基于ROCK/NOX4信號通路探究刺芒柄花素對2型糖尿病大鼠內質網應激損傷及腎功能的影響

劉芳薇 魯麗 唐陽

(遼寧省人民醫院內分泌科,遼寧 沈陽 110016)

2型糖尿病是由多種病因導致的體內胰島素分泌不足或人體不能有效利用胰島素,從而出現血糖水平持續升高的疾病,患者體內環境中,大血管、微血管、神經等都會發生病變,進而危害心臟、腎臟、眼睛等器官〔1〕,常伴有糖尿病腎病、糖尿病血管病變的等并發癥〔2〕。機體內,高糖環境下會提高RAS同源基因家族成員相關激酶(ROCK)表達,且其下游通路將會被激活,造成炎癥反應、蛋白異常合成等,上述反應均與糖尿病的產生與發展聯系密切〔3〕。內質網(ER)是參與細胞凋亡內在途徑的細胞器,其應激介導的細胞凋亡是糖尿病心肌病發生發展的重要機制之一〔4〕。刺芒柄花素是紅車軸草的主要成分,屬異黃酮類,是具有雌激素活性的多酚非甾體植物化學物質,它普遍存在于各種植物中,例如黃芪、雞血藤等,同時其還具有抗腫瘤、抗氧化、抗炎等作用。研究表明〔5〕,刺芒柄花素對糖尿病有治療作用,如刺芒柄花素可通過抑制胰島β細胞凋亡在四氧嘧啶誘導的1型糖尿病小鼠中表現出降血糖作用,通過增加沉默信息調控因子2樣蛋白相關酶基因表達改善糖尿病腎病纖維化。但其對2型糖尿病的內質網應激及腎損傷等相關文獻較少,具體機制尚不明確,因此本研究基于ROCK信號通路探究刺芒柄花素對2型糖尿病大鼠內質網應激損傷及腎功能的影響。

1 材料和方法

1.1實驗動物 SD健康大鼠60只,購自湖南斯萊克景達實驗動物公司,鼠齡8 w,體質量200～300 g,動物許可證號:SCXK(湘)2019-0142,合格證號:1100111905081682。大鼠常規飼養1 w,自由飲食飲水后進行實驗。本實驗經倫理委員會批準(批號:Y2018-009-17)。

1.2實驗試劑與儀器 刺芒柄花素(山西開普勒生物公司);真核翻譯起始因子2D(eIF2d)、葡萄糖調節蛋白(GRP)78一抗(武漢菲恩生物公司);辣根過氧化物酶標記羊抗兔免疫球蛋白(Ig)G二抗(南京博研生物公司);高脂飼料(常州信立泰生物公司);TUNEL工作液(上海赫果生物公司);自動生化分析儀(深圳市美思康電子公司,型號:iChem-520);蘇木素-伊紅(HE)染色液(江蘇伊勢久生物公司);醋酸苯胺藍溶液(桂林天倪生物公司);RAS同源基因家族成員(Rho)A、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶(NOX)4、ROCK一抗(上海齊一生物公司)。

1.3模型建立、分組與給藥 取12只大鼠作為健康對照進行普通飼料飼養(健康組)。剩余48只大鼠建模。高脂飼料喂養8 w(蛋黃3.0%、基礎飼料59.8%、蔗糖20.0%、豬油16.0%)。參考文獻〔6〕建立模型。大鼠于腹腔注射鏈脲佐菌素40 mg/kg,連續注射2 w后,鼠尾取血測定隨機血糖,以血糖≥16.7 mmol/L為建模成功。建模大鼠分為模型組12只;刺芒柄花素低、中、高組各12只,分別給予20、40、100 mg/kg刺芒柄花素灌胃,1次/d,共6 w。

1.4大鼠腎功能測定 干預后,取各組大鼠尾部靜脈血2 ml,離心10 min,1 250 r/min,分離血清,采用自動生化分析儀測定24 h尿微量白蛋白(24 h MAU)、血肌酐(SCr)、血清尿素氮(BUN)。

1.5HE染色與Masson染色觀察大鼠腎組織病形態 HE染色:取各組大鼠,麻醉后開腹取腎組織,生理鹽水沖洗,將左側腎臟組織修飾為5 mm×5 mm×5 mm的組織塊,放入4%甲醛中固定,石蠟切片,厚度 4 μm,脫蠟后,進行HE染色,光鏡觀察腎組織形態學改變。Masson染色:干預4 w取大鼠腎臟經石蠟包埋、切片脫蠟至水,蘇木素染色5 min后,置于 95%乙醇中洗 2次,在苦味酸乙醇溶液中分色1 min。清洗10 min,磷鉬酸染色5 min、醋酸苯胺藍溶液染色10 min。乙醇脫水、透明、風干、封片。每張切片中隨機選擇30個視野。染色分為4個等級評分。0分:無染色;1分:染色面積>0%且≤50%;2分:染色面積51%～75%;3分:染色面積76%～100%。

1.6TUNEL檢測腎小管上皮細胞凋亡 取各組大鼠腎組織切片與蛋白酶K室溫孵育,切片浸入TUNEL反應液中,磷酸鹽緩沖液(PBS)洗3次,0.05%二氨基聯苯胺(DAB)顯色4 min,蒸餾水洗4次,蘇木素復染10 min,蒸餾水清洗、脫水、透明、封片,于熒光顯微鏡下觀察。

1.7免疫組化檢測RhoA、NOX4、ROCK水平 取各組大鼠腎組織切片經脫蠟、水化、水洗后,羊血清封閉30 min。抗體與TBST(RhoA、NOX4、ROCK)按照1∶200比例稀釋,滴于切片上以PBS作為陰性對照,置于濕盒中4 ℃過夜。室溫放置1 h后清洗,滴加1∶500比例的二抗稀釋液,37 ℃孵育30 min,樹膠封片。結果可見細胞核呈藍色,陽性反應區域為棕黃色。顯微鏡下觀察,對每張切片中陽性染色區域進行評估,并作 4個等級評分。0分:無陽性染色或陽性染色面積<25%;1分:陽性染色面積 25%～50%;2分:陽性染色面積 51%～75%;3分:陽性染色面積76%～100%。

1.8Western印跡檢測eIF2d、GRP78 取大鼠腎組織PBS清洗后切碎,裂解液裂解,4 ℃離心5 min,取上清液,用5×上樣緩沖液混合于PBS稀釋蛋白樣品中(4∶1),沸水煮沸5 min,二喹啉甲酸(BCA)測蛋白濃度,十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)。轉移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上,脫脂奶粉封閉1 h。加入eIF2d、GRP78一抗(1∶500)后,清洗3次,10 min/次;加入辣根根過氧化物酶二抗(1∶2 500),37 ℃孵育45 min,TTBS漂洗10 min×3次,DAB試劑盒,在1 ml水中加A、B、C液各一滴,再加于膜上,電化學發光試劑后凝膠成像系統(JY-Clear)分析目標條帶的光密度值。

1.9統計學分析 采用SPSS21.0軟件進行單因素方差分析、t檢驗。

2 結 果

2.1腎功能 健康組血清24 h MAU、SCr、BUN水平顯著低于其他組(P<0.05)。模型組血清24 h MAU、SCr、BUN顯著高于刺芒柄花素低、中、高組(P<0.05)。刺芒柄花素低組血清24 h MAU、SCr、BUN水平顯著高于刺芒柄花素中、高組(P<0.05)。刺芒柄花素中組血清24 h MAU、SCr、BUN水平顯著高于刺芒柄花素高組(P<0.05)。見表1。

表1 各組腎功能指標及RhoA、NOX4、ROCK陽性表達比較

2.2免疫組化檢測結果 RhoA表達于腎小管;ROCK表達于腎小管、腎小球;Nox4均有表達。健康組腎組織中RhoA、NOX4、ROCK陽性表達顯著低于其他組(P<0.05)。模型組腎組織中RhoA、NOX4、ROCK表達顯著高于刺芒柄花素低、中、高組(P<0.05)。刺芒柄花素低組腎組織中RhoA、NOX4、ROCK顯著高于刺芒柄花素中、高組(P<0.05)。刺芒柄花素中組腎組織中RhoA、NOX4、ROCK顯著高于刺芒柄花素高組(P<0.05)。見表1、圖1。

2.3染色結果 HE染色:健康組腎臟組織結構正常;模型組腎小球有一定程度萎縮,組織結構排列不均勻,并且有腫脹、脫落現象、還存在空泡樣變性、鮑曼囊腔擴,而經過刺芒柄花素干預后,上述情況有所改善,且呈現出明顯的劑量依賴性。Masson染色:健康組腎組織正常;模型組腎小球、腎小管基底膜增厚,產生空泡樣病變,腎間質膠原纖維沉積明顯;在經過刺芒柄花素干預后上述狀況明顯改善,且呈現出明顯的劑量依賴性。見圖2。

圖1 各組腎組織RhoA、NOX4、ROCK表達(免疫組化染色,×400)

圖2 各組腎組織

2.4TUNEL檢測結果 健康組腎小管上皮細胞凋亡率〔(5.24±0.48)%〕低于模型組〔(45.31±5.27)%〕,有顯著差異(t=26.230,P<0.001)。模型組腎小管上皮細胞凋亡率高于刺芒柄花素低組〔(36.47±4.11)%〕,有顯著差異(t=4.582,P<0.001)。刺芒柄花素低組腎小管上皮細胞凋亡率高于刺芒柄花素中組〔(25.47±3.54)%〕,有顯著差異(t=7.025,P<0.001)。刺芒柄花素中組凋亡率高于刺芒柄花素高組〔(13.26±1.38)%〕,有顯著差異(t=11.130,P<0.001)。見圖3。

圖3 各組腎小管上皮細胞(TUNEL染色,×200)

2.5內質網應激相關指標檢測結果 健康組腎組織中eIF2α、GRP78水平顯著低于其他組(P<0.05)。模型組腎組織中eIF2α、GRP78顯著高于刺芒柄花素低、中、高組(P<0.05)。刺芒柄花素低組腎組織中RhoA、NOX4、ROCK顯著高于刺芒柄花素中、高組(P<0.05)。刺芒柄花素中組腎組織中eIF2α、GRP78顯著高于刺芒柄花素高組(P<0.05)。見表2、圖4。

表2 各組腎組織中eIF2α、GRP78蛋白表達

1～5:健康組、模型組、刺芒柄花素低組、刺芒柄花素中組、刺芒柄花素高組圖4 Western印跡檢測各組eIF2α、GRP78蛋白

3 討 論

2型糖尿病氧化應激的分子作用機制比較復雜,目前尚未完全闡明,近年來,RhoA/ROCK/NOX4信號通路對2型糖尿病的影響作用受到廣泛關注和高度重視。Rho/ROCK/NOX4信號通路是蛋白激酶C的下游靶點,高糖可導致蛋白激酶C激活,進而激活 Rho/ROCK/NOX4 信號通路。

研究提示〔7,8〕,高糖會激活 Rho/ROCK 通路使其處于異常活化狀態。RhoA 屬Rho-GTP酶家族成員之一,又被稱為 “分子調控樞紐”,發揮多生物活性調控作用。ROCK為絲氨酸/蘇氨酸激酶,是 RhoA下游第一個信號蛋白酶,ROCK參與了糖尿病腎病進程總腎間質纖維化過程,是促使糖尿病腎病發展的重要原因。在糖尿病大鼠腎臟中和高糖誘導的腎小球系膜細胞中,RhoA 在細胞膜上的表達顯著增加,同時,氧化應激反應、高血糖等均可激活 RhoA/ROCK/NOX4信號通路 。NOX4為 NADPH氧化酶主要亞基,其廣泛表達于大鼠及小鼠2型糖尿病模型、腎組織的腎小球系膜細胞、足細胞、腎小管細胞中。研究發現〔9〕,RhoA/ROCK信號通路的激活可通過介導 NOX4,引發腎組織多種細胞釋放大量活性氧,進而誘導多種纖維化蛋白的表達。另有研究表明〔10〕,腎小管上皮細胞間凋亡參與了糖尿病腎病的發病始末,是引起腎纖維化、導致腎臟功能喪失的重要因素,而 Rho/ROCK/NOX4信號通路亦是參與腎小管上皮細胞間充質轉化過程的主要信號轉導通路之一。體外細胞培養實驗及動物模型也均顯示Rho/ROCK/NOX4 信號通路參與了糖尿病腎病的致病過程〔11〕。姚藍等〔12〕在對糖尿病大鼠的研究中提出,通過抑制RhoA/ROCK/NOX4信號通路的激活,進而抑制腎臟纖維物質沉積,減輕腎臟損傷。侯偉等〔13〕研究提出,刺芒柄花素可改善2型糖尿病骨病大鼠病情嚴重程度。Li等〔14〕研究表明刺芒柄花素通過調控ROCK信號通路的活性,進而調控細胞的生物學行為。本文研究與上述研究結果相似,推測刺芒柄花素可能是通過調控Rho/ROCK/NOX4信號通路改善2型糖尿病大鼠腎損傷。

2型糖尿病發病是一個漫長和復雜的過程,其主要歸因于細胞代謝異常和血多細胞器的缺陷,如線粒體、內質網和肌纖維膜。內質網應激會導致細胞發生凋亡影響細胞功能。GRP78、eIF2α是內質網應激的標志〔15〕。發生內質網應激時,GRP78解離后發生自身磷酸化,并使eIF2α磷酸化,阻止新蛋白質合成。刺芒柄花素具有抗氧化應激與調控細胞凋亡的作用〔16〕。

本實驗病理結果提示,內質網功能紊亂對腎小管上皮細胞功能造成影響,從而導致腎臟發生病理損傷;刺芒柄花素可通過降低eIF2α、GRP78水平起到保護腎組織內質網應激的作用。余臣祖等〔17〕研究提出,通過降低eIF2α、GRP78,可減輕2型糖尿病大鼠內質網應激損傷。薛萬騰等〔18〕在研究ROCK信號通路與心肌梗死關系的實驗中提出,通過調控RhoA/ROCK信號通路可調控細胞生物學行為,抑制炎癥反應與內質網應激。程圣杰等〔19〕研究表明,刺芒柄花素可抑制糖尿病小鼠心肌細胞凋亡。本文與上述研究結果相似,因此推測,刺芒柄花素可能是通過調控ROCK信號通路,抑制內質網應激,減少腎小管上皮細胞凋亡。

當腎小球發生病變時,BUN水平迅速升高。糖尿病大鼠清除氧化自由基的能力下降,導致過氧化脂水平升高,腎臟過氧化脂水平與BUN水平正相關,隨腎臟損傷程度變化。SCr、BUN及24 h MAU均是評價糖尿病腎病的重要指標,機體生理條件下,代謝終產物以BUN、SCr等形式通過腎小球濾過作用排出體外,但腎組織損傷導致功能異常狀態下,腎小球濾過作用減弱,導致代謝終產物排出減少,血中SCr、BUN水平升高,而尿蛋白含量升高。研究發現〔20〕,刺芒柄花素能夠改善間質纖維化大鼠腎功能,降低腎小管間質損傷,阻礙腎間質纖維化的發展。在本研究中發現,模型組大鼠SCr、BUN及24 h MAU水平降低,在經過刺芒柄花素干預后,水平升高,且呈現出明顯的劑量依賴性。楊飛飛〔21〕在對小鼠腎缺血再灌注損傷的實驗中提出,刺芒柄花素可通過降低BUN、SCr水平及腎小管上皮細胞凋亡,起到腎保護的作用。

綜上所述,刺芒柄花素可能是通過調控Rho/ROCK/NOX4 信號通路抑制了2型糖尿病大鼠內質網應激,改善腎功能,對腎臟起保護作用。