酸棗仁皂苷A對缺血缺氧再灌注的H9C2細(xì)胞CD38/NAD+信號通路相關(guān)因子表達(dá)的影響

胡怡然 瞿惠燕 郭佳瑩 楊濤,3 周華,3

(1上海中醫(yī)藥大學(xué),上海 201203;2上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院;3上海市中西醫(yī)結(jié)合心血管病研究所)

心肌梗死是嚴(yán)重威脅人類生命健康的重要的心血管疾病之一,常因血管閉塞,長時間冠狀動脈供血不足引起心肌組織缺血,進而導(dǎo)致閉塞血管周圍的部分心肌發(fā)生急性壞死,而恢復(fù)血流灌注后,又引起心肌的再灌注損傷〔1〕。因此,尋找有效防治心肌缺血/再灌注損傷的藥物是當(dāng)前醫(yī)學(xué)研究的熱點。

研究發(fā)現(xiàn),能量代謝障礙是多種心血管疾病發(fā)生的重要病因,三磷酸腺苷(ATP)是心肌細(xì)胞能量的直接供應(yīng)形式,主要由線粒體氧化磷酸化產(chǎn)生,在此過程中,線粒體電子傳遞鏈消耗85%～90%的氧氣以產(chǎn)生ATP,也產(chǎn)生大量氧自由基,包括超氧陰離子、過氧化氫及羥基自由基等,因此ATP和活性氧(ROS)是線粒體功能的重要指標(biāo)〔2〕。在缺血缺氧再灌注的心肌細(xì)胞中,線粒體生物合成減少,ATP水平下降,氧化磷酸化反應(yīng)受損,出現(xiàn)能量代謝障礙和能量耗竭等病理變化〔3〕。煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)是調(diào)節(jié)能量代謝的重要輔酶因子,NAD+/還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)比值能夠調(diào)節(jié)ATP生成速率〔4〕。在能量代謝過程中,NAD+接受H+形成還原型NADH,NADH在線粒體內(nèi)膜上重新氧化,推動氧化磷酸化生成ATP〔5〕。此外,NADPH和NADP的還原形式,也能夠減少ROS的損害,因此NAD+及NAD+/NADH與線粒體功能密切相關(guān)〔6〕。研究發(fā)現(xiàn),在缺血缺氧再灌注的心肌細(xì)胞中,NAD+水平下降降,而恢復(fù)NAD+水平能夠改善能量代謝,減緩心肌的缺血缺氧再灌注損傷〔7〕。NAD+的穩(wěn)態(tài)由NAD+合成酶和NAD+降解酶的平衡維持〔8〕。CD38是一種Ⅱ型跨膜糖蛋白,廣泛分布在大腦、心臟及免疫細(xì)胞表面,CD38不僅是NAD+的主要降解酶,還是炎癥和先天性免疫反應(yīng)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子〔9〕。CD38不僅能降解NAD+,還能下調(diào)NAD+依賴性酶沉默信息調(diào)節(jié)因子2同源蛋白(SIRT)3的表達(dá)〔10〕。NOD樣受體熱蛋白結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白(NLRP)3炎癥小體是炎癥反應(yīng)的經(jīng)典標(biāo)志物〔11〕。

酸棗仁皂苷A是鼠李科植物酸棗仁的主要有效成分之一。現(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn),酸棗仁皂苷A具有鎮(zhèn)靜安神的功效,并在神經(jīng)系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)及心腦血管中作用廣泛〔12〕。實驗研究發(fā)現(xiàn),酸棗仁皂苷A對缺血再灌注的神經(jīng)細(xì)胞具有保護作用,也能保護缺血再灌注的心肌細(xì)胞,但對缺血再灌注引起的心肌細(xì)胞的能量代謝障礙研究較少〔13〕。本研究通過針對缺血再灌注的心肌細(xì)胞的能量代謝障礙,對線粒體功能及炎癥因子進行檢測,為闡明酸棗仁皂苷A改善缺血缺氧心肌細(xì)胞損傷的機制提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞 大鼠H9C2心肌細(xì)胞購自武漢普諾賽生命科技有限公司(Procell)。

1.2試劑 酸棗仁皂苷A購自索萊寶(貨號:55466-04-1)。CD38抑制劑購自MCE(貨號:HY-123999),H9C2細(xì)胞專用培養(yǎng)基、0.25%胰蛋白酶溶液均購自Procell(貨號:PB180223),CCK-8試劑盒、ATP含量檢測試劑盒、活性氧檢測試劑盒、大鼠白細(xì)胞介素(IL)-1β酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒、IL-6 ELISA試劑盒、腫瘤壞死因子(TNF)-α試劑盒及二喹啉甲酸(BCA)蛋白濃度測定試劑盒均購自索萊寶(貨號:CA1210、BC0300、CA1410、SEKR-0002、SERK-0005、SERK-0009、PC0020),NAD+/NADH檢測試劑盒、β-actin、CD38鼠抗、SIRT3兔抗、NLRP3兔抗、辣根過氧化酶標(biāo)記的山羊抗兔、辣根過氧化酶標(biāo)記的山羊抗小鼠均購自碧云天(貨號:S0175、AF5001、AF5303、AF2362、AF2155、A0208、A0216)。

1.3主要儀器 酶標(biāo)儀(Thermo Scientific,USA),CO2培養(yǎng)箱(Thermo,USA),十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)轉(zhuǎn)膜裝置(BIO-RAD,USA),Odyssey熒光成像系統(tǒng)(LI-COR Biosciences,USA),厭氧罐(MGC,JAPAN),厭氧袋(MGC,JAPAN)。

1.4細(xì)胞培養(yǎng)及缺血缺氧再灌注模型 用H9C2細(xì)胞專用培養(yǎng)基在37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)H9C2細(xì)胞,每天更換培養(yǎng)基,待細(xì)胞生長到90%,用0.25%的胰蛋白酶消化液進行傳代,待細(xì)胞生長狀態(tài)良好時用于實驗。構(gòu)建缺血缺氧再灌注細(xì)胞模型:當(dāng)細(xì)胞生長到60%時,棄掉原來的培養(yǎng)基,用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌1次后,重新加入新的培養(yǎng)基,將H9C2細(xì)胞置于2.5 L厭氧罐中,立即放入?yún)捬醍a(chǎn)氣袋和氧氣指示劑,約30 min后氧氣指示劑由淺紫色變?yōu)榉奂t色,提示厭氧裝置中氧氣濃度<0.1%,缺氧干預(yù)2 h后移入常規(guī)培養(yǎng)箱中,并棄掉原培養(yǎng)基中的無血清培養(yǎng)基,替換為含有血清的培養(yǎng)基。

1.5分組 將實驗分為4組:正常組H9C2細(xì)胞用新鮮的培養(yǎng)基培養(yǎng);缺血缺氧再灌注損傷的H9C2細(xì)胞為模型組;將H9C2細(xì)胞進行缺血缺氧再灌注損傷后,先給予CD38抑制劑干預(yù),再給予酸棗仁皂苷A干預(yù)為CD38抑制劑+中藥單體組;將H9C2細(xì)胞進行缺血缺氧再灌注損傷后,給予酸棗仁皂苷干預(yù)為中藥單體組。

1.6CCK-8檢測細(xì)胞活力 將細(xì)胞接種在96孔板中,各組干預(yù)結(jié)束后,棄去原有培養(yǎng)液,用PBS洗滌。洗滌結(jié)束后每孔加入100 μl新鮮培養(yǎng)基,每孔加入10 μl CCK-8 溶液,置于細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育4 h,孵育結(jié)束后,將培養(yǎng)板放置在酶標(biāo)儀中,測量450 nm處的吸光度值。

1.7生化法檢測ROS水平 將細(xì)胞培養(yǎng)在96孔板中,各組干預(yù)結(jié)束后,棄去原來的培養(yǎng)基,用PBS洗滌后,每孔加入100 μl 終濃度為10 μmol/L的2′,7′-二氯熒光黃雙乙酸鹽(DCFH-DA)培養(yǎng)液,置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育20 min,培養(yǎng)結(jié)束后,用無血清細(xì)胞培養(yǎng)液洗滌3次,以充分去除未進入細(xì)胞內(nèi)的DCFH-DA,洗滌結(jié)束后,將96孔板放入酶標(biāo)儀中,在激發(fā)波長488 nm,發(fā)射波長525 nm處測量熒光強弱。

1.8生化法檢測ATP水平 將細(xì)胞接種在6孔板中,各組干預(yù)結(jié)束后,收集細(xì)胞,并加入適量ATP提取液,超聲波破碎1 min后,在10 000 r/min,4 ℃條件下離心10 min,取上清。加入適量的氯仿充分震蕩混勻,在10 000 r/min,4 ℃條件下離心3 min,取上清備用。將100 μl樣品或標(biāo)準(zhǔn)液分別與640 μl試劑一和260 μl工作液充分混勻后,立即在340 nm處測定10 s的吸光值A(chǔ)1,測定結(jié)束后立即放入37 ℃水浴中反應(yīng)3 min,拿出后立即測定其在340 nm處測定10 s的吸光值A(chǔ)2。根據(jù)公式△測定=A2測定管-A1測定管,△A標(biāo)準(zhǔn)=A2標(biāo)準(zhǔn)管-A1標(biāo)準(zhǔn),計算出ATP含量。

1.9ELISA檢測炎癥因子IL-1β、IL-6和TNF-α水平 將細(xì)胞培養(yǎng)在6孔板中,各組干預(yù)結(jié)束后,收集各組的細(xì)胞培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移至無菌離心管中,在4 ℃條件下,以1 000 r/min,離心10 min取上清,-20 ℃保存。每孔加入100 μl標(biāo)準(zhǔn)品及檢測樣品,封板后置于37 ℃培養(yǎng)箱中孵育90 min,孵育結(jié)束后洗板4次。洗滌結(jié)束后,每孔加入100 μl生物素化抗體工作液,37 ℃培養(yǎng)箱中孵育60 min,洗板4次后,每孔加入100 μl酶結(jié)合物工作液,置于37 ℃培養(yǎng)箱中孵育30 min。洗板結(jié)束后,每孔加入100 μl顯色底物,封板后置于37 ℃避光顯色14 min,每孔加入50 μl終止液,并用酶標(biāo)儀在450 nm波長處測量OD值。

1.10生化法檢測NAD+水平 將細(xì)胞接種于6孔板中,各組干預(yù)結(jié)束后,棄掉培養(yǎng)液,用PBS洗滌。洗滌結(jié)束后,每孔加入1 ml NAD+/NADH提取液,使之充分裂解,取上清為待測樣品備用。吸取20 μl待測樣品至96孔板中,以測定樣品中的NAD+和NADH的總量;吸取100 μl待測樣品于離心管中,60 ℃條件下加熱30 min以分解NAD+,加熱結(jié)束后取20 μl上清液加入96孔板中以測量樣品中NADH含量,37 ℃避光孵育10 min,每孔加入10 μl顯色液,混勻后,37 ℃避光孵育30 min,使用酶標(biāo)儀測量450 nm處的吸光度值,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算NAD+和NADH的總濃度及NADH濃度。

1.11Western印跡檢測CD38、SIRT3和NLRP3蛋白表達(dá) 將細(xì)胞接種在6孔板中,各組干預(yù)結(jié)束后,收集細(xì)胞,并用細(xì)胞全蛋白提取試劑盒提取總蛋白,用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白濃度,使用12%分離膠和5%濃縮膠進行電泳和轉(zhuǎn)膜,結(jié)束后加入適量的封閉液封閉60 min,加入一抗:抗CD38(1∶1 000),抗β-actin(1∶1 000),抗NLRP3(1∶1 000)抗體,在4 ℃條件下孵育過夜,孵育結(jié)束后,用洗滌液洗滌3次,每次10 min,洗滌結(jié)束后加入二抗抗兔(1∶10 000)、抗鼠(1∶10 000),室溫孵育 60 min,洗滌3次。每次10 min,洗滌結(jié)束后將配制好的顯影液滴加在聚偏氟乙烯(PVDF)膜上進行曝光成像。

1.12統(tǒng)計學(xué)分析 采用 GraphPad Prism8.0 軟件進行獨立樣本t檢驗、單因素方差分析、非參數(shù)檢驗。

2 結(jié) 果

2.1酸棗仁皂苷A能夠改善缺血缺氧再灌注的H9C2細(xì)胞的細(xì)胞活力 為了測定酸棗仁皂苷A對缺血缺氧再灌注H9C2細(xì)胞的最佳干預(yù)濃度,使用不同濃度(10、20、30、40、50 μmol/L)的酸棗仁皂苷A干預(yù)缺血缺氧再灌注的H9C2細(xì)胞,結(jié)果顯示濃度為40 μmol/L的酸棗仁皂苷A〔(68.43±2.48)%〕較10、20、30、50 μmol/L酸棗仁皂苷〔(48.06±4.96)%、(57.52±4.08)%、(60.17±3.95)%、(60.85±3.95)%〕更為顯著地改善細(xì)胞活力(P<0.05),因此后續(xù)實驗選用該濃度。CCK-8法檢測各組細(xì)胞活力結(jié)果顯示:與正常組〔(99.80±3.16)%〕相比,模型組細(xì)胞活力〔(46.06±5.90)%〕明顯下降(P<0.05),而給予酸棗仁皂苷A干預(yù)后細(xì)胞活力〔(66.83±4.31)%〕顯著提高(P<0.05);而與中藥單體組相比,CD38抑制劑+中藥單體組的細(xì)胞活力〔(79.82±7.56)%〕明顯增加(P<0.05)。

2.2酸棗仁皂苷A能夠改善缺血缺氧條件下H9C2細(xì)胞的線粒體功能障礙 與正常組相比,模型組細(xì)胞ATP含量顯著下降,ROS水平顯著增多(P<0.05)。與模型組相比,中藥單體組ATP含量明顯增加,ROS水平明顯下降(P<0.05)。與中藥單體組相比,CD38抑制劑+中藥單體組ATP水平明顯增加,ROS水平明顯下降(P<0.05),見表1。

2.3酸棗仁皂苷A能夠改善缺血缺氧再灌注H9C2細(xì)胞的炎癥反應(yīng) 與正常組相比,模型組細(xì)胞炎癥因子IL-1β、IL-6和TNF-α水平顯著升高(P<0.05)。而給予酸棗仁皂苷A干預(yù)后,炎癥因子IL-1β、IL-6和TNF-α水平明顯下降(P<0.05)。與中藥單體組相比,CD38抑制劑+中藥單體組細(xì)胞炎癥因子IL-1β、IL-6和TNF-α水平明顯下降(P<0.05),見表1。

表1 各組細(xì)胞中ATP、ROS、炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-α水平比較

2.4酸棗仁皂苷A能夠改善缺血缺氧再灌注的H9C2細(xì)胞的能量代謝障礙 與正常組相比,模型組細(xì)胞NAD+水平和NAD+/NADH比值明顯下降(P<0.05),NADH無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。與模型組相比,中藥單體組NAD+水平及NAD+/NADH比值明顯上升(P<0.05),NADH無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。與中藥單體組相比,CD38抑制劑+中藥單體組能夠更為有效地提高H9C2細(xì)胞內(nèi)NAD+水平及NAD+/NADH比值(P<0.05),見表2。

2.5酸棗仁皂苷A能夠改善缺血缺氧再灌注的H9C2細(xì)胞中CD38、SIRT3和NLRP3蛋白表達(dá) 與正常組相比,模型組細(xì)胞中CD38、NLRP3蛋白表達(dá)明顯增加,SIRT3蛋白表達(dá)明顯下降(P<0.05)。而給予酸棗仁皂苷A干預(yù)能夠明顯降低CD38、NLRP3蛋白表達(dá)明顯增加SIRT3蛋白表達(dá)(P<0.05)。與中藥單體組相比,CD38抑制劑+中藥單體組能夠更加顯著降低CD38、NLRP3蛋白表達(dá),明顯提高SIRT3蛋白表達(dá)水平(P<0.05),見表2、圖1。

表2 各組細(xì)胞中能量代謝分子NAD+、NADH含量、NAD+/NADH、CD38、SIRT3和NLRP3蛋白表達(dá)水平比較

1～4:正常組、模型組、CD38抑制劑+中藥單體組、中藥單體組圖1 Western印跡法檢測各組CD38、SIRT3和NLRP3蛋白表達(dá)

3 討 論

心肌細(xì)胞的缺血缺氧再灌注損傷是由于血流量減少導(dǎo)致長時間的缺血缺氧,而恢復(fù)血流灌注后由于氧化應(yīng)激反應(yīng)產(chǎn)生的大量ROS引起的,是心肌梗死、惡性心律失常和心力衰竭的重要發(fā)病因素〔14,15〕。心臟的高能量需求,使心臟極易受到能量代謝紊亂的影響,因此充足的ATP供應(yīng)是維持正常心臟功能的重要保證〔16〕。在正常狀態(tài)下,心臟可利用脂肪酸、葡萄糖、酮體、乳酸和氨基酸等多種底物,并通過氧化代謝提供能量〔17〕。然而在心肌細(xì)胞缺血缺氧狀態(tài)下,心肌細(xì)胞的代謝途徑隨之改變,心肌細(xì)胞依靠糖酵解功能,但是這種代謝方式是不可持續(xù)的〔18〕。研究發(fā)現(xiàn),缺血缺氧的心肌細(xì)胞中線粒體生物合成減少,氧化磷酸化功能受損,引起心臟功能和結(jié)構(gòu)發(fā)生改變,最終引起心力衰竭的發(fā)生和發(fā)展〔19〕。本實驗發(fā)現(xiàn),缺血缺氧再灌注的H9C2細(xì)胞發(fā)生線粒體功能障礙。

NAD+對維持心肌細(xì)胞的正常功能具有重要作用,對心肌組織有廣泛的保護作用。NAD+/NADH比值對產(chǎn)生ATP的氧化還原反應(yīng)速率至關(guān)重要〔20〕。在缺血缺氧環(huán)境中,NAD+含量急劇下降,引起線粒體呼吸鏈?zhǔn)軗p,加重線粒體氧化應(yīng)激損傷,引起能量代謝障礙〔21〕。本研究結(jié)果顯示,在缺氧缺血再灌注H9C2細(xì)胞發(fā)生能量代謝障礙。在病理狀態(tài)下,NAD+降解酶的異常激活可能是NAD+快速減少的重要原因〔22〕。NAD+降解酶分為3類:sirtuins,聚-ADPR(PARP)和環(huán)狀A(yù)DPR(cADPR,CD38和CD157)。CD38作為NAD+的重要降解酶,能通過直接和間接途徑降解NAD+和NAD+前體〔23〕。CD38也是免疫細(xì)胞的質(zhì)膜信號受體,能調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞的增殖、活化和遷移,是重要的炎癥調(diào)節(jié)因子〔24〕。本實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn),在缺血缺氧再灌注的H9C2細(xì)胞中,發(fā)生炎癥反應(yīng)。提示在缺血缺氧再灌注的H9C2細(xì)胞中,CD38水平增加可能是NAD+快速下降的主要原因,引起下游SIRT3蛋白表達(dá)下降,并且加劇了炎癥反應(yīng)。

在臨床治療心肌缺血缺氧再灌注過程中,治療手段主要包括直接冠狀動脈介入治療、溶栓治療及藥物治療,但存在著病情反復(fù)惡化,如心功能下降、心律失常及心肌出血性壞死等〔25〕。而中醫(yī)藥對心肌缺血缺氧再灌注損傷的治療效果逐漸引起重視。鼠李科植物酸棗的種子酸棗仁,味甘,性平,具有寧心安神,平肝理氣之效,對失眠和心悸有良好的治療作用。酸棗仁的有效成分酸棗仁皂苷能夠有效地鎮(zhèn)靜、抗抑郁及改善記憶。酸棗仁皂苷A是酸棗仁皂苷類化合物的主要成分之一,具有抗氧化、抗炎、抗缺氧、保護神經(jīng)元和心臟活動等功效。本實驗結(jié)果顯示,酸棗仁皂苷A能夠改善缺血缺氧再灌注的H9C2細(xì)胞活力,改善炎癥反應(yīng),且抑制CD38表達(dá),能夠有效改善缺血缺氧的H9C2細(xì)胞能量代謝和線粒體功能障礙,減緩炎癥反應(yīng),提示抑制CD38的異常激活能更為有效的改善缺血缺氧再灌注的H9C2細(xì)胞的能量代謝障礙、線粒體功能損傷和神經(jīng)炎癥,這也可能是酸棗仁皂苷A發(fā)揮作用的重要靶點。

綜上,酸棗仁皂苷A能夠通過抑制CD38的表達(dá),改善能量代謝障礙和線粒體功能,減緩炎癥反應(yīng)和心肌缺血缺氧再灌注損傷。