氨基酸增值尿素對水稻生長和根系分泌物的影響

于雪嬌, 胡冰潔, 袁 宏, 葉文玲, 張國漪

(安徽農業大學資源與環境學院,安徽 合肥 230001)

水稻是重要的糧食作物,全球一半以上人口以稻米為主食[1]。在水稻的種植過程中,尿素施用量較大,對環境造成了嚴重的影響。前人研究發現,以植物源(腐植酸、氨基酸、海藻提取物等)為增效載體,將尿素、復合肥等普通化學肥料進行改性增效而形成的增值肥料,在提高肥料利用率的同時,還能提升作物產量和品質[2]。

工業生產氨基酸純品時會產生大量的發酵尾液[3],氨基酸發酵尾液中有蛋白質、菌體、氨基酸等營養物質,具有較高的回收利用價值。新型氨基酸增值尿素(Amino acid enhanced urea, AU)是在尿素熔融過程中加入氨基酸而創制的一種成本低、增效好的尿素產品。有研究結果表明,氨基酸肥料效果好、肥效快并且能夠一定程度改善作物品質和生態環境[4]。因此,通過氨基酸與氮肥復配研制增效氮肥,是減肥增效、提升氮素利用率的重要技術途徑。

土壤微生物是土壤中的生命成分,其數量高低在一定程度上反映了土壤的肥力水平高低[5]。根系分泌物是植物影響根際微生物環境的重要物質[6],通過影響微生物生長、繁殖及群落種類,進而影響作物生長[7]。

當前氨基酸肥料的應用主要有葉面噴施氨基酸肥料、化肥減氮配施氨基酸肥料等,對氨基酸肥料肥效的研究主要集中在研究植株生長以及作物的產量和品質等方面[8-9],而關于氨基酸增值尿素對根系分泌物中有機酸的影響,以及有機酸的改變與根際微生物相互作用對土壤養分影響的研究較少。本研究擬以水稻為試驗對象,通過盆栽試驗探究氨基酸增值尿素對水稻土壤理化性質、根際微生物和根系分泌有機酸的影響,以及各指標間的相關性,分析施用氨基酸增值尿素帶來的影響,以期為氨基酸增值尿素在農業生產中的應用提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試作物為水稻兩優8106。試驗于安徽農業大學農萃園盆栽基地進行,供試土壤為安徽農業大學農萃園田間土壤耕層土,土壤有機質含量為8.27 g/kg,全氮含量為1.80 g/kg,堿解氮含量為161.50 mg/kg,有效磷含量為8.39 mg/kg,速效鉀含量為180.93 mg/kg,pH值為6.81。氨基酸增值劑由中國農業科學院資源與農業區劃研究所提供,其中氨基酸含量約為35%,成分以絲氨酸、谷氨酸、纈氨酸和甘氨酸為主。所有肥料作為基肥一次性施入土壤。

1.2 試驗設計

試驗共設4個處理:不施氮肥(CK)、施用氨基酸增值劑(AA)、施用尿素(U)、施用氨基酸增值尿素(AU)。試驗用盆高18.0 cm,直徑12.5 cm的黑色小桶,每桶裝2 kg土壤,施肥情況見表1。每桶移栽10株水稻秧苗,分于5穴,每個處理重復5次。

水稻移栽后60 d進行整桶破壞性取樣,10株水稻全部取出。收集2份根際土壤,一份于-80 ℃條件下冷凍保存在無菌離心管中,用于測序分析微生物群落,另一份曬干研磨后用于測定常規理化性質。

根系分泌物的收集:用蒸餾水和無菌水清洗水稻根部后,用無菌濾紙吸干水分放入離心管中,加入50.0 ml無菌水,用錫紙包裹離心管,將離心管放在培養室中連續收集根系分泌物6 h后,將收集到的根系分泌物過0.45 μm的濾膜,去除殘根和雜質,裝入50.0 ml離心管,冷凍干燥后將樣品溶解于流動相中,再用0.22 μm的濾膜抽濾到1.5 ml進樣小瓶,冷藏等待測定。將水稻根部沖洗后,測定植株地上部分鮮質量和根系鮮質量以及根系形態,以每株數值為計量單位。

1.3 測定方法

土壤全氮含量用凱氏定氮法進行測定,銨態氮含量用氯化鉀浸提靛酚藍比色法進行測定,硝態氮含量用酚二磺酸比色法進行測定[10]。用WinRHIZO根系掃描分析系統掃描測定根系形態。

有機酸含量采用超高效液相色譜(HPLC)VARIAN Prostar和紫外檢測器測定。液相色譜測定條件為:Agilent588905-902 HC-C18色譜柱、柱溫25 ℃、流動相為KH2PO4和乙腈(體積比為99∶1)、紫外波長210 nm、進樣量20 μl。根據前期標準品的測定結果,用保留時間判斷有機酸的種類、用峰面積計算有機酸的質量濃度。

土壤微生物DNA提取及測序委托北京百邁客生物科技有限公司完成。

1.4 數據處理和分析

采用Excel 2017、SPSS(24.0)進行數據分析,利用Canoco 5、origin 2022等軟件繪圖。

2 結果與分析

2.1 氨基酸增值尿素對水稻生長的影響

表2顯示,與CK相比,施用氮肥處理的水稻株高、根長、地上部鮮質量和地下部鮮質量均增加。不同氮肥處理對水稻生長的影響存在差異,AA處理的地上部鮮質量顯著低于U處理和AU處理;AU處理的水稻株高和根長均顯著高于U處理和AA處理;AU處理的水稻地下部鮮質量顯著高于AA處理。上述研究結果表明,氨基酸增值尿素對水稻生長具有一定促進作用。

表2 氨基酸增值尿素對水稻生長的影響

2.2 氨基酸增值尿素對水稻根系的影響

表3顯示,不同氮肥處理對水稻根系生長的影響存在差異。AA處理的水稻根直徑顯著小于AU處理;U處理的水稻根投影面積最大。AU處理和U處理的水稻根表面積、根體積、根尖數均顯著高于AA處理;AU處理的水稻根體積、根尖數顯著高于U處理,分別增加25.28%和16.94%。說明氨基酸增值尿素對水稻根系生長發育具有促進作用。

表3 氨基酸增值尿素對水稻根系的影響

2.3 氨基酸增值尿素對水稻根際土壤養分的影響

表4顯示,與CK相比,施用氮肥處理的水稻根際土壤pH值均下降,表現為U

表4 氨基酸增值尿素對水稻根際土壤養分含量的影響

2.4 氨基酸增值尿素對水稻根系分泌有機酸的影響

圖1顯示,CK中水稻根系分泌的有機酸主要為草酸、檸檬酸和酒石酸,占比分別為75.58%、18.25%和6.17%,有機酸總量為72.38 μg/g;AA處理中水稻根系分泌的有機酸主要為草酸、檸檬酸、乙酸和酒石酸,占比分別為26.47%、57.51%、14.01%和2.01%,有機酸總量為118.48 μg/g;U處理中水稻根系分泌的有機酸主要為草酸、酒石酸、乙酸和蘋果酸,占比分別為5.83%、12.84%、71.22%和10.11%,有機酸總量為138.38 μg/g;AU處理中水稻根系分泌的有機酸主要為草酸、酒石酸、乙酸、檸檬酸和丁二酸,占比分別為2.54%、37.29%、40.15%、17.81%和2.21%,有機酸總量為145.34 μg/g。

施肥可以提高根系分泌的有機酸總量,且AU處理的有機酸總量最高。CK和AA處理中草酸占比較高,U處理和AU處理中草酸占比較低,乙酸占比較高。與U處理相比,AU處理的草酸和乙酸占比減少,酒石酸占比增加,分泌的有機酸種類增加。

CK、AA、U、AU見表1。圖中不同小寫字母表示不同處理間差異顯著(P<0.05)。圖1 不同施肥處理對水稻根系分泌有機酸的影響Fig.1 Effects of different fertilization treatments on organic acid secretion of rice root

2.5 水稻根系分泌的有機酸和根際土壤環境因子的冗余分析

對有機酸和土壤環境因子進行冗余分析(RDA),結果(圖2)表明,排序軸1(41.67%)和排序軸2(25.02%)累計解釋有機酸組分變異的66.69%。銨態氮含量和pH值對有機酸組分影響最大,P值分別為0.002和0.006;草酸含量與土壤pH值呈正相關,但草酸含量和土壤全氮含量、銨態氮含量、硝態氮含量呈負相關;酒石酸含量、丁二酸含量與銨態氮含量、全氮含量、硝態氮含量呈正相關,與pH值呈負相關;乙酸含量、蘋果酸含量與pH值亦呈負相關。

圖2 水稻根系分泌的有機酸組分和土壤環境因子的冗余分析Fig.2 Redundancy analysis of organic acid components secreted by rice roots and soil environmental factors

2.6 氨基酸增值尿素對水稻根際土壤菌群多樣性的影響

對不同處理下的水稻根際土壤菌群多樣性進行研究,使用QIIME軟件對物種多樣性進行分析,包括Chao1指數、Shannon指數和Simpson指數。結果(表5)表明,土壤菌群的操作分類單元(Operational taxonomic unit,OTU)數量為1 432～1 524,AU處理和U處理的OTU數量顯著高于AA處理。AU處理的Chao1指數顯著高于U處理和AA處理,表明AU處理的群落組成比U處理和AA處理豐富,AU處理的群落多樣性有一定提高。

表5 土壤菌群的α多樣性分析

2.7 氨基酸增值尿素對水稻根際土壤菌群組成的影響

通過高通量Illumina Miseq技術對水稻根際土壤樣品的測序結果進行分析,圖3A顯示,在門水平上,水稻根際土壤樣品中相對豐度大于1%的前10個優勢菌群有Nitrospirae、Gemmatimonadetes、Latescibacteria、Verrucomicrobia、Firmicutes、Chloroflexi、Actinobacteria、Acidobacteria、Bacteroidetes、Proteobacteria,其中相對豐度最高的是Proteobacteria、Bacteroidetes、Acidobacteria。在門水平上,各處理優勢菌群種類無明顯變化,但菌群的相對豐度存在差異。另外,不同施肥處理沒有改變水稻根際土壤中的前3個優勢菌群。與U、AA處理相比,AU處理下Proteobacteria、Bacteroidetes、Firmicutes的相對豐度增加,Acidobacteria的相對豐度下降。

圖3B顯示,在屬水平上,水稻根際土壤樣品中相對豐度較高的前10個優勢菌群為MND1、Lysobacter、Ramlibacter、RB41、Ellin6067、uncultural_bacteria_f_Chitinophagaceae、Sphingomonas、Aeromonas、Flavobacterium、uncultural_bacterium_c_Subgroup_6。施肥處理中,相對豐度最高的前兩個優勢菌群為Aeromonas和Flavobacterium。不同施肥處理間優勢菌群種類無明顯變化,但相對豐度存在差異。與CK相比,施肥處理下Aeromonas的相對豐度明顯增加,uncultural_bacterium_c_Subgroup_6和Sphingomonas的相對豐度明顯下降。與U、AA處理相比,AU處理的Aeromonas的相對豐度增加。與U處理相比,AU處理的Sphingomonas和Flavobacterium的相對豐度增加。

CK、AA、U、AU見表1。圖3 不同施肥處理下水稻根際土壤中細菌門和屬分類水平群落組成Fig.3 The community composition of soil bacteria at phylum and genus levels under different fertilization treatments

2.8 水稻根系分泌的有機酸與根際土壤微生物群落組成的相關性

對根系分泌的有機酸與根際土壤門水平前10種優勢菌群的相關性進行分析,結果(圖4)表明,除了Bacteroidetes、Firmicutes和Proteobacteria外,草酸含量與其他菌群相對豐度均有較高的相關性。Bacteroidetes相對豐度與丁二酸含量呈正相關,Firmicutes相對豐度與酒石酸含量呈正相關。

NIT:Nitrospirae相對豐度;GEM:Gemmatimonadetes相對豐度;LAT:Latescibacteria相對豐度;VER:Verrucomicrobia相對豐度;FIR:Firmicutes相對豐度;CHL:Chloroflexi相對豐度;ACT:Actinobacteria相對豐度;ACI:Acidobacteria相對豐度;BAC:Bacteroidetes相對豐度;PRO:Proteobacteria相對豐度。圖4 水稻根系分泌的有機酸與根際土壤微生物群落的冗余分析Fig.4 Redundancy analysis of organic acids secreted by rice roots and microbial communities in rhizosphere soil

2.9 水稻根系分泌的有機酸、根際土壤環境因子、根際土壤微生物群落三者間的相關性

圖5顯示,pH值與草酸含量、多數菌群相對豐度呈正相關,表明多種優勢菌群受土壤酸堿度影響;丁二酸含量、酒石酸含量與全氮含量、銨態氮含量、硝態氮含量以及Bacteroidetes相對豐度、Firmicutes相對豐度、Proteobacteria相對豐度之間呈正相關關系。

NIT:Nitrospirae相對豐度;GEM:Gemmatimonadetes相對豐度;LAT:Latescibacteria相對豐度;VER:Verrucomicrobia相對豐度;FIR:Firmicutes相對豐度;CHL:Chloroflexi相對豐度;ACT:Actinobacteria相對豐度;ACI:Acidobacteria相對豐度;BAC:Bacteroidetes相對豐度;PRO:Proteobacteria相對豐度。圖5 水稻根系分泌的有機酸與根際土壤環境因子及根際土壤微生物群落的冗余分析Fig.5 Redundancy analysis of organic acids secreted by rice roots, rhizosphere soil environmental factors and rhizosphere soil microbial communities

3 討 論

3.1 氨基酸增值尿素對水稻生長和根際土壤養分的影響

本研究結果表明,氨基酸增值尿素可以促進作物生長,這一結果與前人的研究結果[11]一致。與單施尿素相比,施用氨基酸增值尿素可以顯著提高水稻的株高、根長、根體積、根尖數。施用氨基酸增值尿素對作物生長具有一定的促進作用,可能是因為氨基酸能夠提高土壤中部分酶的活性,從而促進植物生長[12]。有研究結果表明,施用氨基酸增值尿素可減少稻田氨揮發損失,使氮素在土壤中緩慢釋放,保存較長時間,供作物吸收利用[13]。朱榮等[14]認為增效復合肥能夠抑制土壤脲酶活性,具備一定的緩釋效應,增強土壤對氮素的吸附,從而促進作物根系生長。

在本研究中,施用氨基酸增值尿素處理的水稻根際土壤硝態氮含量、銨態氮含量和全氮含量與單施尿素處理差異不顯著。巨曉棠等[15]研究發現,氨基酸和尿素熔融復合后,有利于土壤對銨態氮和全氮的保蓄,使尿素態氮含量在土壤中保持穩定。

3.2 氨基酸增值尿素對水稻根際土壤微生物的影響

本研究結果表明,不同施肥處理對于水稻根際土壤微生物群落結構具有一定的影響,氨基酸增值尿素處理下微生物群落的豐富度和物種多樣性均高于尿素處理。通過對根際土壤微生物進行分析發現,施用氨基酸增值尿素明顯影響水稻根際菌群結構,這與前人研究結果[16]一致。在門、屬2個水平上,比較不同施肥處理下水稻根際土壤菌群組成,發現部分優勢菌群的相對豐度發生明顯變化。在門水平上,前人研究發現,Proteobacteria和Acidobacteria是水稻根際土壤中的優勢菌群[17]。其中,Proteobacteria屬于富營養型細菌,Acidobacteria屬于寡營養型細菌[18]。土壤養分是影響菌群分布的主要因素之一,當土壤養分升高時,富營養型細菌豐度會隨之升高,而寡營養型細菌豐度會隨之下降[19]。植物根際土壤中Bacteroidetes的相對豐度越高,植物對逆境的抗性越強[20]。在本研究中,Acidobacteria、Bacteroidetes和Proteobacteria在各處理中都占有較高的相對豐度,與單施尿素處理相比,施用氨基酸增值尿素處理的Bacteroidetes、Proteobacteria相對豐度明顯增加,Acidobacteria相對豐度明顯下降,表明施用氨基酸增值尿素可以使土壤養分含量提高,并且能夠增強水稻的抗逆性。

在屬水平上進行分析,發現與單施尿素處理相比,施用氨基酸增值尿素處理的Sphingomonas、Flavobacterium相對豐度增加。Sphingomonas是一種潛在的有益細菌屬,可以緩解疾病癥狀、抑制病原體生長,也可以促進植株的生長和N、Ca、Zn、S等養分的吸收[21]。Flavobacterium可以溶解土壤中的磷,從而增加植物對磷素的吸收[22]。Sphingomonas、Flavobacterium均對作物有益。因此,Sphingomonas和Flavobacterium相對豐度的增加,對植物生長起到一定的促進作用。

3.3 水稻根系分泌的有機酸對根際土壤養分及根際土壤微生物的影響

根系分泌物作為重要的媒介,在根系-土壤-微生物之間具有傳遞營養的重要功能[23]。根系的增加會對分泌物產生影響,特別是分泌物中的有機酸。在本研究中,與不施氮肥對照相比,施肥處理提高了有機酸分泌的總量,其中氨基酸增值尿素處理下有機酸分泌總量最高,說明氨基酸增值劑的加入提高了水稻根系分泌有機酸的含量。在本研究中,不同施肥處理的有機酸組成有所改變,與單施尿素處理相比,氨基酸增值尿素處理的酒石酸、丁二酸和檸檬酸的占比增加。前人研究結果表明,酒石酸的分泌有利于提高氮素利用率,從而使水稻產量增加[24]。丁二酸分泌量的增加,能夠增加水稻籽粒中鎂、鉀等元素含量,降低鋅、鉛等元素毒性[25]。檸檬酸的分泌有利于促進土壤鎘轉化為可利用形式,提高了作物對鎘的吸收和富集[26]。

對水稻根系分泌的有機酸和根際土壤環境因子進行冗余分析發現,二者存在一定相關性。有研究結果表明,根系分泌的有機酸能夠改善土壤結構,促進土壤中養分溶解,從而提高作物對養分的吸收,最終促進作物生長[27]。在本研究中,全氮含量、銨態氮含量、硝態氮含量與酒石酸含量、丁二酸含量呈正相關,硝態氮含量、pH值與檸檬酸含量呈正相關。酒石酸含量增加與氮供應量增加具有一致性[28],說明酒石酸含量與全氮含量、銨態氮含量、硝態氮含量均呈正相關。丁二酸是影響微生物氮循環和硝化作用的重要因素[29],因此,丁二酸含量與氮含量具有相關性。

對水稻根系分泌的有機酸組分與根際土壤微生物群落進行冗余分析發現,水稻根際微生物群落與根系分泌的有機酸具有相關性。前人研究結果表明,根系分泌物改變會影響根際微生物群落組成和比例[30]。本研究發現,草酸含量與多數菌群相對豐度呈正相關;Bacteroidetes、Firmicutes、Proteobacteria的相對豐度與丁二酸含量、酒石酸含量呈正相關,與前人研究結果[31]一致。有益細菌增多能夠提升養分的可用性,刺激植物生長發育[32]。因此,Bacteroidetes、Firmicutes、Proteobacteria等有益細菌相對豐度的增加有利于根系分泌更多的有機酸,當有機酸含量增多時,有利于根際養分的釋放,從而促進作物的生長。

根系分泌的有機酸組分、根際土壤微生物群落及根際土壤環境因子三者間的冗余分析結果表明,土壤pH值與草酸含量、多數菌群的相對豐度存在正相關關系;酒石酸含量、丁二酸含量與全氮含量、銨態氮含量以及Proteobacteria、Bacteroidetes的相對豐度呈正相關。有研究結果表明,根系分泌的有機酸與土壤養分之間存在密切關系,因此根系分泌的有機酸能夠對水稻生長起到一定促進作用[33],同時有機酸也是許多微生物的營養來源[34],且根系分泌的有機酸有助于根際養分的釋放,影響土壤微生物組成[35]。土壤中草酸含量會影響pH值和菌群的重組[36],從而影響微生物群落的豐富度和多樣性[37]。酒石酸和丁二酸在提高土壤養分利用率和作物生產力方面發揮著重要作用[38]。

4 結 論

與單施尿素相比,施用氨基酸增值尿素可以促進水稻幼苗生長、水稻根系生長以及根系形態建成。與不施氮肥對照相比,施用氨基酸增值尿素降低了根際土壤pH值,土壤生態環境得到改善,對微生物的生長有益。與單施尿素處理相比,施用氨基酸增值尿素處理提高了微生物群落的豐富度,改變了土壤中部分優勢菌群的相對豐度,影響了根系分泌有機酸的種類以及含量。因此,氨基酸增值尿素是一種良好的、可以替代部分尿素的氮素肥料。