不同干燥方式對岱山金頭蜈蚣黃曲霉毒素含量的影響*

鮑雯雯 周國兒 李 彬

1 舟山市中醫(yī)院 浙江舟山 316000

2 舟山市食品藥品檢驗檢測研究院 浙江舟山 316000

中藥蜈蚣為蜈蚣科動物少棘蜈蚣（Scolopendra subspinipes mutilans L.Koch）的干燥體，其性辛溫，具有息風(fēng)鎮(zhèn)痙，通絡(luò)止痛，攻毒散結(jié)的功效，主要用于肝風(fēng)內(nèi)動，痙攣抽搐，小兒驚風(fēng)，中風(fēng)口嗝，半身不遂等病癥的治療[1]。蜈蚣及其組方可治療風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、腰椎間盤突出和惡性腫瘤等疑難及危重病癥[2，3]。根據(jù)蜈蚣生物學(xué)特征可得出，大蜈蚣、紅頭紅足蜈蚣和紅頭黃足蜈蚣為蜈蚣科動物少棘蜈蚣。浙江省舟山市岱山縣盛產(chǎn)紅頭紅足蜈蚣，也被叫做岱山金頭蜈蚣，傳統(tǒng)的蜈蚣產(chǎn)地加工方式即采用烘焙法[4]。蜈蚣營養(yǎng)豐富，如果加工或儲存不當(dāng)，容易腐敗發(fā)臭，發(fā)霉生菌。黃曲霉毒素是一種毒性極強的真菌毒素，其危害性主要在于對人及動物肝臟組織有破壞作用，嚴(yán)重時可導(dǎo)致肝癌甚至死亡。可以產(chǎn)生黃曲霉毒素的真菌主要是黃曲霉菌和寄生曲霉菌，影響這類腐生菌繁殖及產(chǎn)毒的因素主要是基質(zhì)、水分、溫度、通風(fēng)條件等[5-7]。其中水分是霉菌滋生的首要環(huán)境因素，因此，本研究從產(chǎn)地加工的干燥方式進(jìn)行探討，以控制蜈蚣中的黃曲霉毒素含量。

1 材料和試藥

1.1 儀器：Agilent 1260 高效液相色譜儀、UVE 熒光檢測器、Agilent ChemStation 工作站（安捷倫公司）；T 25 digitai 均質(zhì)器（德國IKA 公司）；ME204E 型電子分析天平（瑞士METTLER TOLEDO 公司）；DHG-9240A 型恒溫干燥箱（上海精宏實驗設(shè)備有限公司）。

1.2 試劑耗材：黃曲霉毒素混合標(biāo)準(zhǔn)品（中國食品藥品檢定研究院，批號：610001-202006，標(biāo)示濃度黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2分別為1.04、0.38、1.08、0.38μg/mL）；CNW 免疫親合柱（上海安譜）；甲醇、乙腈為色譜純（J.T.Baker 公司），氯化鈉為分析純（國藥集團化學(xué)試劑有限公司），水為超純水。

1.3 藥材：蜈蚣購自浙江省舟山市岱山縣衢山鎮(zhèn)，經(jīng)舟山市中醫(yī)院周國兒主任中藥師鑒定為少棘蜈蚣（Scolopendra subspinipes mutilans L.Koch）。

2 方法與結(jié)果

2.1 樣品的制備：采購已產(chǎn)地自然干燥的岱山金頭蜈蚣500g，作為樣品組一（S曬），取約1000g活蜈蚣置盛放沸水的水盆內(nèi)燙死，撈起沖洗干凈，瀝干，立即分別置2臺恒溫干燥箱內(nèi)烘干。一部分濕蟲30℃烘干約60h作為樣品組二（S 30℃），蟲體干透，腥臭味明顯；一部分濕蟲60℃烘干約12h 作為樣品組三（S 60℃），蟲體干透，微有腥氣。

2.2 色譜條件：Agilent X-Bridge-C18 色譜柱（4.6mm×250mm，5μm）；柱溫：35℃；流動相：甲醇-乙腈-水（40∶18∶42）；流速：1.0mL/min；用柱后衍生法檢測，光化學(xué)衍生器（254nm），以熒光檢測器檢測，激發(fā)波長365nm，發(fā)射波長450nm。

2.3 溶液準(zhǔn)備：具體如下。

2.3.1 混合對照品溶液的制備：精密量取黃曲霉毒素混合標(biāo)準(zhǔn)品1.0mL，置20mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，作為儲備液。精密量取儲備液1mL，置25mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，即得。

2.3.2 供試品溶液的制備：分別取上述三組樣品粉碎過二號篩，精密稱定15g粉末，加入氯化鈉3g，置于勻漿均質(zhì)器中，精密加入70%甲醇溶液75mL，高速攪拌2min（攪拌速度12000r/min），離心5min（離心速度2500r/min），精密量取上清液15mL，置50mL 量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻，離心10分鐘，精密量取上清液20mL，通過免疫親合柱，流速每分鐘3mL，用水20mL洗脫，洗脫液棄去，棄去洗脫液，將水?dāng)D出柱子，再用適量甲醇洗脫，收集洗脫液，置2mL 量瓶中，并用甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.4 系統(tǒng)適用性試驗：按“2.2”項下色譜條件，精密吸取“2.3.1”項下混合對照品溶液、供試品溶液各20μL，注入高效液相色譜儀，結(jié)果見圖1。由圖1 分析可知，出峰順序依次為黃曲霉毒素G2、G1、B2、B1，各目標(biāo)峰對稱性良好。

圖1 黃曲霉素對照品圖譜

2.5 樣品測定：參考2020年版《中國藥典》四部通則中《2351 真菌毒素測定法黃曲霉毒素測定法》第一法，各樣品按“2.3.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.2”項下色譜條件測定。每個樣品取樣2 份制備，每份供試品溶液進(jìn)樣2次。精密吸取各供試品溶液20μL，注入液相色譜儀，對舟山市岱山縣衢山鎮(zhèn)某供應(yīng)商提供的蜈蚣常規(guī)曬干樣品（S曬）和60℃快速烘干12小時（S 60℃），30℃連續(xù)烘干60 小時（S 30℃）的樣品進(jìn)行檢測。三組供試品中黃曲霉素檢測結(jié)果均為陰性，結(jié)果見圖2～4。

圖2 S曬樣品圖譜

圖3 S 30℃樣品圖譜

圖4 S 60℃樣品圖譜

3 討論

《中國藥典》2020年版規(guī)定24種藥材需要檢測黃曲霉毒素，其中包含蜈蚣。因此本實驗也直接參考藥典四部統(tǒng)一的“黃曲霉毒素測定法（通則2351第一法）”進(jìn)行檢測，沒有做方法學(xué)考察。查閱《中國藥典》2020 版，其在蜈蚣飲片炮制項下描述“去竹片，洗凈，微火焙黃，剪段”，并無指定具體干燥方式。通過產(chǎn)地走訪了解，當(dāng)?shù)仳隍拣B(yǎng)殖戶一般是沸水燙死后反復(fù)曬干，此曬干方式可復(fù)刻模擬成30℃下連續(xù)烘干，因此設(shè)置一組樣品為30℃連續(xù)烘干60 小時，另一組樣品設(shè)置為較高60℃快速烘干（在實驗設(shè)計時有設(shè)置高溫90℃干燥組，容易出現(xiàn)焦糊味，表明干燥溫度不宜過高）。通過實驗結(jié)果表明，此三組樣品均未檢測出黃曲霉素，黃曲霉素含量未超標(biāo)。但在外觀形態(tài)的觀察中，樣品二30℃連續(xù)烘干60 小時，有濃烈特異的腥臭味，不適合臨床應(yīng)用，樣品一產(chǎn)地曬干和藥品三60℃快速烘干12 小時，無濃烈特異腥臭味，適合臨床應(yīng)用。其中樣品一為產(chǎn)地光照下曬干，耗時較長，容易受外界環(huán)境影響，造成成品得率損失。樣品三60℃快速烘干12小時，在外觀形態(tài)、成品得率和黃曲霉素含量等各方面都合格。是否可以作為經(jīng)驗鑒別依據(jù)，應(yīng)用于產(chǎn)地的大批量加工，需要更大樣品量的檢測數(shù)據(jù)支持。本研究表明岱山金頭蜈蚣采用較高溫度及時干燥，置通風(fēng)干燥處儲藏，可以較好的控制黃曲霉毒素，進(jìn)一步保證岱山道地藥材蜈蚣的質(zhì)量，提高臨床用藥安全性和臨床療效。