人參皂苷Rb1對過敏性哮喘大鼠炎癥反應、免疫功能及JAK2/STAT3信號通路的影響

劉曦 羅曉松 孫濤

(黔南州人民醫院 1全科醫學科,貴州 都勻 558000;2急診內科)

過敏性哮喘是支氣管氣道的一種慢性炎癥性疾病,其特征在于各種炎癥細胞的浸潤,包括肥大細胞、T淋巴細胞、嗜中性粒細胞和巨噬細胞等〔1〕。過敏性哮喘與Janus激酶(JAK)/信號轉導和轉錄激活因子(STAT)信號通路及其特征性細胞因子失衡密切相關〔2〕。作為STAT家族的成員之一,STAT3作為轉錄因子參與對細胞因子和生長因子的反應,STAT3通過JAK2依賴性磷酸化和JAK2非依賴性磷酸化激活〔3〕。研究表明JAK2/STAT3信號可以被多種細胞因子激活,如白細胞介素(IL)-4、腫瘤壞死因子(TNF)-α等,這些細胞因子參與炎癥反應的進展〔4〕。Ren等〔5〕研究顯示,抑制JAK2/STAT3通路可改善哮喘小鼠炎癥反應和氧化應激水平。人參皂苷Rb1是人參主要的藥理成分之一,具有抗病毒、抗氧化、抗炎、抗癌的藥理作用〔6〕。有研究報道,人參皂苷Rb1可抑制氧化應激和炎癥,減輕酒精誘導的肝損傷〔7〕。Chen等〔8〕研究發現,人參皂苷Rb1可減輕大鼠腸缺血/再灌注引起的炎癥反應和氧化應激。但人參皂苷Rb1對過敏性哮喘是否有治療作用尚未有研究。本研究擬探討人參皂苷Rb1對過敏性哮喘大鼠炎癥反應、免疫功能及JAK2/STAT3信號通路的影響。

1 材料與方法

1.1動物 SD大鼠(SPF級,雄性,8周齡,體質量200～220 g),由貴州醫科大學實驗動物中心提供,生產許可證號:SCXK(黔)2019-0011,大鼠飼養環境:溫度(23±1)℃,相對濕度50%～60%,光暗(12 h∶12 h)安靜環境中適應性飼養。

1.2主要藥物、試劑及儀器 人參皂苷Rb1(杭州甫洛生物科技有限公司,原料藥,純度99.98%,批號753-59-6,用生理鹽水配制成濃度分別為2.5、5.0 mg/ml人參皂苷Rb1溶液);地塞米松注射液(天津金耀藥業有限公司,規格1 ml∶5 mg,批號20201226,將地塞米松注射液和生理鹽水相溶配制成濃度為0.05 mg/ml地塞米松溶液);卵清蛋白、IL-4、TNF-α、干擾素(IFN)-γ、免疫球蛋白(Ig)E酶聯免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒(上海谷研實業有限公司,批號分別為CA9008-3、CA1547-8、CA2036-5、CA4962-7、CA1039-5);蘇木素-伊紅(HE)染色試劑盒、TRIzol試劑、聚合酶鏈反應(PCR)試劑盒、兔抗鼠JAK2、STAT3、磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)一抗、兔抗鼠二抗(武漢百浩天生物科技有限公司,批號分別為BL0091、BL1035、BL1158、BL1913、BL0657、BL5742、BL9611);酶標儀、熒光定量PCR儀(上海沛歐分析儀器有限公司,型號分別為318C+、MA6000);顯微鏡、凝膠成像儀(東莞市中特精密儀器科技有限公司,型號分別為TJ-4100、CX5)。

1.3動物建模、分組及給藥 參照文獻〔9〕中的方法進行造模,第1天大鼠腹腔注射10%卵清蛋白溶液(生理鹽水配制,5 ml/kg)進行致敏,第8天大鼠腹腔注射10%卵清蛋白溶液再進行1次致敏,第15天用1%卵清蛋白溶液進行霧化激發哮喘(中速霧化量),7 min/次,1次/d,連續霧化14 d;當大鼠出現打噴嚏、抓鼻、腹式呼吸、四肢無力、反應遲鈍、呼吸急促等癥狀表示過敏性哮喘造模成功。將造模成功的56只大鼠隨機分為:模型組、地塞米松組(0.5 mg/kg)〔10〕、人參皂苷Rb1低劑量組(25 mg/kg)、人參皂苷Rb1高劑量組(50 mg/kg)〔11〕,每組14只。另取14只健康大鼠(將卵清蛋白換成生理鹽水,其余操作同上)設為對照組。于造模成功后開始給藥,地塞米松組腹腔注射0.5 mg/kg的地塞米松溶液,人參皂苷Rb1低、高劑量組分別腹腔注射25、50 mg/kg的人參皂苷Rb1溶液,模型組和對照組腹腔注射等量生理鹽水,注射體積均為10 ml/kg,每天給藥1次,連續給藥14 d。

1.4血清IL-4、TNF-α、IFN-γ、IgE水平測定 給藥周期結束后,腹腔注射5%戊巴比妥鈉麻醉大鼠,取腹主動脈血3 ml,離心分離血清,按ELISA試劑盒說明書測定血清中IL-4、TNF-α、IFN-γ、IgE水平。

1.5肺組織HE染色和肺損傷評分 頸脫臼處死大鼠,取右肺組織,分成兩份,一部分肺組織,置于-70 ℃冰箱凍存。另一部分肺組織包埋在石蠟中,切成4 μm切片,將切片置于載玻片上,脫蠟,并行HE染色,置于顯微鏡下觀察。并進行肺損傷評分〔12〕:病變區域占制片區域比例>75%計4分,50%<病變區域占制片區域比例≤75%計3分,25%<病變區域占制片區域比例≤50%計2分,12%<病變區域占制片區域比例≤25%計1分,病變區域占制片區域比例≤12%計0.5分,無病變計0分。

1.6肺組織JAK2、STAT3 mRNA表達水平測定 取-70 ℃冰箱凍存的部分肺組織,解凍然后勻漿化,TRIzol試劑提取肺組織中總RNA,逆轉錄合成cDNA,用PCR試劑盒進行反應。引物由廣州吉格生物科技有限公司設計合成,引物序列如下:JAK2正向:5′-GTGACAGGGCTGGAAGTGACC-3′,反向:5′-ACTATGTCCCAGTCAGGGCTC-3′;STAT3正向:5′-TACCCTGGGAGTTAGCCTGACGAGC-3′,反向:5′-CACCTGTGTTTCTCAGCGCTGCAAT-3′;GAPDH(內參)正向:5′-AGTAGTTGCGTTACACGATCGCTAG-3′,反向:5′-CTGTCACCTTCACCGTTCCAGTTT-3′。反應參數:95 ℃ 2 min,然后進行40次循環(93 ℃ 15 s、54 ℃ 18 s、73 ℃ 20 s),最后73 ℃ 1 min。用2-ΔΔCt法計算JAK2、STAT3 mRNA表達水平。

1.7肺組織JAK2、STAT3蛋白表達水平測定 取-70 ℃冰箱凍存的另一部分肺組織,解凍然后勻漿化,用蛋白裂解液進行裂解,然后將樣品在6 000 r/min下4 ℃離心10 min,收集上清(總蛋白),上樣80 μg蛋白樣品進行電泳轉膜反應,封閉50 min,加入兔抗鼠JAK2、STAT3、GAPDH一抗(均為1∶800稀釋)孵育24 h,再加入兔抗鼠二抗孵育2 h,化學發光液顯色,凝膠成像儀分析蛋白條帶。

1.8統計學分析 采用SPSS24.0軟件行單因素方差分析和SNK-q檢驗。

2 結 果

2.1各組血清IL-4、TNF-α、IFN-γ、IgE水平比較 與對照組比較,模型組血清IL-4、TNF-α、IgE水平顯著升高,IFN-γ水平顯著降低(P<0.05);與模型組比較,地塞米松組、人參皂苷Rb1低、高劑量組血清IL-4、TNF-α、IgE水平顯著降低,IFN-γ水平顯著升高(P<0.05);人參皂苷Rb1高劑量組血清IL-4、TNF-α、IgE水平顯著低于人參皂苷Rb1低劑量組,IFN-γ水平顯著高于人參皂苷Rb1低劑量組(P<0.05);地塞米松組和人參皂苷Rb1高劑量組血清IL-4、TNF-α、IgE、IFN-γ水平差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

2.2各組肺組織HE染色結果及肺損傷評分比較 對照組肺組織結構正常,未觀察到病理學改變;模型組肺組織出現肺泡壁充血和炎性細胞浸潤的明顯病理變化;地塞米松組、人參皂苷Rb1高劑量組肺組織損傷的嚴重程度明顯減輕,炎性細胞浸潤明顯被抑制;人參皂苷Rb1低劑量組肺組織仍可見炎癥反應,但較模型組程度輕。見圖1。與對照組比較,模型組肺損傷評分顯著升高(P<0.05);與模型組比較,地塞米松組、人參皂苷Rb1低、高劑量組肺損傷評分顯著降低(P<0.05);人參皂苷Rb1高劑量組肺損傷評分顯著低于人參皂苷Rb1低劑量組(P<0.05);地塞米松組和人參皂苷Rb1高劑量組肺損傷評分差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 各組血清IL-4、TNF-α、IFN-γ、IgE水平及肺損傷評分比較

圖1 各組肺組織(HE染色,×400)

2.3各組肺組織JAK2、STAT3 mRNA及蛋白表達水平比較 與對照組比較,模型組肺組織JAK2、STAT3 mRNA及蛋白表達水平顯著升高(P<0.05);與模型組比較,地塞米松組、人參皂苷Rb1低、高劑量組肺組織JAK2、STAT3 mRNA及蛋白表達水平明顯降低(P<0.05);人參皂苷Rb1高劑量組肺組織JAK2、STAT3 mRNA及蛋白表達水平明顯低于人參皂苷Rb1低劑量組(P<0.05);地塞米松組和人參皂苷Rb1高劑量組肺組織JAK2、STAT3 mRNA及蛋白表達水平差異無統計學意義(P>0.05)。見表2、圖2。

表2 各組肺組織JAK2、STAT3 mRNA表達水平比較

1～5:對照組、模型組、地塞米松組、人參皂苷Rb1低劑量組、人參皂苷Rb1高劑量組圖2 Western印跡檢測各組肺組織JAK2、STAT3蛋白表達

3 討 論

過敏性哮喘是一種常見的炎癥性氣道疾病,與炎癥細胞浸潤、細胞因子募集和過敏性免疫反應有關〔13〕。IL-4、TNF-α可反應過敏性哮喘炎癥浸潤程度。黃聰等〔14〕研究顯示,過敏性哮喘模型大鼠血清IL-4水平顯著高于健康大鼠,清半夏多糖可改善過敏性哮喘大鼠肺組織病理變化,降低血清IL-4水平。王艷宏等〔15〕研究顯示,過敏性哮喘大鼠血清TNF-α水平高于正常大鼠,經白芥子散治療后可降低過敏性哮喘大鼠血清TNF-α水平。本研究結果表明,人參皂苷Rb1可改善過敏性哮喘大鼠肺損傷,抑制炎性細胞募集進入肺組織,對過敏性哮喘大鼠炎癥反應具有明顯抑制作用。與黃聰等〔14〕和王艷宏等〔15〕研究結果一致。

IgE水平可反映過敏性哮喘嚴重程度,王友剛等〔16〕研究顯示,過敏性哮喘小鼠血清IgE水平低于健康小鼠,褪黑素可改善過敏性哮喘的炎癥損傷并降低血清IgE水平。IFN-γ是巨噬細胞活化因子,其水平升高可提高機體免疫功能,有報道表明,孟魯司特可改善過敏性哮喘小鼠肺組織形態和炎癥,增加IFN-γ水平〔17〕。本研究結果表明,人參皂苷Rb1可改善過敏性哮喘大鼠的免疫功能。

JAK2/STAT3信號通路被認為與炎癥密切相關〔18〕。Zhao等〔19〕研究表明,山莨菪堿可通過抑制JAK2/STAT3通路調節氧化應激、炎癥和細胞凋亡,發揮大鼠急性肺損傷的保護作用。Zhu等〔20〕研究顯示,姜黃素可通過抑制JAK2/STAT3信號通路來減輕膿毒癥急性腎損傷的炎癥反應和細胞凋亡。本研究結果提示,人參皂苷Rb1有效抑制了過敏性哮喘大鼠肺組織中JAK2、STAT3表達的上調,改善了JAK2/STAT3信號通路失衡。與Zhao等〔19〕、Zhu等〔20〕研究結果一致。

綜上,人參皂苷Rb1對過敏性哮喘具有治療作用,可改善過敏性哮喘大鼠肺損傷,減輕炎癥反應,提高免疫功能;其機制可能與人參皂苷Rb1抑制過敏性哮喘大鼠肺組織JAK2、STAT3表達的上調,改善JAK2/STAT3通路失衡有關。