基于PGE2/COX-2信號通路探究扶正祛瘀解毒方對結腸癌細胞增殖、凋亡、遷移和侵襲的影響

胡金煥 劉經選 王蘭 連建倫 趙博 王剛

(1河北省中醫院腫瘤一科,河北 石家莊 050000;2河北醫科大學實驗診斷教研室;3河北省中醫院腎病一科)

結腸癌(CC)是常見的人類胃腸道癌癥之一,在全球癌癥發病率中排名第三〔1〕。可用的癌癥治療方法有手術切除、化療和輔助治療,迄今為止,手術切除癌組織被認為是治療CC的最合適方法,但由于CC細胞向腫瘤周圍和遠端器官侵襲和遷移導致術后腫瘤的轉移率依然很高〔2〕。因此,迫切需要更有效和更安全的CC治療策略。扶正祛瘀解毒方具有健脾養血、解毒祛瘀等功效,其與化療配合使用,在臨床上對CC的治療具有令人滿意的療效,不但減輕了患者的痛苦和醫療成本及經濟負擔,而且提高了患者的生存質量〔3,4〕。因此,利用現代科研手段對其進行細致、深入和系統的研究,將其進一步推廣應用十分必要。以往研究發現,環氧合酶(COX)-2及其產物前列腺素(PG)E2在CC腫瘤發生和預后中起著關鍵作用〔5,6〕。臨床研究表明,塞來昔布不僅是一種COX-2抑制劑,而且可用于CC術后化療〔7〕。本研究基于PGE2/COX-2信號通路探討扶正祛瘀解毒方對CC細胞系HCT-116細胞增殖、凋亡、遷移和侵襲的影響。

1 材料與方法

1.1材料 人CC細胞系HCT-116細胞、RPMI1640(含HEPES、雙抗)培養基、胎牛血清均購自上海YAJI,貨號:YS2017C、PM150113A、C0234。CCK-8毒性檢測試劑盒購自北京YITA,貨號:YT8193;塞來昔布(純度:99.59%)、PGE2(純度:98.04%)均購自美國MedChemExpress,貨號:HY-14398、HY-101952;膜聯蛋白Ⅴ-異硫氰酸熒光素/碘化丙啶(Annexin Ⅴ-FITC/PI)雙染細胞凋亡檢測試劑盒購自上海Fuyuanbio,貨號:FY600003-20T;基質膠包被Transwell侵襲小室購自美國BD BIOCOAT,貨號:354481;PGE2酶聯免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒購自武漢Sino best,貨號:YX-E10702;一抗COX-2(72 kD)、PGE2受體EP2(52 kD)、EP4(65 kD)和β-actin(42 kD)均購自Abcam公司,貨號:ab179800、ab167171、ab217966和ab8226。

1.2細胞培養 HCT-116細胞在含有10%胎牛血清的RPMI1640培養基,始終維持在37 ℃、5% CO2的培養箱中,常規培養。

1.3扶正祛瘀解毒方的制備〔8〕扶正祛瘀解毒方:太子參、白花蛇舌草和生牡蠣各30 g;半枝蓮、熟地黃和丹參各20 g;茯苓、白術、瓜蔞、大血藤、藤梨根、野葡萄藤、菝葜、莪術、生蒲黃、夏枯草、預知子、焦山楂、焦麥芽和焦神曲各15 g;當歸、赤芍、陳皮、姜半夏和枳殼各15 g。該藥為院內制劑,于河北省中醫院藥房稱重配齊。依據臨床用藥煎煮方法配制成為1 g含2.015 g的生藥浸膏,分裝于密閉玻璃瓶中,低溫保存。使用時經RPMI1640培養基(含10%胎牛血清)配制成為相應濃度的藥液。

1.4CCK-8法檢測細胞毒性 將對數期增殖生長的HCT-116細胞接種于96孔板中(5×103個/孔),分別加入扶正祛瘀解毒方終質量濃度為0.00(對照)、0.25、0.50、0.75、1.00、1.25和1.50 g/L的溶液,同時使用等量的培養基作為空白組,培養24 h,添加10 μl CCK-8溶液孵育4 h,使用酶標儀在450 nm波長處檢測各孔細胞的光密度(OD)值。細胞增殖活力(%)=(OD處理組-OD空白組)/(OD對照組-OD空白組)×100%。

1.5細胞分組 將對數期增殖生長的HCT-116細胞接種于96孔板中(3×103個/孔),依次分為對照組、塞來昔布組、扶正祛瘀解毒方組和聯合組。對照組不進行任何處理;塞來昔布組加入30 mg/L 塞來昔布培養〔9〕;扶正祛瘀解毒方組加入1 g/L扶正祛瘀解毒方培養;聯合組加入2 mg/L PGE2〔10〕和1 g/L扶正祛瘀解毒方共同培養。培養24 h后用于后續實驗研究。

1.6集落形成實驗檢測細胞增殖 將按照上述分組方法處理的各組HCT-116細胞以每孔300個細胞的密度接種在6孔板,常規培養,每4 d更換1次培養基。培養2～3 w后出現肉眼可見的克隆時終止培養,使用結晶紫染色。通過顯微鏡觀察并獲取圖像,計算超過50個細胞的集落數。集落形成率的計算公式為:集落形成率(%)=(集落數/培養細胞數)×100%。

1.7流式細胞術檢測細胞凋亡 收集按照上述方法培養的各組HCT-116細胞,以4×105個/孔細胞的密度接種在6孔板中并連續培養48 h,在使用預冷的磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗后,分別按照試劑盒說明書添加Annexin Ⅴ-FITC和PI,最后經流式細胞儀進行細胞凋亡檢測。

1.8劃痕愈合實驗評估細胞遷移能力 將按照上述分組方法處理的各組HCT-116細胞以4×105個/孔細胞的密度接種在6孔板中并連續培養,直至單層細胞均勻分布在板的整個底部。使用微量移液管尖端在細胞表面緩慢且均勻的產生劃痕。使用PBS沖洗板數次,直至去除所有未附著的細胞,然后再使用不含血清的培養基培養。在顯微鏡下分別于0和48 h對劃痕進行拍照,測量劃痕寬度,計算劃痕愈合率(表示細胞遷移能力)。劃痕愈合率=(0 h劃痕寬度-48 h劃痕寬度)/0 h劃痕寬度×100%。

1.9Transwell實驗評估細胞侵襲能力 將按照上述分組方法處理的各組HCT-116細胞使用無血清的培養基饑餓培養12 h后,使用無血清的培養基制備形成細胞懸浮液(2×105個/ml),吸取200 μl懸浮液添加到覆蓋有基質膠的Transwell小室上層,同時將500 μl正常培養基加入下室。培養48 h后,將腔室從培養箱中取出,使用甲醇固定30 min后經結晶紫染色20 min。使用去離子水沖洗幾次,使用棉簽輕輕擦拭掉底部上表面的細胞。觀察下表面的侵入細胞(表示細胞侵襲能力)并在顯微鏡下拍攝圖像。

1.10ELISA實驗檢測PGE2濃度 將按照上述分組方法處理的HCT-116細胞接種在24孔板中(1×105個/ml)。培養48 h后收集培養基,按照試劑盒說明書檢測細胞上清液中PGE2的濃度。

1.11Western印跡檢測細胞中COX-2、EP2、EP4蛋白表達 收集按照上述方法處理的各組HCT-116細胞,使用RIPA法提取各組細胞蛋白質。取等量的蛋白質樣品進行10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)后轉移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上。添加5%脫脂奶粉封閉2 h,添加一抗COX-2、EP2、EP4和β-actin在4 ℃下過夜孵育。一抗孵育后使用二抗孵育,經電化學發光(ECL)顯影后凝膠成像系統拍照,最后通過ImageJ軟件分析蛋白質灰度值,以目的蛋白與內參蛋白的灰度值的比值作為目的蛋白的相對表達水平。

1.12統計學分析 采用SPSS18.0軟件進行Studentt檢驗、單因素方差分析。

2 結 果

2.1扶正祛瘀解毒方毒性檢測 扶正祛瘀解毒方質量濃度為0.00、0.25、0.50、0.75、1.00、1.25、1.50 g/L時,HCT-116細胞的增殖活性分別為〔(99.36±1.09)%、(95.23±3.54)%、(91.66±4.18)%、(88.69±6.99)%、(83.54±7.08)%、(76.69±7.55)%、(65.22±8.16)%〕。當扶正祛瘀解毒方質量濃度超過1 g/L時,HCT-116細胞的增殖活力明顯降低(P<0.05),表明扶正祛瘀解毒方大于1 g/L時,其對HCT-116細胞增殖活力影響較大,因此選擇1 g/L的扶正祛瘀解毒方濃度進行后續研究。

2.2各組HCT-116細胞增殖、凋亡情況 如圖1、圖2、表1所示,與對照組相比,塞來昔布組和扶正祛瘀解毒方組HCT-116細胞集落形成率明顯降低,細胞凋亡率明顯增高(P<0.05);與塞來昔布組相比,扶正祛瘀解毒方組HCT-116細胞集落形成率明顯增高,細胞凋亡率明顯降低(P<0.05);與扶正祛瘀解毒方組相比,聯合組HCT-116細胞集落形成率明顯增高,細胞凋亡率明顯降低(P<0.05)。

圖1 集落形成實驗檢測各組HCT-116細胞集落形成

圖2 流式細胞術檢測各組HCT-116細胞凋亡

表1 各組HCT-116細胞增殖、凋亡情況

2.3各組HCT-116細胞遷移、侵襲情況 如表2、圖3所示,與對照組相比,塞來昔布組和扶正祛瘀解毒方組HCT-116細胞遷移、侵襲能力明顯降低(P<0.05);與塞來昔布組相比,扶正祛瘀解毒方組HCT-116細胞遷移、侵襲能力明顯增高(P<0.05);與扶正祛瘀解毒方組相比,聯合組HCT-116細胞遷移、侵襲能力明顯增高(P<0.05)。

2.4各組HCT-116細胞上清液中PGE2含量 如表2所示,與對照組相比,塞來昔布組和扶正祛瘀解毒方組HCT-116細胞上清液中PGE2含量明顯降低(P<0.05);與塞來昔布組相比,扶正祛瘀解毒方組HCT-116細胞上清液中PGE2含量明顯增高(P<0.05);與扶正祛瘀解毒方組相比,聯合組HCT-116細胞上清液中PGE2含量增高(P<0.05)。

2.5各組HCT-116細胞中COX-2、EP2和EP4蛋白表達 如表2、圖4所示,與對照組相比,塞來昔布組和扶正祛瘀解毒方組HCT-116細胞中COX-2、EP2和EP4蛋白表達明顯降低(P<0.05);與塞來昔布組相比,扶正祛瘀解毒方組HCT-116細胞中COX-2、EP2和EP4蛋白表達明顯增高(P<0.05);與扶正祛瘀解毒方組相比,聯合組HCT-116細胞中COX-2、EP2和EP4蛋白表達明顯增高(P<0.05)。

表2 各組HCT-116細胞遷移、侵襲、上清液中PGE2含量及細胞COX-2、EP2和EP4蛋白表達比較

圖3 各組HCT-116細胞遷移及侵襲(結晶紫染色)

1～4:對照組、塞來昔布組、扶正祛瘀解毒方組、聯合組圖4 Western印跡檢測各組HCT-116細胞中COX-2、EP2和EP4蛋白表達

3 討 論

在臨床上多種中醫藥已被證明是CC除了手術和化療的重要替代治療選擇,證明中藥治療癌癥非常有效〔10,11〕。因此,研究中藥及其成分抗腫瘤活性的機制變得越來越重要。

扶正祛瘀解毒方由多種天然傳統中草藥制備而成,早期臨床研究顯示,其在大腸癌、非小細胞肺癌等多種癌癥中具有抗腫瘤功效〔4,12〕。本研究結果說明,扶正祛瘀解毒方可抑制CC細胞系HCT-116細胞的增殖、遷移和侵襲,促進細胞凋亡。

有研究表明,COX-2作為一種限速酶參與了花生四烯酸形成PGE2的過程,并在CC組織中過度表達,可通過促進腫瘤細胞增殖、腫瘤血管生成和腫瘤細胞附著及抑制細胞凋亡,促進轉移,COX-2水平升高通常與CC的發生和進展相關〔5〕。COX-2在結直腸癌中的表達比正常組織高80%～90%,其他癌癥,如頭部、乳房、子宮頸、膀胱和胃腸系統的癌癥,也表現出高水平的COX-2表達,各種流行病學和臨床研究表明,服用塞來昔布等非甾體抗炎藥可降低包含CC在內的人類各種癌癥的發病率〔13〕。此外,塞來昔布還可通過預防多藥耐藥顯著提高化療療效〔14〕。選擇性COX-2抑制劑在體內外均顯示出抗癌活性,越來越多的證據表明,靶向COX-2的小分子抑制劑可阻礙結直腸癌的發生〔15〕。本研究結果表明,扶正祛瘀解毒方與塞來昔布功能相似,提示扶正祛瘀解毒方可能在降低CC發病率方面與非甾體抗炎藥具有相似的效果,且安全性相對較高。

PG是一種具有多種功能的激素,可參與調控多種疾病的進展,包括癌癥等慢性疾病〔16〕。有研究表明,參與CC的PG形式主要是PGE2,PGE2及其受體EP1、EP2、EP3和EP4在血管生成中起主導作用〔17〕。據報道,PGE2可通過EP2和EP4受體誘導COX-2表達,進而導致CC細胞遷移〔10〕。本研究結果提示,PGE2可能通過調控EP2和EP4的表達進而上調COX-2的表達,影響CC細胞生物學行為,說明靶向PGE2/COX-2軸是CC的一種有價值的治療方法。此外,有研究證明,EP4受體可作為CC新的有前景的治療靶點〔18〕,再次證實了PGE2/COX-2信號通路在CC治療中發揮的重要作用。

綜上,扶正祛瘀解毒方可能通過抑制PGE2/COX-2信號通路進而抑制CC細胞增殖、遷移和侵襲,誘導細胞凋亡,為CC的治療提供了體外實驗證據,并為進一步了解扶正祛瘀解毒方在CC中的作用機制奠定了基礎。接下來,將通過建立CC動物模型進行體內實驗,進一步研究扶正祛瘀解毒方抑制CC惡性生物學行為的分子作用機制。