鐵死亡發生機制及其在三陰性乳腺癌治療中的研究進展

裴秀君 姚航宇 王繼榮 馬波*

近些年，越來越多的研究在乳腺領域取得了突破性進展，但乳腺癌（breast cancer，BC）全球發病率仍在上升，已成為導致女性疾病負擔的主要癌癥。三陰性乳腺癌（triple-negative breast cancer，TNBC）是目前乳腺癌分子分型中最具侵襲力的類型，其異質性高、預后差，在我國乳腺癌綜合治療及預后因素分析中尚具挑戰。因此，為三陰性乳腺癌患者開發出更新型的治療藥物，提供更精準的干預措施尤為迫切。鐵死亡（ferroptosis）是2012 年提出的細胞新型死亡方式，隨著這一概念的提出，人們發現鐵死亡在腫瘤發生、發展及多重耐藥方面發揮著重要作用。近些年越來越多靶向鐵死亡的活性藥物被開發應用。通過藥物影響使細胞以這種獨特高效的方式死亡，已成為一種頗有前景的癌癥藥物研究策略。本文將對鐵死亡發生機制及其在三陰性乳腺癌治療中的作用進行綜述。

1 鐵死亡概述

1.1 鐵死亡的發現 2003 年DOLMA 等［1］發現了一種新型化合物Erastin，由這種化合物所誘導的細胞死亡都是非凋亡性的。隨后YANG 等［2］發現了另一種可有效引起細胞發生此種死亡形式的化合物（Ras-selective-lethal compound 3，RSL3）。之后越來越多的研究發現細胞以這種未知的方式死亡，這些現象象征著一種新型細胞死亡形式的出現，且該過程擁有獨特的形態學變化，但尚不清楚其機制。直至2012 年DIXON等［3］根據其生物學特點將其正式命名為鐵死亡：一種鐵依賴性的，以細胞內活性氧堆積為特征的細胞死亡。

1.2 鐵死亡的特征 鐵死亡區別于傳統細胞死亡，頗有自己的獨到之處。其形態學特征表現為：線粒體體積變小、膜密度增加、嵴顯著減少甚至消失，而細胞核大小又接近正常，無核濃縮或鮮有核染色質邊緣化，這正是鐵死亡區別于凋亡、壞死、自噬等過程的主要形態學特征［3］；其生化特征主要表現為：細胞內鐵和脂質活性氧（lipid reactive oxygen species，Lip-ROS）積累，胱氨酸谷氨酸反向轉運體（system Xc-）抑制以及NADPH 氧化增加等；其次，該過程不能在短期內被細胞傳統死亡過程的抑制劑所抑制，卻可以通過鐵螯合劑、抗氧化劑等加以逆轉［1］。

2 三陰性乳腺癌細胞鐵死亡機制

鐵死亡過程的發生規律及其演變過程相當復雜，目前認為不同信號通路最終都會通過直接或間接影響谷胱甘肽過氧化物酶的抗氧化活性，降低細胞整體抗氧化能力，致使脂質過氧化反應增加，Lip-ROS 堆積，最終引起細胞鐵死亡。

2.1 通過選擇性抑制System Xc- 誘導TNBC 細胞鐵死亡 1980 年System Xc-在人類胎兒成纖維細胞中被發現［4］，其是由跨膜轉運蛋白SLC7A11 和調節蛋白SLC3A2L 經磷酸二硫鍵連接而成的異二聚體，介導胱氨酸進入細胞并將谷氨排出。腫瘤細胞胞外半胱氨酸含量不足時，可由轉硫途徑提供半胱氨酸（Cys），調節細胞鐵死亡［5］。抑制System Xc-對胞外胱氨酸的轉運，胞內Cys 含量迅速減少，致使谷胱甘肽（glutathione，GSH）合成進一步受阻，而GSH 又是谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GPXs）發揮作用的必要輔助因子，因此導致腫瘤細胞GPXs 活性進一步降低，細胞抗過氧化能力相應下降，細胞ROS 過度積累，從而誘發腫瘤細胞鐵死亡。經典高效的鐵死亡誘導劑Erastin 通過選擇性抑制System Xc-活性誘導鐵死亡［3］。有研究表明System Xc-的兩個亞基表達水平決定了GPX4 在BC 中的表達，因此根據System Xc-狀態靶向BC 細胞鐵死亡為抗BC 治療帶來了新希望［6］。在低雌激素受體表達的BC 中，YU 等［7］發現柳氮磺胺吡啶可作為System Xc-抑制劑，引起BC 細胞鐵死亡。HASEGAWA等［8］認為，下調MUCI-C/System Xc-信號通路同樣可以抑制TNBC 細胞活性甚至殺滅TNBC 細胞，從而使致瘤性細胞生長及轉移得到控制。因此，選擇性抑制TNBC 細System Xc-從而誘導鐵死亡發生或許是攻克TNBC 的新方向。

2.2 直接作用于TNBC 細胞GPX4 GPXs 家族包括GPX1-GPX8，DOLL 等［9］認為，GPX4 在鐵死亡中扮演著重要角色。GPX4 在GSH 輔助下，將游離H2O2和Lip-ROS 分別降解為H2O 和相應的醇，從而有效降低胞內脂質氫過氧化物及有機氫過氧化物水平，避免由Fenton 反應產生過量活性氧所致的鐵死亡［10］。與Erastin 作用機制不同，RSL3 能夠選擇性作用于靶細胞的GPX4 受體部位［11］，誘發細胞鐵死亡。TNBC是一類富有鐵及脂質的腫瘤，誘導鐵死亡的發生對TNBC 治療極其重要。有研究表明PTL 的衍生物DMOCPTL，可通過泛素化GPX4 顯著抑制TNBC 細胞的增殖從而誘導細胞鐵死亡和凋亡［12］。YANG 等［13］通過多組學測序發現TNBC 亞型LAR 腫瘤與鐵死亡存在明顯相關性，其主要鐵死亡抑制途徑與GSH 有關，且該過程由GPX4 所介導。除此之外，有研究表明在無家族史的BC 患者中ACSL4/GPX4 聯合水平可作為接受新輔助化療患者病理完全緩解的新型預測和預后生物標志物［14］。因此，直接靶向GPX4 同樣可以高效誘發TNBC 細胞鐵死亡。

2.3 促進TNBC 細胞Lip-ROS 堆積 在正常細胞生理周期中，脂質氧化與還原處于動態平衡狀態。但隨著腫瘤細胞癌變，這種平衡狀態將會被打破。過量的活性氧自由基會對細胞成分產生不利修飾，如脂質、蛋白質和DNA 損傷［15-16］等。ROS 可產生大量損傷細胞脂質膜層結構的多不飽和脂肪酸（polyunsaturated fatty acids，PUFAs）從而形成大量Lip-ROS，當胞內存在大量Lip-ROS 時就會引起鐵死亡，這就是“脂質過氧化”。MA 等［17］報道，西拉明和拉帕替尼可使ROS 增多誘導細胞鐵死亡，同時CDO1 過表達時BC 細胞GSH 水平降低，導致ROS 進一步積累，從而加劇BC 細胞鐵死亡。此外，有研究發現與腫瘤周圍脂肪細胞共培養的TNBC 細胞表現出對鐵死亡抵抗現象，且該過程依賴脂肪細胞分泌的脂肪酸合成酶ACSL3［18］。雖然Lip-ROS 的過量積累在鐵死亡研究中發揮著重要的作用，但過多的Lip-ROS 到底來源于線粒體膜、內質網膜、還是其他細胞組織的膜性結構目前尚不明確。高通量測序分析發現小分子抗氧化劑如Ferropstatin-1 可以直接降低體內Lip-ROS 的堆積，從而成功阻斷由Erastin 及RSL3等化學物質誘導而發生的鐵死亡［3］。此外，PUFAs 還可以通過酶促或非酶促的氧化反應，形成脂質氫過氧化物。此時細胞的胞質分子結構中如果存在著大量的鐵離子，脂質氫過氧化物就會進一步產生有毒性的脂質自由基，從而造成細胞損傷。且這些自由基能轉移鄰近PUFAs 的質子，啟動細胞新一輪的脂質氧化反應最終造成一個更嚴重的細胞氧化性損傷。因此通過各種途徑加劇TNBC 細胞Lip-ROS 堆積，是TNBC綜合治療的一部分。

2.4 增加TNBC 細胞鐵含量 維持機體鐵離子平衡是正常生理功能所必需的。血液中游離的Fe3+與轉鐵蛋白（transferrin，TF）結合，通過轉鐵蛋白受體（transferrin receptor，TFRC）形成內涵體進入胞內。隨后Fe3+在鐵還原酶前列腺六次跨膜蛋白3（STEAP3）的作用下被還原為Fe2+，從內涵體轉運到胞質溶膠中，然后通過細胞膜上的膜鐵轉運蛋白（ferroportin）泵出，或儲存于胞質內的鐵蛋白（ferritin）中。當胞內Fe2+過多時這種平衡將被打破，進一步通過Fenton 反應產生高活性羥自由基，直接與細胞膜結構中的PUFA 進行反應，產生大量的Lip-ROS，從而進一步引發鐵死亡。有研究表明，在TNBC 細胞系MDA-MB-231 細胞中高飽和度乳鐵蛋白可以通過增加細胞鐵含量，促進ROS 的生成，導致了細胞鐵死亡等現象的發生。然而低飽和度乳鐵蛋白又可以通過上調SLC7a11的表達，增加GSH 的生成，從而抑制細胞鐵死亡現象的發生［19］。除此之外，Yu 等證實了抗HER2 治療后的關鍵基因成纖維細胞生長因子受體4（FGFR4）可通過β-catenin/TCF4-SLC7A11/FPN1 軸加速胱氨酸攝取和Fe2+外排。抑制FGFR4可導致不穩定鐵池積累，從而觸發細胞鐵死亡［20］。因此，增加細胞鐵含量，誘發鐵死亡發生或許可以有效阻止BC 患者的惡性進展。

2.5 p53 介導的TNBC 細胞鐵死亡 已有研究表明，多種腫瘤抑制因子可以促進細胞對鐵死亡的敏感性。因此，腫瘤抑制可能是鐵死亡先天性生理功能［21］。研究發現p53 除了誘導細胞凋亡，還可以誘導細胞鐵死亡。JIANG 等［22］認為，p53可選擇性抑制System Xc-亞基SLC7A11 的異常表達，顯著抑制GPX4 活性，從而引起細胞鐵死亡。然而近期研究發現，p53 熱點突變蛋白p53R175H 可與轉錄因子BACH1 特異性結合。該過程既可以解除BACH1 對SLC7A11 的下調作用，抑制鐵死亡，促進腫瘤生長；又可以上調促轉移靶點的表達，促進腫瘤轉移［23］。因此，針對不同類型的p53 突變，個性化的治療方案尤為重要。在目前BC 鐵死亡研究中，p53 主要發揮促進鐵死亡作用，但實際上該過程是否也存在雙重調控作用呢？更深入的研究或許可以為BC 患者提供更精準的個性化治療方案。

3 鐵死亡在三陰性乳腺癌治療中的作用

3.1 在放化療中增強抗癌作用 TNBC 患者目前仍不能從傳統靶向治療中明顯獲益，化療仍是其積極選擇。但腫瘤細胞大量的凋亡逃逸使得多數腫瘤細胞逐漸對化療藥物產生耐藥性。如何克服此類化療耐藥現象，使藥物發揮最大治療作用將成為新型抗腫瘤藥物亟待解決的問題。使腫瘤細胞以鐵死亡的形式抑制其增殖，是否同樣可以增強抗癌作用呢？CHEN等［24］將經典的鐵死亡誘導劑Erastin 與他莫昔芬聯合應用，發現Erastin 可以與他莫昔芬協同對抗癌細胞。因此，鐵死亡誘導劑與化療藥物的聯合應用，或許是解決BC 細胞化療耐藥的一種方法。在放療增敏中鐵死亡過程同樣發揮重要作用，其中乳鐵蛋白（lactoferrin，Lf）是一種多效性蛋白質，鐵飽和型乳鐵蛋白（holo-lactoferrin，Holo-Lf）則是Lf 的飽和結構形式，ZHANG 等［19］在多項研究中發現，Holo-Lf 在TNBC 的聯合治療中發揮重要作用，可以有效增強TNBC 細胞內的總鐵含量，促進腫瘤細胞ROS 和脂質代謝中的過氧化終產物丙二醛酶（MDA）的生成，致使腫瘤細胞鐵死亡。此外用Holo-Lf 聯合放療劑量4Gy 處理MDA-MB-231 細胞，可使Lip-ROS生成水平顯著升高，表明Holo-L 聯合放療確實能通過促進鐵死亡，增強腫瘤細胞對放療的敏感性。

3.2 在免疫治療中增強抗癌作用 2019 年邵志敏教授團隊將TNBC 分為4 個不同分型，包括間質樣亞型、管腔雄激素受體亞型、免疫調節亞型、基底樣免疫抑制亞型。這使TNBC的分型變得更加科學與精細，治療方式變得更加全面而精準。在此基礎上，此團隊在TNBC 不同亞型鐵死亡領域的研究中取得了突破性進展。研究發現管腔雄激素受體亞型，以雄激素受體活性上調和管腔樣基因表達異常為共同特征，可通過有效激活氧化磷脂酰乙醇胺和調節谷胱甘肽代謝酶活性（特別是GPX4）來激活或誘導BC 細胞鐵死亡，同時也可以通過GPX4 抑制直接誘導鐵死亡。此期研究最富有臨床意義的發現是抑制GPX4 可以通過與抗PD1 免疫治療聯合應用進一步增強抗腫瘤免疫治療效果，這將為難治性TNBC 開展臨床藥物治療探索出新的研究策略［13］。免疫治療近些年在癌癥治療中發揮了一定作用，如何促進癌癥免疫治療的應用是目前需要攻克的難點。有學者提出一種較為獨特的PDTAC 策略，該策略由三個可替換模塊組成，以協助誘導蛋白質的光降解。基于PDTAC 策略的GPX4 靶向降解為誘導鐵死亡提供一種新的方法［25］。

3.3 在中藥材中增強抗癌作用 隨著中華傳統醫學的傳承與發展，中藥材在臨床治療中發揮的作用越來越大。枸杞多糖是我國傳統中藥材，有研究表明，其提取物中包含一種抗腫瘤多糖成分，可選擇性通過蛋白溶質載體家族7 成員11（SLC7A11）和谷胱甘肽的過氧化酶4（x CT/GPX4）途徑間接介導TNBC細胞鐵死亡［26］。這將轉化為TNBC患者的現代中藥靶向治療，為抗癌研究提供了新思路。舒肝寧注射液（SGNI）是臨床治療肝臟疾病的中成藥，由于肝臟保護和免疫改善，也被廣泛用于癌癥輔助治療。有研究表明與非TNBC 細胞和正常細胞相比，SGNI 能以HO-1 依賴的方式誘導TNBC 細胞氧化應激并促進細胞內不穩定鐵池積累，從而導致TNBC 細胞鐵死亡［27］。此外，重樓皂苷［28］、人參皂苷CK［29］、隱丹參酮［30］等均被證實可直接誘導或通過干擾不同信號通路間的傳導對TNBC 細胞鐵死亡產生一定影響，抑制并阻礙腫瘤細胞增殖。

3.4 在新型藥物傳遞系統中增強抗癌作用 近些年，外泌體成為國內外研究熱點，研究表明外泌體在阻止腫瘤細胞惡性進展方面發揮重要作用。與此同時Erastin 作為鐵死亡誘導劑，存在水溶性差、生物利用率低等缺點。因此，需要一種有效的藥物遞送方法來克服Erastin 的障礙。YU 等［31］使用載有Erastin 的外泌體（Erastin@FA-exo），將Erastin 高效傳送至MDA-MB-231 細胞相應靶點，從而精準高效誘導MDAMB-231 細胞發生鐵死亡。RSL3 同樣存在水溶性低、生物相容性差等缺點，使得GPX4 抑制劑在體內應用受限。為使TNBC 細胞克服傳統化療抗性，有學者開發了一種主動靶向的小分子自組裝納米藥物。該藥物可同時傳遞化療藥物喜樹堿（CPT）、鐵催化劑（Fc）和GPX4 抑制劑（RSL3），形成三組分的納米藥物RSL3@CPT-SS-Fc，在腫瘤環境中較多的GSH 可以分解納米藥物，使細胞同時發生鐵死亡與凋亡［32］。因此，聯合新型藥物傳遞系統更精準地將藥物傳送至相應靶點協助增強抗癌效果，將成為腫瘤領域新型治療策略。

4 小結

近些年鐵死亡被定義為細胞新型死亡方式，成為醫學研究與生物學研究熱點。TNBC 缺乏特異性靶點，對化療藥物存在一定耐藥性，成為乳腺癌領域的難治性類型。隨著藥物應用研究的不斷發展，鐵死亡在傳統中藥材中可以增強抗癌敏感性；使用新型藥物遞送方法可以更加安全精準地傳送藥物至最理想作用位點。這些研究與發現都為腫瘤領域臨床治療及藥物應用帶來了新希望。