基于NLRP3炎性相關因子觀察鳶尾素對腦梗死大鼠神經元細胞焦亡及梗死面積的影響

王式林 張軍輝 魏守蓉 李倩 馬清峰

(華中科技大學同濟醫學院附屬梨園醫院,湖北 武漢 430062)

近年來,心腦血管疾病的發病率呈上升趨勢,腦梗死是由腦部供血受阻和缺血灶不可逆損傷導致的中樞神經系統疾病,涉及血腦屏障損傷、細胞凋亡增加、氧化應激等多種復雜的病理及生理機制〔1〕。急性腦梗死時期,腦部中央帶缺血區神經元會在數分鐘內發生不可逆性壞死,出現神經功能缺損等癥狀,進而導致神經元細胞焦亡及生物功能喪失〔2〕。神經元細胞焦亡是基因調控細胞程序性死亡的過程,因此,抑制腦部神經元區細胞焦亡有利于保護神經功能。鳶尾素是最新發現的一種多肽因子,存在于運動后的骨骼肌中,是由Ⅲ型纖連蛋白包含蛋白5及C末端剪切后的酶所形成的,可參與白色脂肪的褐變及產熱,廣泛分布于血液、唾液、腦脊液等多種體液中,具有抗炎、抗凋亡、抗氧化應激等多種生物學效應,對增強機體胰島素敏感性和調節糖代謝失衡等均具有重要意義〔3〕。Nod樣受體蛋白(NLRP)3是一種存在于細胞胞質中的多蛋白復合物,由NLRP3、半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶(Caspase)-1及斑點樣蛋白(ASC)結合形成,是天然免疫系統的重要組成部分〔4〕。核心蛋白NLRP3被激活后,通過銜接蛋白及無活性的Caspase-1而形成NLRP3炎癥復合體〔5〕。相關研究表明,NLRP3炎癥小體與多種代謝性疾病關系密切,如阿爾茨海默病、2型糖尿病、動脈粥樣硬化等。但NLRF3炎癥小體在腦梗死中具體機制仍然尚不明確〔6〕。本文基于NLRP3炎癥相關因子觀察鳶尾素對腦梗死大鼠神經元細胞焦亡及梗死面積的影響。

1 材料與方法

1.1實驗大鼠 選取雌雄各半的健康級大鼠40只,4～6月齡,體質量150～250 g,由基爾頓生物科技(上海)提供,嚴格按照《實驗動物管理條例》規定進行實驗,動物許可證號:SYXK(上):2019-0055,室溫控制在15～20 ℃室內飼養,濕度約為75%每日12 h光照,喂養條件為自由攝取標準飼料,飲用干凈自來水。

1.2儀器與試劑 透射電鏡(美國Bio-Rad公司),顯微鏡(重慶光學儀器廠產XSZ-5B),聚偏氟乙烯(PVDF)膜、切片機(上海醫用儀器廠),一次性無菌注射器、電泳儀(桂林中輝科技發展有限公司),TUNEL試劑盒(武漢中健科技開發公司),鳶尾素、生理鹽水(重慶天圣制藥有限公司),NLRP3抑制劑(Sigma-Aldrich 公司),檸檬酸緩沖液、酶聯免疫吸附試驗(EALISA)試劑盒(上海生物工程有限公司),β-actin單克隆抗體、辣根過氧化酶標記抗兔IgG、胎牛血清(南京建成生物工程研究所),氯胺酮、NLRP3、NLRP1、Caspase-1、IL-1β(重慶藥友制藥有限公司)。

1.3建模 除正常組10只大鼠外,將其余大鼠采用1%戊巴比妥鈉進行麻醉后,俯臥剝離暴露皮膚,頭部正中偏右切口,分離出頸總、頸內和頸外動脈,頸外遠心端結扎,動脈夾阻斷總頸和頸內的血流,插入栓線,打開動脈夾,推進栓線至遇到阻力,將栓線深插致17 mm,2 h后麻醉,拔出栓線,造模后給予大鼠抗感染護理,自由飲水攝食,造模成功標準按照神經功能損傷(Zea-longa)評分原則判定,1～3分為造模成功。

1.4分組與給藥 將40只大鼠隨機分為正常組、模型組、鳶尾素組、阿司匹林組,正常組及模型組采用5 μl磷酸鹽緩沖液(PBS)側腦室注射,阿司匹林組采用5 μl PBS中加入 0.4 μg(15 μg/kg)阿司匹林側腦室注射,鳶尾素組采用5 μl PBS中加入0.30 μg(15 μg/kg)鳶尾素側腦室注射,NLRP3抑制劑組采用NLRP3抑制劑10 μg/kg側腦室注射。

1.5標本采集 干預后,禁食14～16 h大鼠,抽取腹部靜脈血1 ml,5 ℃測空腹血糖,3 500 r/min離心10 min,上清液1 ml裝于1.5 ml Ep管中,-20 ℃冰箱保存待測。經腹腔注射氯胺酮40 mg/kg麻醉,待大鼠麻醉后斷頭取腦組織,2 mm厚度切片,浸泡于甲醛溶液中固定,以上標本均暫凍存于-70 ℃冰箱中備用。

1.6ELISA檢測血清白細胞介素(IL)-6、白細胞介素(IL)-1、腫瘤壞死因子(TNF)-α表達 抽取大鼠腹部動脈血1 ml,采用低速離心機按照3 000 r/min離心10 min后保留上清液,ELISA檢測NLRP3、Caspase-1、IL-1β血清水平,嚴格按照試劑盒說明書操作,在對應孔板中加入200 μl標準品工作液,進行37 ℃恒溫孵箱孵育1 h,取出孔板去板內液體后加200 μl生物素化抗體工作液,進行37 ℃恒溫孵箱孵育60 min,取孔板后去板內液體并沖洗3次,洗滌后每孔加200 μl辣根過氧化物酶(HRP)酶結合物工作液,進行37 ℃恒溫孵箱孵育30 min,洗滌后每孔加入60 μl底物溶液,進行37 ℃恒溫孵箱孵育30 min,加入50 μl終止液,在500 nm波長處檢測OD值,根據標準曲線和OD值計算NLRP3、Caspase-1、IL-1β的含量。

1.72,3,5-氯化三苯基四氮唑(TCC)染色檢測腦梗死面積 末次灌胃后,頸部脫臼處死大鼠提取腦組織,-20 ℃低溫冷凍保存30 min后,每個腦組織且6張切片,厚度為2 mm,放入3%的TTC溶液后避光孵育30 min,采用圖像分析系統計算心梗體積,梗死灶比例(%)=(梗死總面積+腦片總面積)×100%,療效評價標準:T/C(%)=治療組腦梗死灶比例/對照組腦梗死灶比例×100%,T/C(%)>60%為無效,T/C≤60%。

1.8HE染色 取大鼠組織樣品后經過梯度濃度酒精脫水,再放置于二甲苯中透明,后放入石蠟中包埋。使用切片機將組織切片,每張切片厚度為2 μm,染色前將石蠟切片置于二甲苯中脫去石蠟,10%中性甲醛固定做石蠟切片,依次由無水乙醇、95%乙醇、85%乙醇和 60%乙醇梯度脫水后清水沖洗,于75 ℃烤箱中烘烤15 min后于蘇木素中染色15 min,清洗后采用伊紅染色1 min,70 ℃烘干后進行中性樹脂封片,將組織切片于顯微鏡下觀察后拍照。

1.9TUNEL檢測神經元細胞焦亡 將厚度為2 μm的腦組織石蠟切片脫蠟至水,經PBS清洗3次,3 min/次,室溫孵育10 min,抑制內源性過氧化物酶,PBS沖洗3次,3 min/次,15 μg/ml蛋白酶K消化15 min,37 ℃,PBS沖洗3次,3 min/次,浸入37 ℃ TUNEL混合液1 h〔200 μl中含1 μl脫氧核苷酸末端轉移酶(TdT) 20 U/ml和1 μl FITC-duTP混合液〕,PBS沖洗3次,3 min/次,0.05%H2O2顯色5 min并采用流水沖洗終止反應,蘇木素染1 min水洗后鹽酸乙醇分化30 s,水洗藍化以常規樹脂封片,光鏡下觀察焦亡細胞呈棕黃色,每張切片在200倍鏡下隨機選擇10個視野進行觀察。

1.10Western印跡檢測NLRP3、NLRP1、Caspase-1、IL-1β蛋白表達 取大鼠腦組織切片,冰上研磨成組織勻漿,RIPA裂解液適量進行裂解3 ℃低溫離心15 min,取上清液,測蛋白濃度進行定量。取10 μg蛋白上樣,凝膠電泳,電泳結束后轉膜,進行牛奶封閉、TBST漂洗,然后加入一抗NLRP3(1∶500)、NLRP1(1∶500)、Caspase-1(1∶1 000)、IL-1β(1∶2 000),置于4 ℃冰箱過夜,加入辣根過氧化物酶標記的二抗(1∶1 000),PBS沖洗后加入復合物孵1 h后二氨基聯苯胺(DAB)顯色后分別雜交,PBS沖洗后將膜浸入電化學發光(ECL)工作液,經成像顯影拍照,采用ImageJ分析軟件對條帶灰度值進行定量分析。

1.11統計學方法 采用GraphPad Prism8.0軟件進行單因素方差分析。

2 結 果

2.1各組血清中炎性因子IL-6、IL-1、TNF-α表達 與正常組比較,模型組血清中炎性因子IL-6、IL-1、TNF-α水平明顯升高(P<0.05);與模型組比較,鳶尾素組IL-6、IL-1、TNF-α水平明顯降低(P<0.05);與鳶尾素組比較,阿司匹林組IL-6、IL-1、TNF-α水平明顯升高(P<0.05);鳶尾素組與NLRP3抑制劑組以上指標無統計學差異(P>0.05)。見表1。

2.2各組腦梗死面積表達 與正常組比較,模型組腦梗死面積明顯較大(P<0.05);與模型組比較,鳶尾素組腦梗死面積明顯減小(P<0.05);與鳶尾素組比較,阿司匹林組腦梗死面積明顯較大(P<0.05);鳶尾素組與NLRP3抑制劑組以上指標無統計學差異(P>0.05)。見表1、圖1。

2.3各組Zea-longa評分比較 與正常組比較,模型組Zea-longa評分明顯升高(P<0.05);與模型組比較,鳶尾素組Zea-longa評分明顯降低(P<0.05);與鳶尾素組比較,阿司匹林組Zea-longa評分明顯升高(P<0.05);鳶尾素組與NLRP3抑制劑組以上指標無統計學差異(P>0.05)。見表1。

表1 各組IL-6、IL-1、TNF-α水平、腦梗死面積及腦組織Zea-Longa評分比較

圖1 各組腦梗死面積(TCC染色)

2.4各組腦組織HE染色 正常組腦組織神經元細胞胞質飽滿,無明顯核破裂現象,組織結構清晰;模型組腦組織皮層區可見大量神經元細胞胞質空泡化、細胞核固縮,且組織紊亂、結構疏松、對側較淺且核破裂明顯;鳶尾素組與NLRP3抑制劑組的細胞胞質空泡化及神經元細胞核固縮減少,腦組織接近正常生理結構;阿司匹林組細胞核仍有組織結構疏松及核固縮、核破裂現象。見圖2。

2.5各組神經元細胞焦亡率比較 與正常組比較,模型組神經元細胞焦亡率明顯升高(P<0.05);與模型組比較,鳶尾素組細胞焦亡率明顯降低(P<0.05);與鳶尾素組比較,阿司匹林組細胞焦亡率明顯降低(P<0.05);而鳶尾素組與NLRP3抑制劑組以上指標無統計學差異(P>0.05)。見表2、圖3。

2.6各組腦組織NLRP3、Caspase-1、NLRP1、IL-1β蛋白表達 與正常組比較,模型組NLRP3、NLRP1、Caspase-1、IL-1β蛋白表達明顯升高(P<0.05);與模型組比較,鳶尾素組NLRP3、NLRP1、Caspase-1、IL-1β表達明顯降低(P<0.05);與鳶尾素組比較,阿司匹林組NLRP3、NLRP1、Caspase-1、IL-1β表達明顯升高(P<0.05);而鳶尾素組與NLRP3抑制劑組以上指標無統計學差異(P>0.05)。見表2、圖4。

圖2 各組腦組織(HE染色,×200)

表2 各組神經元細胞焦亡及NLRP3、NLRP1、Caspase-1、IL-1β蛋白表達

圖3 各組神經元(TUNEL染色,×200)

1～5:正常組、模型組、NLRP3抑制劑組、鳶尾素組、阿司匹林組圖4 各組NLRP3、NLRP1、Caspase-1、IL-1β蛋白表達

3 討 論

腦梗死為臨床常見心腦血管疾病,主要由局灶缺血、腦組織水腫、乳酸累積及代謝紊亂等因素引起,該疾病的發病率較高,且致死率及致殘率居高不下,嚴重影響患者健康及生命安全〔7〕。因此,及時采用有效的藥物和制定合理的治療方案,對該病的治療和預后具有極其重要的意義。鳶尾素是一種由運動誘導產生的細胞因子,可促進白色脂肪組織轉變為含有大量解耦聯蛋白的棕色脂肪組織,并將線粒體內氧化產生的能量以熱能的方式進行擴散,進而促進能量消耗并發揮調節能量代謝的作用〔8〕。研究發現,鳶尾素可參與多種腫瘤的發生和發展,對腫瘤細胞具有一定的抑制作用,并在疾病中被證實具有抑制骨質流失、肌肉萎縮、認知功能障礙及抑郁等功效〔9〕。因此,對鳶尾素的研究不僅對大腦中樞神經系統起著重要作用,也對日后相關疾病的預防和治療也極具重要意義。

近年來,胞質內模式識別體的相關炎癥小體與機體損傷的關系受到廣泛關注,而激活后形成的炎癥小體可剪切活化為蛋白前體,并產生和釋放IL-6、IL-1、TNF-α及具有其他生物活性的相關炎性因子〔10〕。本研究結果表明,鳶尾素對降低腦梗死大鼠血清中炎性因子IL-6、IL-1、TNF-α表達具有一定意義。吳嘉迪等〔11〕研究表示,在疾病早期會出現巨噬細胞、中性粒細胞等炎性細胞的聚集,并釋放出相關炎癥因子,而這些炎癥因子作為細胞外的刺激信號可使炎癥細胞活化、放大,最終導致機體內炎性反應機制過度,進而促進疾病的形成。因此,降低炎癥因子的產生,是治療相關疾病的關鍵問題。盧俊顏等〔12〕研究表示,鳶尾素在相關疾病中可能通過刺激內皮細胞,抑制炎性因子在協同作用下對細胞外膜產生的刺激,加速細胞間的物質代謝,進而改善機體微循環的狀態,降低炎癥的發生發展。相關藥理學表示,鳶尾素對缺血腦組織具有保護作用,其作用機制可能與抑制腦組織中基質金屬蛋白酶-9的表達,降低興奮性氨基酸毒性,減少腦組織血腦屏障的細胞外基質降解,改善血腦屏障的通透性,減輕血腦屏障損傷和缺血后腦水腫等機制有關〔13〕。本文結果與之研究相類似。

腦組織損害的實質是自由基通過引起神經細胞生物膜和炎癥因子的過氧化及微量元素失衡所造成的,而組織結構功能的破壞程度與梗死的面積也具有一定的相關性〔14〕。本研究結果表明,鳶尾素對縮短大鼠腦梗死面積與降低神經損傷評分方面具有一定作用。腦部發生病變時機體會處于應激狀態,導致血糖和應激反應等指標失衡,會使得神經細胞產生退行性病變、壞死、膠質細胞增生及多巴胺減少等現象,進而可使腦部血管內膜增厚進而導致腦血栓形成、梗死面積增大等相關病變反應的產生〔15〕。金朝等〔16〕研究表示,鳶尾素具有改善機體中蛋白活性及神經元炎性因子的作用,可能通過調節疾病中相關微量元素和超氧化物歧化酶、單胺氧化酶,進而參與血紅蛋白和多種酶的合成,維持疾病中中樞神經系統功能和血管壁纖維的彈性,從而抑制神經細胞退變、壞死所導致的血管內膜增厚和病灶面積擴大現象產生。

細胞凋亡和細胞焦亡都是細胞的程序性死亡,在形態上細胞焦亡具有壞死與凋亡的特征,是由NLRP3、NLRP1等相關炎性因子所介導的,并伴隨出現核濃縮和DNA斷裂等特性〔17〕。神經元細胞焦亡不僅是腦部疾病早期的重要病理改變,也是相關并發癥形成的基本條件,并作為引起腦損傷產生的核心機制之一,與腦部病變有著密切的聯系。本研究結果表明,鳶尾素對抑制腦梗死大鼠神經元細胞焦亡具有一定效果。相關研究表示,神經元細胞焦亡的產生可能與海馬組織中NLRP炎癥小體激活后相關蛋白表達上調及Caspase-1、IL-1β等相關蛋白表達的增多有關,提示NLRP3炎癥小體觸發Caspase-1的激活,進而促進了NLRP3、NLRP1、IL-1β的分泌,導致相關疾病中的神經元細胞焦亡和炎性損傷產生〔18〕。本文推測鳶尾素可能通過抑制疾病中NLRP相關炎癥小體激活和相關蛋白表達,通過擴張血管并協助微循環進而充當機體內氧自由基的清除劑,使神經元細胞的形態改善、數量增多,從而減少神經元細胞焦亡和炎性損傷狀況。但鳶尾素是否具有良好的抗神經元細胞焦亡的作用仍需深入研究。

綜上,鳶尾素可能對抑制神經元細胞焦亡,降低NLRP3、Caspase-1、IL-1β等相關因子表達及減少腦梗死面積等方面具有一定影響,其作用機制可能是通過介導NLRP3的表達來進行的。然而對于腦梗死的發生發展的相關影響因素有很多且機制復雜,本次研究仍存在一定不足,關于鳶尾素在抑制腦梗死疾病中的應用仍需進一步探究。