基于JAK2信號(hào)通路探究散瘀止痛續(xù)骨方對(duì)肱骨骨折大鼠骨微結(jié)構(gòu)的保護(hù)機(jī)制

張永占 張寧 尚紅濤 劉子豪 田永利

(1秦皇島市第一醫(yī)院,河北 秦皇島 066600;2衡水市人民醫(yī)院)

在臨床骨科治療的過(guò)程中,肱骨骨折是常見(jiàn)的病癥之一,肱骨骨折時(shí)可伴隨出現(xiàn)骨強(qiáng)度下降、骨微結(jié)構(gòu)遭到破壞進(jìn)而使骨脆性增加。在相關(guān)疾病治療中骨微結(jié)構(gòu)作為反應(yīng)骨材料、骨構(gòu)筑及骨強(qiáng)度等方面的依據(jù),對(duì)判斷治療中的骨愈合程度具有重要意義〔1〕。肱骨骨折的恢復(fù)是一個(gè)漫長(zhǎng)復(fù)雜的生理過(guò)程,創(chuàng)傷后患者機(jī)體內(nèi)諸多分子水平及微環(huán)境會(huì)發(fā)生一定改變,進(jìn)而影響骨愈合進(jìn)程〔2〕。中藥在治療疾病方面具有悠久的歷史,其獨(dú)特的治療方式更是具有準(zhǔn)確高效、經(jīng)濟(jì)便捷、辨證施治、分期治療等特點(diǎn)〔3〕。以往研究經(jīng)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),中醫(yī)補(bǔ)腎法、補(bǔ)腎單味藥或其有效成分中均具有誘導(dǎo)骨增殖和成骨分化的作用,可有效促進(jìn)骨損傷的治療進(jìn)程〔4〕。散瘀止痛續(xù)骨方具有補(bǔ)血活血、消腫止痛、祛瘀生新、續(xù)筋接骨之功效〔5〕。酪氨酸激酶(JAK)2信號(hào)通路作為一種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑不僅能夠參與機(jī)體應(yīng)激與炎癥反應(yīng),還可發(fā)揮信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和基因轉(zhuǎn)錄活化子蛋白的雙重作用〔6〕。而骨折所引起的眾多免疫抑制細(xì)胞因子對(duì)JAK2的表達(dá)具有一定影響,JAK2可介導(dǎo)多種病理過(guò)程中的炎癥反應(yīng)及免疫調(diào)節(jié),是機(jī)體中重要的調(diào)節(jié)機(jī)制,與骨折組織創(chuàng)傷后所引起的炎癥反應(yīng)關(guān)系十分密切,可促使骨折后炎癥反應(yīng)增加骨損傷作用〔7〕。本研究基于JAK2信號(hào)通路探求散瘀止痛續(xù)骨方對(duì)肱骨骨折大鼠骨微結(jié)構(gòu)保護(hù)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)大鼠 選取健康級(jí)SD大鼠雌雄各半,體質(zhì)量250～300 g,由基爾頓生物科技(上海)提供,嚴(yán)格按照《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》規(guī)定進(jìn)行實(shí)驗(yàn),動(dòng)物許可證號(hào):SYXK(上):2019-0075,室溫控制在15～25 ℃,分籠飼養(yǎng),每日12 h光照,濕度40%～70%,飲食及飲水為自由攝取。

1.2試劑與儀器 戊巴比妥鈉(萊比信生物技術(shù)公司)、多聚甲醛(陜西健民制藥有限公司)、蘇木素-伊紅(HE)染色試劑(武漢博士德公司)、多克隆抗體(德國(guó)Braun公司)、杜仲提取物(江西普正制藥有限公司)、鼠架(重慶光學(xué)儀器廠)、手術(shù)顯微鏡(德國(guó)麥迪塞姆儀器公司)、常規(guī)手術(shù)器械(寧波成和顯微器械廠)、切片機(jī)(德國(guó)LEICA公司)、光學(xué)顯微鏡(日本OLYMPUS光學(xué)工業(yè)株式會(huì)社)、酶標(biāo)儀(美國(guó)AstraZen-eca公司)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒(Blue Gene公司)。

1.3散瘀止痛續(xù)骨方的組成以及制作 根據(jù)《醫(yī)療機(jī)構(gòu)中藥煎藥室管理規(guī)范》要求,采用組方:赤芍15 g,骨碎補(bǔ)、續(xù)斷12 g,地鱉蟲(chóng)、川芎、延胡索、澤瀉各10 g,乳香、沒(méi)藥、桂枝、木香、車(chē)前子各8 g,枳殼、羌活、防風(fēng)各6 g,于環(huán)境溫度18～25 ℃、相對(duì)濕度≤80%,用符合衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)的無(wú)異味、潔凈澄清的冷水浸泡30 min后用武火煮沸,文火保持微沸狀態(tài)15 min使有效成分充分溶出,且每副中藥煎煮2次,最終藥液220 ml,含生藥100 g,將煎藥裝入消毒后的容器內(nèi),并符合國(guó)家藥品包裝材料標(biāo)準(zhǔn),室溫冷卻后-20 ℃儲(chǔ)存。將散瘀止痛續(xù)骨方水煎液置于室溫下熔融,并充分震蕩搖勻。

1.4分組與給藥 將40只健康大鼠,平均分為正常組、模型組、散瘀止痛續(xù)骨方組、杜仲提取物組各10只,除正常組10只大鼠外,將其余大鼠用1%戊巴比妥鈉(40 mg/kg)腹腔注射麻醉后,將四肢用粗針頭將其仰臥位固定于鼠架上,左上肢前內(nèi)側(cè)及左胸部進(jìn)行脫毛處理,碘伏消毒后行切口,剪斷胸大肌、胸小肌,暴露并分離腋動(dòng)脈及大鼠肱骨干中上段,暴露肱骨內(nèi)外髁,以粗針頭行肱骨髁間髓腔開(kāi)槽,用直徑1 mm的5號(hào)注射器針頭自開(kāi)槽處逆行鉆入肱骨髓腔近端,用骨折鉗折斷肱骨上1/3處,造成橫行骨折,自腋動(dòng)脈起始處切斷并結(jié)扎主干,逐層閉合傷口后碘伏消毒處理。術(shù)后為預(yù)防感染5 d內(nèi)肌肉注射青霉素(50 mg/kg),隔日采用碘伏進(jìn)行傷口消毒,造模后分籠飼養(yǎng)。術(shù)后將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物置于籠內(nèi),動(dòng)物飼養(yǎng)選用標(biāo)準(zhǔn)飼料統(tǒng)一喂養(yǎng)。對(duì)照組及模型組采用相同體積生理鹽水每日灌胃1次,散瘀止痛續(xù)骨方組采用散瘀止痛續(xù)骨方制劑3 g/kg,杜仲提取物組采用生藥5 g/kg進(jìn)行灌胃處理,所有大鼠每次灌胃1次,連續(xù)30 d。

1.5檢測(cè)方法

1.5.1ELISA檢測(cè)血清中骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)7、神經(jīng)肽(NP)Y 戊巴比妥鈉麻醉后,經(jīng)腹主動(dòng)脈取血5 ml,5 000 r/min離心15 min后分離血清,于-20 ℃保存待用,采用雙抗夾心酶聯(lián)免疫吸附試劑盒測(cè)定BMP7和NPY水平,取血清標(biāo)本200 μl,測(cè)定前室溫復(fù)溶后離心取上清液測(cè)定,用酶標(biāo)儀在350 nm測(cè)定OD值,根據(jù)樣品的吸光值在坐標(biāo)上找出對(duì)應(yīng)的濃度并以ng/L表示。

1.5.2HE染色 處死大鼠后,剔除肱骨組織表面的組織,固定于4%多聚甲醛溶液。24 h后采用pH7.5的乙二胺四乙酸溶液脫鈣,每日3次更換,3 w后可將大頭針刺入骨組織表示脫鈣完全,酒精脫水,將石蠟切片置于60 ℃的保溫箱中1 h,為將蠟片烤干再經(jīng)無(wú)水乙醇、90%乙醇、80%乙醇和70%乙醇梯度脫水后用清水沖洗,在90 ℃烤箱中烘烤15 min后于蘇木素中染色15 min,清洗后,伊紅染色3 min,70 ℃烘箱烤干后用中性樹(shù)脂封片,骨組織切片于顯微鏡下觀察后拍照。

1.5.3骨微結(jié)構(gòu)檢測(cè) 將大鼠肱骨裹上一層棉花,5個(gè)為一組,兩兩之間用棉花隔開(kāi),垂直固定于樣品杯中,放入uCT掃描儀內(nèi)對(duì)椎骨進(jìn)行掃描,將掃描參數(shù)調(diào)整為80 kVp、125 μA、10 W,掃描分辨率為20 μm,每個(gè)樣本掃描30層,構(gòu)建三維重建圖像,進(jìn)行骨小梁微結(jié)構(gòu)的分析,具體指標(biāo)為骨小梁數(shù)量(Th.N)、骨小梁厚度(Tb.Th)、骨小梁分離度(Tb.Sp)、骨體積分?jǐn)?shù)(BV/TV)、骨密度(BMD)、連接密度(Conn.D)。

1.5.4Western印跡檢測(cè)JAK2、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子(STAT)3 采用RIPA裂解液裂解肱骨組織提取總蛋白二喹啉甲酸(BCA)法測(cè)定蛋白濃度,取30 μg蛋白樣品進(jìn)行十二烷基硫酸鈉(SDS)聚丙烯酰胺凝膠電泳,將電泳后的蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜封閉液封閉進(jìn)行5 ℃過(guò)夜,用JAK2兔多克隆抗體(1∶1 000)、STAT3(1∶200)和β-actin兔多克隆抗體(1∶2 000)孵育1 h后,進(jìn)行4-叔丁基苯乙烯(TBS)洗滌3次(15 min/次)后再分別用辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG(1∶3 000)室溫孵育1 h TBS洗滌3次(15 min/次)后將膜浸入ECL工作液,X線片曝光、顯影后檢測(cè)獲取圖像觀察結(jié)果。

1.5.5熒光定量PCR檢測(cè)JAK2、STAT3 mRNA表達(dá) 取肱骨組織研磨,胰蛋白酶消化,加入2 ml TRIzol試劑及200 μl氯仿提取總RNA,核酸定量?jī)x檢測(cè)提取RNA的濃度和純度,按照第一鏈合成系統(tǒng)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄制備cDNA,以10 s為內(nèi)參進(jìn)行熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增以檢測(cè)各組JAK2 mRNA、STAT3 mRNA的表達(dá)水平,50 ℃預(yù)處理2 min,循環(huán)1次,85 ℃預(yù)變性15 min,循環(huán)1次,90 ℃變性5 s,60 ℃退火15 s,70 ℃延伸20 s,循環(huán)30次,PCR產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳,紫外燈下觀察照相,將照片通過(guò)凝膠圖像分析系統(tǒng)分析PCR產(chǎn)物量以光密度×面積表示,根據(jù)2-△△Ct值計(jì)算相對(duì)表達(dá)。引物序列:JAK2 上游引物5′-TTCTGTGGCCTCAGATGTGTG-3′,下游5′-TGAAAGAGGGACGTTGGTTGA-3′;STAT3上游引物5′-CCTTCCTGCGGTTCAGT-3′,下游5′-GCTGCAGGTCGTTGGTGTCAC-3′;U6上游引物5′-TATCGGACGCCTGGTTAC-3′,下游5′-CTGTGCCGTTGAACTTGC-3′。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用GraphPad Prism8.0軟件進(jìn)行方差分析。

2 結(jié) 果

2.1各組血清中BMP7、NPY表達(dá) 與正常組比較,模型組血清中BMP7、NPY表達(dá)明顯降低(P<0.05),與模型組比較,散瘀止痛續(xù)骨方組BMP7、NPY表達(dá)明顯升高(P<0.05),與散瘀止痛續(xù)骨方組比較,杜仲提取物組BMP7、NPY表達(dá)明顯降低(P<0.05)。見(jiàn)表1。

2.2各組JAK2、STAT3 mRNA及蛋白表達(dá) 與正常組比較,模型組肱骨組織中JAK2、STAT3 mRNA及蛋白表達(dá)明顯升高(P<0.05),與模型組比較,散瘀止痛續(xù)骨方組大鼠肱骨組織中JAK2、STAT3 mRNA及蛋白表達(dá)明顯降低(P<0.05),與散瘀止痛續(xù)骨方組比較,杜仲提取物組JAK2、STAT3 mRNA及蛋白表達(dá)明顯升高(P<0.05)。見(jiàn)表1、圖1。

表1 各組血清中BMP7、NPY、JAK2、STAT3 mRNA及蛋白表達(dá)

1～4:正常組、模型組、散瘀止痛續(xù)骨方組、杜仲提取物組圖1 各組JAK2、STAT3蛋白表達(dá)

2.3各組肱骨骨微結(jié)構(gòu)表達(dá) 與正常組比較,模型組Th.N、Tb.Th、BV/TV、BMD、Conn.D表達(dá)明顯降低,Tb.Sp表達(dá)明顯升高(P<0.05),與模型組比較,散瘀止痛續(xù)骨方組Th.N、Tb.Th、BV、TV、BMD、conn.D表達(dá)明顯升高,Tb.Sp表達(dá)明顯降低(P<0.05),與散瘀止痛續(xù)骨方組比較,杜仲提取物組Th.N、Th.Th、BV/TV、BMD、Conn.D表達(dá)明顯降低,Tb、Sp表達(dá)明顯升高(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 各組肱骨骨微結(jié)構(gòu)表達(dá)

2.4各組肱骨組織 正常組肱骨骨結(jié)構(gòu)基本正常,骨皮質(zhì)未見(jiàn)變薄,骨髓腔大小正常,無(wú)受損狀況產(chǎn)生,細(xì)胞間排列整齊且均勻分布,未見(jiàn)破骨細(xì)胞產(chǎn)生;模型組肱骨骨皮質(zhì)變薄且細(xì)胞間、排列稀疏,骨髓腔擴(kuò)大、斷裂明顯,骨髓脂肪組織增生明顯,可見(jiàn)大量破骨細(xì)胞;散瘀止痛續(xù)骨方組骨結(jié)構(gòu)趨于穩(wěn)定,骨基質(zhì)中少量量骨細(xì)胞沉積,組織密度增大,組織細(xì)胞排列趨于有序,有新生組織生成;杜仲提取物組骨組織中仍有受損現(xiàn)象,伴隨破骨細(xì)胞分布,骨髓脂肪組織間仍有破骨少量細(xì)胞。見(jiàn)圖2。

圖2 各組肱骨組織(HE染色,×200)

3 討 論

骨折是臨床骨科治療中最為常見(jiàn)病癥之一,其中肱骨骨折約占成人骨折的5%,而骨折愈合是一個(gè)復(fù)雜的修復(fù)和再生過(guò)程,有多種細(xì)胞因子的參與〔8〕。在骨折后相關(guān)骨生長(zhǎng)因子在骨折修復(fù)的過(guò)程中對(duì)骨微結(jié)構(gòu)及軟骨的形成具有一定潛在作用,而如何有效改善骨生長(zhǎng)因子及減少骨折后的骨微結(jié)構(gòu)不良是現(xiàn)階段骨折治療中需要解決的關(guān)鍵問(wèn)題〔9〕。中醫(yī)研究認(rèn)為,骨折初期最顯著特征是瘀血留滯導(dǎo)致的新血不生、骨不能接,由此可引起骨愈合困難及骨結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定性增加等狀況產(chǎn)生。因此,在骨折治療中應(yīng)輔助壯骨活血藥物以促進(jìn)骨愈合和改善骨微結(jié)構(gòu)破壞等現(xiàn)象〔10〕。

在各種影響因子中,BMP與NPY在疾病過(guò)程中參與新生組織形成和影響治療時(shí)間方面具有干預(yù)作用,并已成為現(xiàn)階段臨床治療與實(shí)驗(yàn)研究的重要指標(biāo)。本研究表示,散瘀止痛續(xù)骨方對(duì)增加血清BMP7、NPY水平具有一定作用。現(xiàn)階段對(duì)于中醫(yī)藥應(yīng)用于疾病中的治療越來(lái)越廣泛,在治療骨科相關(guān)疾病的研究也受到了越來(lái)越多的關(guān)注。中醫(yī)藥中的散瘀止痛續(xù)骨方中均為舒筋活血祛瘀之良藥,其成分中含有乳香、沒(méi)藥、地鱉蟲(chóng)、赤芍、川芎、桂枝、延胡索、木香、枳殼、羌活、防風(fēng)、骨碎補(bǔ)、續(xù)斷、澤瀉、車(chē)前子等多種有效成分,具有活血行氣、祛瘀通經(jīng)、續(xù)筋鎮(zhèn)痛之功效〔11〕相關(guān)研究表示,BMP7可能通過(guò)干預(yù)間充質(zhì)干細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子Runx2和Osterix的表達(dá),誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化,并協(xié)同其他調(diào)節(jié)因子參與骨組織的形成〔12,13〕。而NPY作為骨穩(wěn)態(tài)調(diào)控相關(guān)因子,可通過(guò)抑制成骨細(xì)胞中cAMP的合成而影響成骨細(xì)胞的活動(dòng),在參與骨合成代謝、防止骨流失、調(diào)節(jié)骨平衡、控制骨重塑等方面具有重要作用〔14〕。Park等〔15〕研究表示,散瘀止痛續(xù)骨方中木香、防風(fēng)、骨碎補(bǔ)等成分中含有豐富的膠原、鈣鹽及微量元素等,治療中可能通過(guò)提高種植體骨結(jié)合界面的相關(guān)蛋白濃度,使其加快誘導(dǎo)成骨活性和修復(fù)膠原骨缺損,并通過(guò)參與蛋白合成酶代謝,和抑制蛋白質(zhì)多糖合成及鈣磷的沉積使骨處于穩(wěn)定狀態(tài),進(jìn)而發(fā)揮促進(jìn)骨愈合的功效。

骨微結(jié)構(gòu)是目前診斷和預(yù)測(cè)相關(guān)骨科疾病的重要手段,也是監(jiān)測(cè)其自然病程或藥物治療效果的可靠指標(biāo)之一。本研究表示,散瘀止痛續(xù)骨方對(duì)改善骨折大鼠的骨微結(jié)構(gòu)具有保護(hù)作用。相關(guān)研究表示,骨的微結(jié)構(gòu)與其疾病導(dǎo)致的生物力學(xué)性能存在一定的線性關(guān)系,不僅對(duì)骨強(qiáng)度具有一定關(guān)聯(lián),還對(duì)調(diào)節(jié)骨損傷中的骨代謝平衡、骨轉(zhuǎn)換率及骨愈合具有改善〔16〕。中藥治療骨折可能通過(guò)提高外骨痂、連接骨痂、橋梁骨痂、礦化骨痂等的體積密度,從而增加骨骼強(qiáng)度,使骨癡拉伸強(qiáng)度、抗折力、彎曲強(qiáng)度、載荷量等力學(xué)特性增強(qiáng)。散瘀止痛續(xù)骨方成分中的牛膝、續(xù)斷、川芎等兼具強(qiáng)筋健骨、補(bǔ)血通絡(luò)之功效,地鱉蟲(chóng)則具有接骨續(xù)筋、活血祛瘀、止痛等功效〔17〕。Hinton等〔18〕用含有牛膝、續(xù)斷、川芎、地鱉蟲(chóng)等中藥成分的藥物在進(jìn)行體外培養(yǎng)成骨細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究中發(fā)現(xiàn),不僅能促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖還對(duì)促進(jìn)成骨細(xì)胞中的DNA合成,和改善骨微結(jié)構(gòu)來(lái)實(shí)現(xiàn)加快骨折愈合的作用。該研究與本文結(jié)果相類(lèi)似。

JAK-STAT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路可在細(xì)胞因子與相應(yīng)的膜受體聯(lián)合調(diào)控多種細(xì)胞因子,并受體家族的生物學(xué)應(yīng)答功能中發(fā)揮重要作用,而骨損傷所引起的眾多免疫抑制細(xì)胞因子會(huì)促進(jìn)相關(guān)蛋白的表達(dá)〔19〕。本研究表示,散瘀止痛續(xù)骨方對(duì)抑制JAK2、STAT3表達(dá)具有一定相關(guān)性。相關(guān)研究表示,骨折發(fā)生使JAK等相關(guān)因子被激活,將蛋白家族中的JAK2、STAT3二聚體化,使蛋白間產(chǎn)生聚集、磷酸化,并通過(guò)轉(zhuǎn)錄因子形成二聚體后,使轉(zhuǎn)錄因子與受體分離并向細(xì)胞核內(nèi)進(jìn)行轉(zhuǎn)移,進(jìn)而參與骨微結(jié)構(gòu)的變化表達(dá)〔20〕。Fan等〔21〕研究表示,中藥川芎成分具有活血行氣、補(bǔ)血等效能,牛膝則兼具強(qiáng)筋骨、通經(jīng)絡(luò)之功效,且相關(guān)中藥成分可能通過(guò)磷酸化的JAK2激活STAT3,而活化的STAT3進(jìn)入核內(nèi)與DNA相關(guān)應(yīng)答元件結(jié)合參與蛋白的合成過(guò)程,進(jìn)而降低相關(guān)蛋白表達(dá),在機(jī)體內(nèi)對(duì)抑制相關(guān)蛋白及改善骨微結(jié)構(gòu)發(fā)揮積極的保護(hù)作用。