液相色譜- 串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定豆芽中6 - 芐基腺嘌呤殘留量的不確定度

常 薇，鄒 力

（陜西省產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)研究院，陜西西安 710000）

豆芽是各種谷類(lèi)、豆類(lèi)、樹(shù)類(lèi)的種子培育出可以食用的“芽菜”，也稱(chēng)“活體蔬菜”；品種豐富、營(yíng)養(yǎng)全面，深受廣大消費(fèi)者的喜愛(ài)，因豆芽適合作坊及工廠化生產(chǎn)，近年來(lái)各地頻繁出現(xiàn)了黑作坊“毒豆芽”事件，即在小作坊生產(chǎn)過(guò)程中非法添加6 -芐基腺嘌呤（6-BA），俗稱(chēng)“無(wú)根素”。6 - 芐基腺嘌呤是無(wú)根素的主要成分之一，是人工合成的一種細(xì)胞分裂素，能使豆芽細(xì)胞快速分裂的植物激素類(lèi)成分，通過(guò)刺激細(xì)胞分裂引起植物生長(zhǎng)和發(fā)育，抑制呼吸激酶，在豆芽的生長(zhǎng)過(guò)程中使用可促進(jìn)芽的生長(zhǎng)，抑制根的形成，使豆芽芽體粗大且白嫩無(wú)根[1]，并且能起到殺菌作用，從而延長(zhǎng)綠色蔬菜的保鮮。人體過(guò)量攝入6 - 芐基腺嘌呤，會(huì)刺激皮膚黏膜，損傷食道和胃黏膜，引起惡心、嘔吐等癥狀[2]，對(duì)眼睛和呼吸道也有一定的刺激傷害性。2011 年，國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 2760—2011 將6 - 芐基腺嘌呤從豆芽允許使用的食品添加劑名單中剔除。《國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局 農(nóng)業(yè)部 國(guó)家衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì)關(guān)于豆芽生產(chǎn)過(guò)程中禁止使用6 - 芐基腺嘌呤等物質(zhì)的公告（2015 年第11 號(hào)）》等標(biāo)準(zhǔn)及產(chǎn)品明示標(biāo)準(zhǔn)和指標(biāo)的要求也明確規(guī)定了豆芽生產(chǎn)過(guò)程中禁止添加6 - 芐基腺嘌呤等物質(zhì)[3]。不法商販及沒(méi)有相關(guān)知識(shí)的小作坊，為了降低豆芽生長(zhǎng)周期、提高產(chǎn)率，仍舊會(huì)在豆芽的培育過(guò)程中添加6 - 芐基腺嘌呤，從近些年來(lái)抽檢食用農(nóng)產(chǎn)品中豆芽的不合格率可以看出，對(duì)豆芽中6 - 芐基腺嘌呤殘留量的檢測(cè)和監(jiān)管十分重要。

目前，檢測(cè)6-BA 的方法有液相色譜- 串聯(lián)質(zhì)譜法和高效液相色譜法，采用高效液相色譜- 串聯(lián)質(zhì)法檢測(cè)豆芽中6-BA 的殘留量，并依據(jù)《化學(xué)分析中不確定度的評(píng)估指南》[4]《測(cè)量不確定度評(píng)定與表示》 JJF 1059.1—2012[5]的相關(guān)規(guī)定對(duì)該方法的不確定度進(jìn)行評(píng)定，進(jìn)行不確定度的計(jì)算和分析，找出引入不確定度的主要因素，從而完善檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

賽默飛TSQ TCC-3000RS 型號(hào)液相色譜- 質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國(guó)Thermo 公司產(chǎn)品；電噴霧離子源（ESI）、H2100R 型高速離心機(jī)、Proseers 型純水機(jī)、miniRotar500s 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀；XPR205/A 型梅特勒-托利多電子天平，BSA224S 型塞多利斯電子天平。

6 - 芐基腺嘌呤（6-BA） 標(biāo)準(zhǔn)品，TMstandard公司提供；色譜純乙腈、色譜純甲醇、色譜純甲酸，Thermo scientific GOLD HILIC C18150 μm×3.0 μm×3 μm 色譜柱。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配置

稱(chēng)取標(biāo)品1 mL 置于10 mL 容量瓶中，用甲醇溶解并定容，配制成質(zhì)量濃度為10 μg/mL 的儲(chǔ)備溶液。根據(jù)試驗(yàn)將儲(chǔ)備液稀釋成1 μg/mL，再用空白基質(zhì)提取液逐級(jí)稀釋至10，30，50，100，200 ng/mL標(biāo)準(zhǔn)使用溶液。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 樣品制備方法

準(zhǔn)確稱(chēng)取搗碎的試樣5.00 g 于50 mL 聚丙烯離心管中，加入乙腈20 mL，于旋渦混合器上渦旋2 min，加入甲酸0.4 mL，再渦旋2 min，以轉(zhuǎn)速4 000 r/min離心5 min，上清液轉(zhuǎn)移至100 mL 梨形瓶中，于40 ℃條件下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至約2.5 mL，轉(zhuǎn)移至刻度試管中，用甲醇定容至5 mL，過(guò)0.22 μm 有機(jī)濾膜，供液相色譜- 串聯(lián)質(zhì)譜儀分析[6]。

1.3.2 液相色譜條件

色譜柱：Thermo scientific GOLD HILIC C18色譜柱（150 μm×3.0 μm×3 um）；柱溫40 ℃；進(jìn)樣量2 μL，流速0.3 μL/min，進(jìn)樣量2 μL，流動(dòng)相：A相為乙腈；B 相為0.1%甲酸水；流速0.3 mL/min，梯度洗脫0～2 min，75%B；2～4 min，25%B；4～5 min，25%B；5.0～5.1 min，75%B；5.1～6.0 min，75%B。

1.3.3 質(zhì)譜條件

電噴霧離子源（ESI），負(fù)離子模式；質(zhì)譜掃描方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式（MRM）；離子源溫度325 ℃，離子源電壓3 500 V，鞘氣SHeath Gas(Arb)：40；Aux Gas(Arb)：10；Sweep Gas(Arb)：1；定量離子對(duì)為（m/z） 224.08＞133.07 碰撞能量22.4 V；定性離子對(duì)為（m/z） 224.08＞106 碰撞能量33.9 V。儀器工作軟件為T(mén)race Finder。

1.3.4 數(shù)學(xué)模型

樣品中6-BA 殘留量的計(jì)算公式為：

式中：X——樣品中6-BA 的殘留量，mg/kg；

C——目標(biāo)物標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的質(zhì)量濃度，mg/L；

A——試樣測(cè)定液中目標(biāo)物定量離子的峰面積；

AS——標(biāo)準(zhǔn)工作溶液中目標(biāo)物定量離子的峰面積；

V——試樣溶液定容體積，mL；

m——試樣溶液所代表試樣的量，g；

f——待測(cè)組分的回收率，%；

R——稀釋倍數(shù)（R=1）。

2 結(jié)果與分析

2.1 測(cè)量不確定度的來(lái)源

根據(jù)數(shù)學(xué)模型并結(jié)合試驗(yàn)方法分析，影響豆芽中6 - 芐基腺嘌呤殘留量的不確定度主要有以下幾個(gè)方面。

2.1.1 前處理樣品稱(chēng)量引入的不確定度Urel(m)

2.1.3 配制6- BA 標(biāo)準(zhǔn)溶液過(guò)程中引入的不確定度

（1） 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)純度引入的不確定度Urel(p)。此次標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)使用的是TMS 壇墨質(zhì)檢標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中心生產(chǎn)的編號(hào)為21110304 的甲醇中6-BA。根據(jù)標(biāo)物證書(shū)可知6-BA 的不確定度為3%。

（2） 儲(chǔ)備液配制過(guò)程中引入的不確定度Urel(W1)。

（3） 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)配制引入的不確定度Urel(W2)。標(biāo)準(zhǔn)工作液由豆芽空白基質(zhì)提取液稀釋儲(chǔ)備液配制而成。分別用量程為10 μL 和100 μL 的移液槍精密量取儲(chǔ)備液（質(zhì)量濃度1 μg/mL） 10，30，40，50，100，200 μL，用空白基質(zhì)提取液定容至1.0 mL，作為基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液S0、S1-S5。質(zhì)量濃度依次為0，10，30，50，100，200 ng/mL。

2.1.4 根據(jù)擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)求得樣品質(zhì)量濃度引入的不確定度U(Y)

將6-BA 5 個(gè)質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，每個(gè)質(zhì)量濃度測(cè)定3 次，得到相應(yīng)的峰面積（見(jiàn)表1）。采用最小二乘法擬合，得到標(biāo)準(zhǔn)線(xiàn)性回歸方程Y=1.118×104X-1 747，R=0.998 3。將被測(cè)樣品平行測(cè)3 次，所得峰面積在標(biāo)準(zhǔn)工作曲線(xiàn)上求得樣品質(zhì)量濃度再換算成含量，其含量分別為0.139，0.111，0.127 mg/kg，平均值X=0.126 mg/kg。

表1 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)回歸方程及線(xiàn)性表

標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)回歸方程及線(xiàn)性表見(jiàn)表1。

標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)擬合產(chǎn)生的不確定度計(jì)算如下：

標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度殘差的標(biāo)準(zhǔn)偏差為

式中：m——標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度點(diǎn)個(gè)數(shù)，m=5；n 為標(biāo)準(zhǔn)溶液測(cè)定次數(shù)，n=3；p 為待測(cè)物質(zhì)測(cè)定次數(shù)，p=3；Ci 是標(biāo)準(zhǔn)溶液的平均質(zhì)量濃度；Cx 為待測(cè)樣品質(zhì)量濃度，a 為斜率，b 為截距；Ai 為標(biāo)準(zhǔn)溶液的峰面積。Sy(6-BA)=2 380.4，U(Y)=0.069 27.

2.1.5 回收率測(cè)試過(guò)程中引入的不確定度U(f)

按照方法，在5 份樣品中各加入質(zhì)量濃度為0，5，10，50，100 ng/mL 的標(biāo)準(zhǔn)溶液，測(cè)定加標(biāo)回收率分別為0，83.3%，88.2%，93.5%，95.3%。平均回收率f=90.0%，所建方法準(zhǔn)確可靠。

平均值測(cè)量的標(biāo)準(zhǔn)偏差：

回收率f 引起的標(biāo)準(zhǔn)相對(duì)不確定度為Uref(f)=Sf÷f=0.030 1。

2.1.6 檢測(cè)儀器引入的相對(duì)不確定度Uref(r)

根據(jù)《液相色譜- 串聯(lián)質(zhì)譜 儀器校準(zhǔn)證書(shū)》可知，Uref(r)=2%。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)不確定度的合成與擴(kuò)展

2.2.1 合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度

由于上述各因素的不確定度互不相關(guān)，合成豆芽中六芐基腺嘌呤含量的相對(duì)不確定度為：

合成不確定度：

2.2.2 擴(kuò)展不確定度

在95%的置信水平下，k=2，則擴(kuò)展不確定度U=k×Uh=0.026 0 mg/kg。

2.2.3 測(cè)定結(jié)果

測(cè)定豆芽樣品6-BA 含量為：

3 結(jié)論

以豆芽為樣品，采用超高效液相色譜- 串聯(lián)質(zhì)譜法對(duì)檢測(cè)豆芽中6 - 芐基腺嘌呤殘留量進(jìn)行測(cè)定，通過(guò)不確定度評(píng)定分析，結(jié)果顯示儀器及標(biāo)準(zhǔn)溶液配制和通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)擬合求得樣品質(zhì)量濃度值過(guò)程引起的不確定度最大，其次是前處理及標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液和混合標(biāo)準(zhǔn)中間液配制過(guò)程帶入的不確定度。因此，在實(shí)際試驗(yàn)中，要對(duì)樣品前處理規(guī)范流程操作，選用精密性高的儀器進(jìn)行檢測(cè)，并對(duì)儀器進(jìn)行定期保養(yǎng)與清洗，定期開(kāi)展檢定校準(zhǔn)，以提高儀器的靈敏度，選用高精密度天平精密稱(chēng)量，高精密度移液槍、容量瓶進(jìn)行溶液的配置，并定期進(jìn)行校準(zhǔn)工作，從而降低測(cè)量的不確定度，提高檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確度和可靠性。