成速度快且壽命短的·OH 具有清除能力，其中生姜和大蒜的醇提液對于羥基自由基的清除效果最好，清除率分別為87.89%和87.31%；對于O2-·清除率從大到小依次為鼠尾草＞石榴皮＞丁香＞烏梅＞生姜＞八角＞大蒜（50 mg/mL）。

2.3 復配香辛料的交互作用

研究發現，很多天然提取物復配時可產生協同增效作用，因此復配成為了天然產物研究領域的熱點。陳文靜等人[14]發現花椒、八角、丁香、麻椒及迷香組成的復配混合液可抑制亞硝胺。馬儷珍等人[7]研究發現桂皮、柚子皮、八角和花椒提取液在復配時阻斷NDMA 的效果明顯。付麗等人[15]研究表明，當八角、桂皮和生姜混合液復配比為1∶1∶2 時，對亞硝酸鹽的清除率高達88.17%。還有研究發現，花椒與八角按質量比1∶2 復配對亞硝酸鈉的清除具有協同增效作用[16]。

將具有阻斷NDMA 生成的4 種香辛料按照1∶1進行復配，考查其阻斷NDMA 生成的效果。

單一及復配香辛料提取液阻斷效果對比見圖7。

圖7 單一及復配香辛料提取液阻斷效果對比

其中，復配后的混合提取液對NDMA 的阻斷效果最好的組合為石榴皮+鼠尾草（1∶1），阻斷率為70.12%。可推斷出復配香辛料對抑制NDMA 生成具有比較理想的效果；4 種香辛料復配后對于亞硝酸鹽的清除率均高于單一香辛料，其中清除效果最好的組合是石榴皮+鼠尾草，清除率達到75.28%。

3 結論

7 種香辛料提取液在抑制NDMA 生成和清除亞硝酸鹽方面均具有一定的作用，同時也具有清除自由基的能力；初步的復配試驗發現，石榴皮和鼠尾草的結合可能存在協同增效作用；香辛料阻斷NDMA 生成的機理尚不明顯，值得進一步研究。