那可丁對肺癌細胞血管生成、Yes相關蛋白及敏感性的作用機制

湯顧航 杜先鳳 姜力豪

(重慶市大足區(qū)人民醫(yī)院,重慶 402360)

肺癌是惡性腫瘤患者死亡率升高的主要原因之一,非小細胞肺癌(NSCLS)占肺癌發(fā)病率的80%～85%,但隨著醫(yī)療診斷及治療技術的發(fā)展,NSCLS患者5年預后有所改善,但是對于診斷時已經處于中晚期NSCLS患者而言預后仍然不佳〔1〕。手術是肺癌患者臨床治療主要方法,但術后復發(fā)率高達50%以上。化療能夠顯著改善晚期NSCLS患者臨床療效,但是NSCLS細胞對順鉑類藥物耐藥增加限制了臨床引用,因此尋找NSCLS治療新藥已經刻不容緩。肺癌血管新生可促進癌細胞侵襲轉移,可將癌細胞送至靶器官惡化病情,因此對肺癌細胞新生血管的抑制可能成為減低癌細胞轉移的重要途徑〔2〕。相關研究表示,惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展與致癌因子激活抑癌因子失活相關,Hippo信號通路初次是在黑腹果蠅體內被發(fā)現(xiàn)的具有調節(jié)細胞生長及凋亡等作用〔3〕。YES相關蛋白YAP是Hippo信號通路的重要因子之一,正常環(huán)境下主要表達在細胞質具有維持器官大小及內環(huán)境穩(wěn)定的作用,但在Hippo信號失活后YAP激活在組織過度激活,被認為是一種致癌基因。齊良波等〔4〕研究表示,在肺癌組織中YAP蛋白表達上調與患者疾病進展及預后不佳密切相關。近些年,將天然化合物應用于抗腫瘤臨床研究已經成為研究熱點。那可丁是從罌粟屬植物鴉片中提取的一種生物堿,主要作為鎮(zhèn)咳藥物被廣泛應用,但是隨著對于研究深入并通過體外及體內實驗均證實具有抗惡性腫瘤的作用〔5〕。那可丁具有抗肺癌細胞活性的作用,認為可以作為治療肺癌的潛在藥物。但是關于那可丁是否具有抑制肺癌細胞血管生成及YAP水平還暫無研究,所以,本文以此作為創(chuàng)新點觀察那可丁抗肺癌效果,為臨床治療用藥提供選擇依據。

1 材料與方法

1.1實驗細胞 非小細胞肺癌 A549 細胞購于中科院上海細胞庫。A549 細胞放入37 ℃、5%CO2飽和濕度下培養(yǎng),24 h后棄去培養(yǎng)體后加入含有1%雙抗的10%的胎牛血清中培養(yǎng),培養(yǎng)條件同上。顯微鏡下觀察SGC-7901細胞生長至80%～90%時進行傳代,75%乙醇消毒,棄去舊的培養(yǎng)基,磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌3次,加入0.25%胰蛋白酶消化,生長至90%時終止反應,脫壁后,放入15 ml的離心管中1 000 r/min,5 min后,棄去上清液放入培養(yǎng)基中2～3 d傳代。

1.2主要試劑及儀器 胎牛血清、RPMI1640培養(yǎng)基購自杭州四季青生物工程材料;二甲基亞砜(DMSO)購自美國Sigma;YAP、磷酸化(p)-YAP多克隆抗體購自Santa cruz biotechnoiogy公司;鼠抗人甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)單克隆抗體、兔抗人血管內皮細胞生長因子(VEGF)單克隆抗體、兔抗人堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)2單克隆抗體、兔抗人基質金屬蛋白酶(MMP)-9單克隆抗體均購自中國上海圻明生物科技;山羊抗兔免疫球蛋白(Ig)G及山羊抗小鼠IgG購自中國武漢純度生物科技;Transwell 小室(3413)購自美國康寧公司;酶標儀(Elx800)購自美國Bio-Tek 公司;TDZ4-WS 低速臺式離心機購自中國湖南湘瑞生物;凝膠成像系統(tǒng)及Western印跡電泳系統(tǒng)均購自中國背景賽百奧科技。

1.3藥物來源及配制 那可丁由東北制藥集團公司沈陽第一制藥廠生產,批號:H20054494;順鉑購自江蘇豪森集團有限公司,批號:H20040813。藥物配制:3 ml的DMSO與那可丁粉末充分混勻,調制成濃度為80 mmol/L的原液,以0.5 ml分為裝入1 ml試劑管中,低溫保存?zhèn)溆谩ｍ樸K濃度為5 mg/ml避光保存。

1.4分組及處干預 A549 細胞重懸細胞后,按照1.5×106/ml接種于96孔版中,分為肺癌組(無干預的A549 細胞)、低濃度那可丁組(A549 細胞與20 μmol/L那可丁共培養(yǎng))、中濃度那可丁組(A549細胞與40 μmol/L那可丁共培養(yǎng))、高濃度那可丁組(A549細胞與80 μmol/L那可丁共培養(yǎng)),順鉑(DDP)組(A549細胞與20 μmg/L DDP共培養(yǎng)),各組細胞培養(yǎng)24 h后顯微鏡觀察形態(tài)改變。

1.5Transwell 法檢測A549 細胞侵襲能力 采用基質膠無血清培養(yǎng)稀釋鋪于Transwell小室上室,2 h后,取各組培養(yǎng)24 h后的A549細胞數目為1×106/ml加入含有基質膠的Transwell小室上室,下室加入完全培養(yǎng)基,孵育24 h后,保留Transwell小室液體,4%多聚甲醛固定30 min,1%的結晶紫染色10～20 min,樹膠封片,顯微鏡下觀察穿過底膜的細胞數即為侵襲細胞數。

1.6劃痕檢測各組A549細胞遷移能力比較 對數生長的A549細胞成懸浮液體,均種入24孔細胞培養(yǎng)板種,單層生長后棄去培養(yǎng)液,用200 μl槍頭在24孔板中劃一條痕,干預24 h后觀察細胞劃痕愈合,實驗重復3次,利用Image Pro Plus軟件,取均值,數據用統(tǒng)計軟件分析。

1.7體外血管形成實驗 在A549 細胞96孔板中添加200 μl的基質膠,細胞培養(yǎng)箱中凝固60 min,后收集各組細胞制成單細胞懸液,密度調整為5×105個/ml,每孔添加500 μl單細胞懸液,均勻分布細胞基質膠上孵育48 h,進行拍照后觀察封閉管腔形成數量,實驗重復3次取平均值。

1.8CCK-8檢測A549 細胞對DDP的耐藥作用 取對數生長的A549細胞,細胞濃度的2×105/ml,接種96孔板中培養(yǎng)24 h后,分別加入0.0、2.5、5.0、10.0、20.0、40.0、80.0 mg/L的DDP于細胞培養(yǎng)板中,后每孔80 μmol/L的那可丁,后繼續(xù)培養(yǎng)48 h,每孔細胞中加入10 μl的CCK-8溶液,孵育2 h,結束后取出培養(yǎng)板于450 nm吸光度。

1.9免疫印跡檢測A549細胞bFGF2、VEGF、MMP-9及YAP蛋白水平 A549 細胞移入孔6板中,細胞濃度為2.5×104個ml,PBS沖洗,加入150 μl RIPA的裂解液,12 000 r/min離心15 min后,放入樣孔中,進行電泳實驗。聚偏氟乙烯(PVDF)膜TBS浸泡10 min,反復PBS沖洗,5 min/次,加入bFGF2(1∶500 )、VEGF(1∶500 )、MMP-9(1∶1 000)、YAP(1∶500)及p-YAP(1∶500)和內參GAPDH抗體(1∶1 000),TBS沖洗3次后,加入辣根過氧化酶標記的山羊抗兔(1∶5 000),雜交沖洗。后將膜浸入電化學發(fā)光(ECL)工作液,隨后進行檢測,獲取圖像。

1.10統(tǒng)計學分析 采用GraphPad Prism8軟件進行方差分析,事后檢驗采用Bonferroni法進行組間兩兩比較。

2 結 果

2.1那可丁對A549細胞形態(tài)的影響 肺癌組肺癌細胞呈現(xiàn)上皮樣貼壁生長,細胞形態(tài)為長梭形,細胞核大,經不同濃度那可丁處理或DDP處理后,細胞數目減少,細胞亮點增加,說明存在細胞死亡。見圖1。

2.2那可丁對A549細胞侵襲數目及劃痕愈合率比較 與肺癌組相比,低、中、高濃度那可丁組及DDP組侵襲數目及劃痕愈合率均顯著降低(P<0.05);與低濃度那可丁組相比,中、高濃度那可丁組及DDP組侵襲數目及劃痕愈合率顯著降低(P<0.05);與中濃度那可丁組及DDP組相比,高濃度那可丁組侵襲數目及劃痕愈合率顯著降低(P<0.05);高濃度那可丁組與DDP組上述指標相比無統(tǒng)計學意義(P>0.05),見表1、圖2及圖3。

圖1 各組A549細胞形態(tài)(吉姆薩染色法,×200)

表1 各組A549細胞侵襲數目及劃痕愈合率比較

2.3那可丁對各組A549細胞體外血管形成能力比較 與肺癌組相比,低、中、高濃度那可丁組及DDP組體外血管形成能力降低(P<0.05),與低濃度那可丁組相比,中、高濃度那可丁組體外血管形成能力降低(P<0.05),與中濃度那可丁組相比,高濃度那可丁組體外血管形成能力降低(P<0.05),高濃度那可丁組與DDP組上述指標相比無意義(P>0.05),見表2及圖4。

圖2 各組A549細胞侵襲(結晶紫染色,×200)

圖3 各組A549細胞劃痕愈合(結晶紫染色,×200)

2.4DDP聯(lián)合那可丁對A549 細胞抑制率的影響 DDP組及DDP+那可丁組在DDP濃度為0 mg/L時比較無統(tǒng)計學意義(P>0.05),在DDP濃度為2.5、5.0、10.0、20.0、40.0、80.0 mg/L時DDP+那可丁組的肺癌A549細胞抑制率均顯著高于DDP組(P<0.05),見表3。

2.5那可丁對各組A549細胞YAP及p-YAP蛋白水平比較 與肺癌組相比,低、中、高濃度那可丁組及DDP組細胞中YAP及p-YAP水平顯著降低(P<0.05),低、中及高濃度那可丁組YAP及p-YAP水平逐漸降低,相互比較存在顯著差異(P<0.05),高濃度那可丁組與DDP組YAP及p-YAP水平比較無統(tǒng)計學意義(P>0.05),見表2、圖5。

2.6那可丁對各組A549細胞VEGF、bFGF2及MMP-9蛋白水平的影響 與肺癌組相比,低、中、高濃度那可丁組及DDP組細胞中VEGF、bFGF2及MMP-9水平顯著降低(P<0.05),低、中及高濃度那可丁組VEGF、bFGF2及MMP-9水平逐漸降低,相互比較存在統(tǒng)計學差異(P<0.05),高濃度那可丁組與DDP組VEGF、bFGF2及MMP-9水平無統(tǒng)計學意義(P>0.05),見表2、圖5。

表2 各組A549細胞環(huán)狀血管數量、VEGF、bFGF2及MMP-9、YAP、p-YAP蛋白水平比較

圖4 各組A549細胞體外血管形成能力比較(吉姆薩染色法,×200)

表3 DDP聯(lián)合那可丁對A549 細胞抑制率的影響

1～5:肺癌組、低濃度那可丁組、中濃度那可丁組、高濃度那可丁組、DDP組圖5 各組A549細胞VEGF、bFGF2、MMP-9、YAP及p-YAP蛋白水平比較

3 討 論

DDP自FDA批準應用于殖系統(tǒng)惡性腫瘤臨床治療取得較好的治療效果后已經被廣泛應用于抗癌,例如乳腺癌、肺癌等均取得了較好的效果。但是由于鉑類藥物結構相似在抗癌過程中有嚴重的耐藥性,這限制了藥物的應用及開發(fā),因此對新型抗腫瘤、增加DDP敏感性藥物的研發(fā)已經成為重中之重,對于臨床治療具有深遠意義。

本文研究發(fā)現(xiàn),A549細胞經不同濃度那可丁處理后其侵襲及遷移能力均降低,以高濃度那可丁組效果最佳,與DDP療效相似。良性腫瘤及惡性腫瘤的區(qū)別重點在于能否發(fā)生轉移,肺癌細胞侵襲及遷移產生是一個多因素、多信號通路及多環(huán)節(jié)相互作用的動態(tài)調控過程,癌細胞侵襲及遷移可影響患者預后,因此有效抑制侵襲及遷移對于改善肺癌患者生存率具有重要意義〔6〕。那可丁的主要活性成分為鄰苯二甲酸異喹啉生物堿,最早應用于臨床鎮(zhèn)咳,近些年部分學者通過體外實驗證實那可丁可發(fā)揮抗腫瘤作用,例如胰腺癌、宮頸癌、結腸癌等〔7,8〕。祝美玲等〔9〕研究證實,那可丁可與微管蛋白結合后通過延長微管靜止期抑制形成進而減少癌細胞有絲分裂而發(fā)揮抗癌作用。而部分學者發(fā)現(xiàn)紫杉醇也屬于微管抑制劑與那可丁均可以通過調節(jié)半胱天冬氨酸酶(caspase)和p21等信號通路而抑制癌細胞活性。那可丁具有加快肺癌細胞凋亡,抑制增殖的作用,本文認為不同濃度的那可丁可通過抑制細胞血管生成而加快凋亡,減少侵襲及遷移,且呈現(xiàn)濃度依賴性。

本文研究發(fā)現(xiàn),那可丁可以通過抑制VEGF、bFGF2及MMP-9活性而減少肺癌細胞體外管腔形成,從而減少細胞惡性侵襲及遷移。肺癌細胞的侵襲及遷移離不開新生血管生成,當瘤體直徑超過3 mm是可激活血管內皮細胞生長因子VEGF水平而促進腫瘤內新生血管形成,進一步加快腫瘤浸潤、轉移〔10,11〕。肺癌組織中MMP-9表達升高,可破壞組織結構及基底屏障而有利于腫瘤形成及轉移。血管生長是血管刺激因子與抑制因子失調的結果,bFGF在肺癌中被激活可激活血管生長因子VEGF表達而加快瘤體生長,惡化病情〔12〕。在以往的文獻研究中,結腸癌SW480細胞中VEGF及MMP9表達升高采用那可丁干預后表達降低,認為那可丁可以通過抑制肝腸-鈣黏連蛋白(LI-cadherin,CDH17)表達而降低癌細胞血管生成和侵襲遷移〔13〕。那可丁被作為缺氧誘導因子(HIF)-1的抑制劑,在胰腺癌細胞中那可丁可以可顯著抑制HIF-1的靶基因——VEGF的表達而發(fā)揮抗腫瘤血管生成的作用〔14〕。因此,本文推測那可丁在肺癌細胞中具有VEGF、bFGF2及MMP-9活性而降低環(huán)狀血管形成的作用。

DDP是臨床肺癌治療的首選藥物,主要作用于DNA可以通過抑制癌細胞中DNA復制而加快癌細胞凋亡。但是隨著臨床肺癌患者易對其形成耐藥性而限制了其應用〔15〕。本文研究發(fā)現(xiàn),DDP聯(lián)合那可丁可減少肺癌細胞耐藥性,降低活性。近些年,將DDP與一些藥物聯(lián)合應用于抗惡性腫瘤的治療已經取得了一定進展,例如在抗肺癌細胞中采用DDP聯(lián)合異黃腐酚可以逆轉肺癌細胞DDP耐藥,在肝癌細胞體外實驗中將DDP與復方母雞顆粒共培養(yǎng)后可顯著抑制癌細胞增殖,加快凋亡,比單一DDP抗腫瘤效果更佳。DDP聯(lián)合那可丁能夠增加DDP耐藥A549細胞敏感性,那可丁屬于微管類化合物可以減少A549細胞對DDP耐藥性,逆轉耐藥〔16〕。李巖等〔17〕研究發(fā)現(xiàn),那可丁具有強大抑瘤效果,可以通過抑制增加細胞毒性作用而加快肺癌細胞凋亡,并減少耐藥。YAP可作為致癌因子,在多種惡性腫瘤中高表達,例如胃癌、乳腺癌及肺癌中,已有研究證實66.3%的肺癌患者存在YAP過表達,并可顯著促進細胞侵襲及遷移〔18,19〕。本文研究發(fā)現(xiàn),那可丁可抑制肺癌細胞中YAP及其磷酸化,呈現(xiàn)濃度依賴性,認為那可丁可通過抑制YAP及pYAP表達而減少YAP下游因子轉錄作用而抑制癌細胞DNA復制,從而抑制癌癥進展。那可丁與紫杉醇均屬于微管抑制劑,抗腫瘤作用具有相似性。楊宇宸〔20〕研究表示,不同濃度紫杉醇均可以增加胃癌細胞凋亡,研究機制與抑制YAP蛋白及mRNA表達相關,因此,本文推測那可丁可降低YAP表達而發(fā)揮抗肺癌細胞血管生成的作用,但是研究機制還不清楚,需要進一步研究證實。

本文存在一定不足,未進行大鼠實驗及樣本量較少,關于那可丁對YAP的研究機制研究較少,今后應增加單位合作及樣本量,為肺癌干預機制提供方向。