液相色譜- 串聯質譜法測定豆芽中6 - 芐基腺嘌呤殘留量的不確定度

常 薇，鄒 力

（陜西省產品質量監督檢驗研究院，陜西西安 710000）

豆芽是各種谷類、豆類、樹類的種子培育出可以食用的“芽菜”，也稱“活體蔬菜”；品種豐富、營養全面，深受廣大消費者的喜愛，因豆芽適合作坊及工廠化生產，近年來各地頻繁出現了黑作坊“毒豆芽”事件，即在小作坊生產過程中非法添加6 -芐基腺嘌呤（6-BA），俗稱“無根素”。6 - 芐基腺嘌呤是無根素的主要成分之一，是人工合成的一種細胞分裂素，能使豆芽細胞快速分裂的植物激素類成分，通過刺激細胞分裂引起植物生長和發育，抑制呼吸激酶，在豆芽的生長過程中使用可促進芽的生長，抑制根的形成，使豆芽芽體粗大且白嫩無根[1]，并且能起到殺菌作用，從而延長綠色蔬菜的保鮮。人體過量攝入6 - 芐基腺嘌呤，會刺激皮膚黏膜，損傷食道和胃黏膜，引起惡心、嘔吐等癥狀[2]，對眼睛和呼吸道也有一定的刺激傷害性。2011 年，國家標準GB 2760—2011 將6 - 芐基腺嘌呤從豆芽允許使用的食品添加劑名單中剔除?！秶沂称匪幤繁O督管理總局 農業部 國家衛生和計劃生育委員會關于豆芽生產過程中禁止使用6 - 芐基腺嘌呤等物質的公告（2015 年第11 號）》等標準及產品明示標準和指標的要求也明確規定了豆芽生產過程中禁止添加6 - 芐基腺嘌呤等物質[3]。不法商販及沒有相關知識的小作坊，為了降低豆芽生長周期、提高產率，仍舊會在豆芽的培育過程中添加6 - 芐基腺嘌呤，從近些年來抽檢食用農產品中豆芽的不合格率可以看出，對豆芽中6 - 芐基腺嘌呤殘留量的檢測和監管十分重要。

目前，檢測6-BA 的方法有液相色譜- 串聯質譜法和高效液相色譜法，采用高效液相色譜- 串聯質法檢測豆芽中6-BA 的殘留量，并依據《化學分析中不確定度的評估指南》[4]《測量不確定度評定與表示》 JJF 1059.1—2012[5]的相關規定對該方法的不確定度進行評定，進行不確定度的計算和分析，找出引入不確定度的主要因素，從而完善檢測結果的準確性。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

賽默飛TSQ TCC-3000RS 型號液相色譜- 質譜聯用儀，美國Thermo 公司產品；電噴霧離子源（ESI）、H2100R 型高速離心機、Proseers 型純水機、miniRotar500s 型旋轉蒸發儀；XPR205/A 型梅特勒-托利多電子天平，BSA224S 型塞多利斯電子天平。

6 - 芐基腺嘌呤（6-BA） 標準品，TMstandard公司提供；色譜純乙腈、色譜純甲醇、色譜純甲酸，Thermo scientific GOLD HILIC C18150 μm×3.0 μm×3 μm 色譜柱。

1.2 標準溶液的配置

稱取標品1 mL 置于10 mL 容量瓶中，用甲醇溶解并定容，配制成質量濃度為10 μg/mL 的儲備溶液。根據試驗將儲備液稀釋成1 μg/mL，再用空白基質提取液逐級稀釋至10，30，50，100，200 ng/mL標準使用溶液。

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品制備方法

準確稱取搗碎的試樣5.00 g 于50 mL 聚丙烯離心管中，加入乙腈20 mL，于旋渦混合器上渦旋2 min，加入甲酸0.4 mL，再渦旋2 min，以轉速4 000 r/min離心5 min，上清液轉移至100 mL 梨形瓶中，于40 ℃條件下旋轉蒸發至約2.5 mL，轉移至刻度試管中，用甲醇定容至5 mL，過0.22 μm 有機濾膜，供液相色譜- 串聯質譜儀分析[6]。

1.3.2 液相色譜條件

色譜柱：Thermo scientific GOLD HILIC C18色譜柱（150 μm×3.0 μm×3 um）；柱溫40 ℃；進樣量2 μL，流速0.3 μL/min，進樣量2 μL，流動相：A相為乙腈；B 相為0.1%甲酸水；流速0.3 mL/min，梯度洗脫0～2 min，75%B；2～4 min，25%B；4～5 min，25%B；5.0～5.1 min，75%B；5.1～6.0 min，75%B。

1.3.3 質譜條件

電噴霧離子源（ESI），負離子模式；質譜掃描方式：多反應監測模式（MRM）；離子源溫度325 ℃，離子源電壓3 500 V，鞘氣SHeath Gas(Arb)：40；Aux Gas(Arb)：10；Sweep Gas(Arb)：1；定量離子對為（m/z） 224.08＞133.07 碰撞能量22.4 V；定性離子對為（m/z） 224.08＞106 碰撞能量33.9 V。儀器工作軟件為Trace Finder。

1.3.4 數學模型

樣品中6-BA 殘留量的計算公式為：

式中：X——樣品中6-BA 的殘留量，mg/kg；

C——目標物標準工作溶液的質量濃度，mg/L；

A——試樣測定液中目標物定量離子的峰面積；

AS——標準工作溶液中目標物定量離子的峰面積；

V——試樣溶液定容體積，mL；

m——試樣溶液所代表試樣的量，g；

f——待測組分的回收率，%；

R——稀釋倍數（R=1）。

2 結果與分析

2.1 測量不確定度的來源

根據數學模型并結合試驗方法分析，影響豆芽中6 - 芐基腺嘌呤殘留量的不確定度主要有以下幾個方面。

2.1.1 前處理樣品稱量引入的不確定度Urel(m)

2.1.3 配制6- BA 標準溶液過程中引入的不確定度

（1） 標準物質純度引入的不確定度Urel(p)。此次標準物質使用的是TMS 壇墨質檢標準物質中心生產的編號為21110304 的甲醇中6-BA。根據標物證書可知6-BA 的不確定度為3%。

（2） 儲備液配制過程中引入的不確定度Urel(W1)。

（3） 標準曲線配制引入的不確定度Urel(W2)。標準工作液由豆芽空白基質提取液稀釋儲備液配制而成。分別用量程為10 μL 和100 μL 的移液槍精密量取儲備液（質量濃度1 μg/mL） 10，30，40，50，100，200 μL，用空白基質提取液定容至1.0 mL，作為基質混合標準工作溶液S0、S1-S5。質量濃度依次為0，10，30，50，100，200 ng/mL。

2.1.4 根據擬合標準曲線求得樣品質量濃度引入的不確定度U(Y)

將6-BA 5 個質量濃度的標準工作溶液，每個質量濃度測定3 次，得到相應的峰面積（見表1）。采用最小二乘法擬合，得到標準線性回歸方程Y=1.118×104X-1 747，R=0.998 3。將被測樣品平行測3 次，所得峰面積在標準工作曲線上求得樣品質量濃度再換算成含量，其含量分別為0.139，0.111，0.127 mg/kg，平均值X=0.126 mg/kg。

表1 標準曲線回歸方程及線性表

標準曲線回歸方程及線性表見表1。

標準曲線擬合產生的不確定度計算如下：

標準溶液濃度殘差的標準偏差為

式中：m——標準溶液濃度點個數，m=5；n 為標準溶液測定次數，n=3；p 為待測物質測定次數，p=3；Ci 是標準溶液的平均質量濃度；Cx 為待測樣品質量濃度，a 為斜率，b 為截距；Ai 為標準溶液的峰面積。Sy(6-BA)=2 380.4，U(Y)=0.069 27.

2.1.5 回收率測試過程中引入的不確定度U(f)

按照方法，在5 份樣品中各加入質量濃度為0，5，10，50，100 ng/mL 的標準溶液，測定加標回收率分別為0，83.3%，88.2%，93.5%，95.3%。平均回收率f=90.0%，所建方法準確可靠。

平均值測量的標準偏差：

回收率f 引起的標準相對不確定度為Uref(f)=Sf÷f=0.030 1。

2.1.6 檢測儀器引入的相對不確定度Uref(r)

根據《液相色譜- 串聯質譜 儀器校準證書》可知，Uref(r)=2%。

2.2 標準不確定度的合成與擴展

2.2.1 合成標準不確定度

由于上述各因素的不確定度互不相關，合成豆芽中六芐基腺嘌呤含量的相對不確定度為：

合成不確定度：

2.2.2 擴展不確定度

在95%的置信水平下，k=2，則擴展不確定度U=k×Uh=0.026 0 mg/kg。

2.2.3 測定結果

測定豆芽樣品6-BA 含量為：

3 結論

以豆芽為樣品，采用超高效液相色譜- 串聯質譜法對檢測豆芽中6 - 芐基腺嘌呤殘留量進行測定，通過不確定度評定分析，結果顯示儀器及標準溶液配制和通過標準曲線擬合求得樣品質量濃度值過程引起的不確定度最大，其次是前處理及標準品儲備液和混合標準中間液配制過程帶入的不確定度。因此，在實際試驗中，要對樣品前處理規范流程操作，選用精密性高的儀器進行檢測，并對儀器進行定期保養與清洗，定期開展檢定校準，以提高儀器的靈敏度，選用高精密度天平精密稱量，高精密度移液槍、容量瓶進行溶液的配置，并定期進行校準工作，從而降低測量的不確定度，提高檢測結果的準確度和可靠性。