石斛花揮發油脂質體的制備工藝研究

馬 丹，尚書游，李文琦，王勁松，阮 軍，李碩芳，馬志國，何 虹

（1.荊楚理工學院農業生物技術研究所，湖北荊門 448000；2.湖北鐘祥聚瑞食品有限公司，湖北荊門 431900）

0 引言

中藥揮發油不僅在醫學上有很大的應用價值，還是香料工業、日用食品工業和化學工業中的一種重要的原材料[1-3]。由于中藥揮發油的理化性質不穩定，導致其相關制劑的質量控制難度增大，使得制劑的進一步開發和推廣受到了限制。隨著芳香類中藥揮發油的提取分離和產品研制的改進，新技術、新方法的應用對中藥揮發油相關制劑的研究與開發提供了技術支持。含揮發油的中藥材被研發成滴丸、軟膠囊、微乳、凝膠膏劑、微囊、微球、脂質體、聚合物膠束等多種中藥揮發油新型制劑[4-7]，并建立了鼻腔給藥、經皮給藥、結腸定位給藥等多種新型給藥系統。鐵皮石斛是名貴中藥，其活性成分多糖、黃酮等是研究熱點[8-10]，而鐵皮石斛花揮發性成分的研究較少。有研究表明，石斛花中含有豐富的揮發油，且具有抗炎、抗氧化、抗衰老等藥理作用[11-16]；有研究[17-21]從石斛花中提取出揮發油，并對石斛花揮發性化學組分進行定性定量研究，為石斛花揮發油功能產品的開發提供了理論依據。對石斛花揮發油脂質體進行初步研究，旨在提高其穩定性，為其進一步開發和應用奠定基礎。

1 材料與儀器

1.1 試驗材料

石斛花，荊楚理工學院種植；膽固醇，天津博迪化工有限公司提供；卵磷脂，天津福晨化學試劑廠提供；三氯甲烷（分析純），茂名市潤景化工有限公司提供；甲醇（分析純），無錫市晶科化工有限公司提供；磷酸鹽緩沖液（生化試劑），南通凱恒生物科技公司提供。

1.2 儀器與設備

TU-1901 型雙光束紫外可見分光光度計，北京普析通用儀器有限責任公司產品；XD-2000B 型旋轉蒸發器，上海賢德實驗儀器有限公司產品；顯微鏡、數顯恒溫水浴鍋，上海力辰邦西儀器科技有限公司產品；GL-23M型大容量高速冷凍離心機，湘儀儀器科技有限公司產品；SB25-12D 型超聲波清洗機，寧波新芝生物科技股份有限公司產品。

2 試驗方法

2.1 石斛花揮發油的提取

稱取石斛花500 g，加入無水乙醇750 mL，攪拌 3 h 后用布氏漏斗抽濾。于40 ℃條件下將濾液用旋轉蒸發儀減壓濃縮，濃縮液使用離心機以轉速4 000 r/min 離心10 min，得到約4.0 mL 油液。裝于具塞試管中于4 ℃條件下儲存備用。

2.2 石斛花揮發油脂質體制備

取石斛花揮發油0.45 mL，卵磷脂0.45 g，膽固醇0.15 g 置于100 mL 圓底燒瓶中，加三氯甲烷10 mL 溶解，置于40 ℃水浴中攪拌溶解。于旋轉蒸發器上旋轉蒸發，使脂質在器壁上形成薄膜。真空干燥2 h，加入pH 值7.2 的磷酸鹽緩沖液20 mL，通過超聲處理30 min 后得到乳白色均勻混懸液。

2.3 石斛花揮發油含量測定方法

2.3.1 UC 測定波長的選擇

將0.02 mL 的石斛花揮發油放入50 mL 容量瓶中，加入甲醇溶液，定容至刻度。用甲醇溶液作為空白對照，于波長200～400 nm 處進行紫外掃描。通過掃描圖譜來確定石斛花揮發油的最大吸收波長。

2.3.2 繪制標準曲線

取石斛花揮發油2 mg 加甲醇稀釋至50 mL，分別吸取0.6，0.8，1.0，1.2，1.4，1.6，1.8 mL，用甲醇定容至10 mL。在石斛花揮發油的最大吸收波長處測定標準液吸收度，平行測定3 次。通過線性回歸可得石斛花揮發油的回歸方程。

2.3.3 石斛花揮發油脂質體的理化性質

（1） 外觀。參照錢雪等人[22]的試驗方法。

（2） pH 值。參照錢雪等人[22]的試驗方法。

2.3.4 測定脂質體的包封率

吸取混懸液于離心管中，冰浴10 min，以轉速19 000 r/min 離心30 min，取上清液，按“線性關系考查”項下測定樣品的吸光度，測得游離揮發油的含量。根據下面的公式計算包封率[5]：

式中：W1——加入的石斛花揮發油的總量，mL；

W2——測得游離揮發油的含量，mL。

2.4 單因素試驗

固定其他條件與藥物用量，制備石斛花揮發油脂質體的過程中，以水化溫度、卵磷脂含量、膽固醇含量、磷酸緩沖液體積為影響指標，由以上4 個單因素來觀察石斛花揮發油脂質體的包封率與成型性，篩選出單因素制備石斛花揮發油脂質體的最佳結果。

單因素試驗因素與水平設計見表1。

表1 單因素試驗因素與水平設計

2.5 正交試驗優化制備處方

通過水化溫度、石斛花揮發油與卵磷脂配比、卵磷脂與膽固醇配比、磷酸緩沖液的單因素試驗，選擇脂質體包封率最高值附近的3 個水平，對石斛花揮發油脂質體的制備工藝進行優化，觀察其包封率與成型性。

正交試驗的因素與水平設計見表2。

表2 正交試驗的因素與水平設計

3 結果與分析

3.1 最大吸收波長

石斛花揮發油的紫外圖譜見圖1。

由圖1 可知，在波長260 nm 處有最大吸收度，故將此波長定為檢測石斛花揮發油含量的波長。

3.2 標準曲線

測定石斛花揮發油梯度濃度溶液的吸光度，得到的標準曲線方程為Y=0.160 8X-0.013 6，R2=0.999 2，表明石斛花揮發油的質量濃度為2.4～7.2 μg/mL 時與吸光度呈良好的線性關系。

3.3 石斛花揮發油脂質體的理化性質

將脂質體放置在顯微鏡下，可清晰地觀察到石斛花揮發油脂質體呈球形，其表面包裹著磷脂，結構完整，大小較為均一。這種球形的脂質體表明了石斛花揮發油脂質體的穩定性和結構完整性。為了更好地了解石斛花揮發油脂質體的性質，對其采用pH 計測試。在測試中，發現其pH 值在5～7，說明其具有良好的穩定性和緩沖能力。

石斛花揮發油脂質體顯微鏡下圖見圖2。

圖2 石斛花揮發油脂質體顯微鏡下圖

3.4 單因素試驗結果

3.4.1 水化溫度的影響

水化溫度對包封率的影響見圖3。

圖3 水化溫度對包封率的影響

由圖3 可知，在水化溫度為40℃時，脂質體的包封率最高，為62.72%；當水化溫度超過40 ℃時，隨著溫度的升高，包封率降低。溫度過高會導致脂質體破壞或不穩定，溫度過低則會使脂質體難以形成水化溫度，還會影響脂質體的質量。在一定溫度范圍內，隨著水化溫度的升高，脂質體的穩定性和均勻性均會增加，但超過一定溫度后，脂質體的穩定性和均勻性會減弱。水化溫度還會影響石斛花揮發油的釋放速率。研究表明，在一定溫度范圍內，水化溫度的升高會加快石斛花揮發油的釋放速率，但超過一定溫度后，石斛花揮發油的釋放速率反而會降低。在制備石斛花揮發油脂質體時，選擇合適的水化溫度，以保證脂質體的穩定性、均勻性和石斛花揮發油的釋放速率。

3.4.2 卵磷脂與膽固醇配比的影響

卵磷脂與膽固醇的配比的影響見圖4。

圖4 卵磷脂與膽固醇配比的影響

由圖4 可知，隨著卵磷脂與膽固醇配比的增大，脂質體的包封率逐漸升高后降低。當卵磷脂與膽固醇配比為3∶1 時，脂質體的包封率達到最高，為69.5%。試驗表明，膽固醇和卵磷脂具有較好的協同作用，膽固醇可穩定雙層膜結構。當卵磷脂與膽固醇的配比增加時，構成脂質體的磷脂含量減少，而高膽固醇會增加脂質體的親水性，使得磷脂膜不結實，容易被破壞、滲漏，不利于脂質體的形成，從而造成包封率降低。

3.4.3 石斛花揮發油與卵磷脂配比的影響

石斛花揮發油與卵磷脂配比的影響見圖5。

圖5 石斛花揮發油與卵磷脂配比的影響

由圖5 可知，石斛花揮發油與卵磷脂配比為3∶1時，脂質體包封率達到69.37%；石斛花揮發油具有較強的揮發性和生物活性，其含量的增加可以增強脂質體內藥物的包封率，也會影響脂質體的穩定性，可能導致藥物的泄漏。卵磷脂則可以增加脂質體的穩定性，但其含量過高也會降低藥物的包封率。

3.4.4 磷酸緩沖液體積的影響

磷酸緩沖液用量對包封率的影響見圖6。

圖6 磷酸緩沖液用量對包封率的影響

由圖6 可知，在磷酸緩沖液用量為10 mL 時，脂質體的包封率最高，為47.54%，包封率隨磷酸緩沖液增加而降低。當磷酸緩沖液的體積過大時，會導致溶液中石斛花揮發油脂質體的濃度過低，從而影響提取效率。當磷酸緩沖液的體積過小時，溶劑的濃度過高，可能導致石斛花中的油脂質體不能完全溶解，同樣影響提取效率。磷酸緩沖液的用量越高，可提高溶劑的溶解能力，使得石斛花中的油脂質體更容易溶解，有利于提取。

3.5 正交試驗結果

以脂質體的包封率為指標進行正交試驗，正交試驗2，4，5，7 的包封效果較好，分別為51.92%，56.45%，43.55%，52.07%。正交試驗的最佳水平為A2B1C2D2，即水化溫度為40 ℃，卵磷脂與膽固醇配比為1∶2，揮發油與膽固醇配比為3∶1，磷酸鹽緩沖溶液pH 值為7.2，用量為10 mL 時，石斛花揮發油脂質體的成型性最好，包封率最佳，為56.45%。試驗結果表明，卵磷脂的含量對石斛花揮發油脂質體的包封率和成型性均具有顯著影響。

根據上述篩選得到的最佳工藝進行驗證試驗，制備3 批脂質體樣品，測得石斛花揮發油脂質體包封率平均值為57.37%。

正交試驗結果見表3。

表3 正交試驗結果

4 結論

通過薄膜分散法研究石斛花揮發油脂質體配方中不同成分的比例和外在影響因素可知，石斛花揮發油與卵磷脂的配比對脂質體的制備、包封率和成型性的影響較大。當水化溫度為40 ℃，卵磷脂與膽固醇配比為1∶2，揮發油與膽固醇配比為3∶1，磷酸鹽緩沖溶液pH 值為7.2，用量為10 mL 時，石斛花揮發油脂質體的成型性最好，包封率最佳為56.45%。