M2型巨噬細胞來源外泌體對食管癌細胞生長行為及人臍靜脈血管內皮細胞血管生成的影響

王玉萍 劉約瑟 張玉珂 李登科 王玲玲

(河南省中醫院(河南中醫藥大學第二附屬醫院)腫瘤內科,河南 鄭州 450000)

食管癌是消化道內常見的惡性腫瘤之一,作為全球第八大癌癥嚴重威脅著人類健康。食管癌患者早期可能出現乏力、惡心、體質量減輕等非特異性癥狀,因此難以診斷,大多數患者在確診時已處于腫瘤晚期,易轉移性和高侵襲性是導致該疾病致死率高的兩大因素。目前食管癌患者總體的5年生存率約為20%〔1,2〕。目前臨床上食管癌的治療從一定程度上提高了患者的總生存率,然而,由于一半以上的患者在臨床確診時已發生遠處轉移,此外,復發和放化學抗性也直接影響患者的預后〔3,4〕。目前,對食管癌的發病機制和進展機制缺乏明確的認識,這是開發食管癌有效診斷和治療方案的主要障礙。

巨噬細胞通常分為M1型巨噬細胞和M2型巨噬細胞。M1型巨噬細胞的活化受到干擾素(IFN)-γ等因素的刺激,極化的M1型巨噬細胞能夠觸發促炎反應和促進免疫刺激因子的產生,這些因子包括腫瘤壞死因子(TNF)-α、白細胞介素(IL)-6、誘導型一氧化氮合酶(iNOS)等,在腫瘤中發揮抵抗作用;M2型巨噬細胞能夠進一步細分為M2a、M2b、M2c和M2d亞型,其中,M2a、M2b和M2c亞型通過特異性高表達重組人精氨酸酶(Arg)1、轉化生長因子(TGF)-β等因子進而發揮抗炎和促腫瘤作用〔5,6〕。外泌體(Exo)是由多數細胞釋放的直徑在30～150 nm的脂質雙層膜囊泡,含有蛋白質、脂質和核酸等多種生物成分,在功能上能夠從親本細胞轉移到受體細胞。先前的研究表明,Exo是腫瘤微環境中不同類型細胞之間的關鍵通信介質〔7〕,然而,目前大多數研究都集中在腫瘤細胞來源的Exo上,關于M2型巨噬細胞Exo及其對腫瘤細胞影響的報道相對較少。鑒于此,本研究擬在體外誘導M2型巨噬細胞,并分離其Exo以探究M2型巨噬細胞來源的Exo途徑在食管癌細胞生長、轉移及血管生成中的作用。

1 材料與方法

1.1主要材料與試劑 人臍靜脈血管內皮細胞(HUVEC)和食管癌細胞株EC9706(中國科學院上海生命科學研究院細胞庫),胎牛血清、RPMI1640培養基及白細胞介素(IL)-4(美國Gibco公司),佛波酯(PMA,美國Sigma公司),Trizol試劑盒、反轉錄試劑盒和實時熒光定量(qRT)-PCR試劑盒(日本Takara公司),Exo提取試劑盒(上海貝博生物),親脂性熒光染料(PKH67)試劑盒(德國Millipore公司),CCK-8試劑盒和5-乙炔基-2′-脫氧尿苷(EdU)試劑盒(北京康為世紀生物),Transwell小室和基質膠(美國Corning公司),聚偏氟乙烯(PVDF)膜、電化學光(ECL)液和結晶紫(上海碧云天生物研究所),抗體CD9、CD63、Tsg101及GAPDH等(英國Abcam公司)。基因引物序列交由上海生工生物工程公司構建。

1.2M2型巨噬細胞的誘導 使用10%胎牛血清的RPMI1640培養基培養THP-1細胞。待細胞呈對數生長時,調整密度為1×105個/孔接種于6孔培養板,過夜孵育待其貼壁后,以10 ng/ml PMA刺激培養72 h,再以40 ng/ml IL-4刺激培養24 h,誘導向M2型巨噬細胞極化,該處理記為實驗組,并以正常培養的THP-1細胞作為對照組。

1.3實時熒光定量聚合酶鏈反應(qRT-PCR)檢測巨噬細胞相關基因表達 細胞誘導結束后,Trizol法提取細胞總RNA。根據反轉錄試劑盒說明書操作將RNA逆轉錄合成為cDNA,采用qRT-PCR實驗進行擴增,實驗操作具體按照熒光定量SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒說明書完成,以GAPDH作為內參基因,程序:95 ℃ 3 min;95 ℃ 30 s、60 ℃ 30 s、58 ℃ 30 s(重復40個循環),Primer premier 5.0軟件設計引物序列,各基因引物序列(5′-3′):TNF-α正向CCTCCCTCTCATCAGTTCTA,反向ACTTGGTGGTTTGCTACGAC;IL-6正向CCCCAATTTCCAATGCTC-TCC,反向TTGGTCCTTAGCCACTCCTTC;iNOS正向CAGAGGACCCAGAGACAAGC,反向TGCTGAAAC-ATTTCCTGTGC;Arg1正向AGTGTGGTGCTGGGTGGAGAC,反向GCTGGTTGTCAGGGGAGTGT;TGF-β正向TACCTGAACCCGTGTTGCTCTC,反向GTTGCTGAGGTATCGCCAGGAA;CD206正向CAGGTGTG-GGCTCAGGTAGT,反向TGTGGTGAGCTGAAAGGTGA;GAPDH正向TGAAGCAGGCATCTGAGGG,反向CGAAGGTGGAAGAGTGGGAG。實驗結果使用2-ΔΔCt法計算,比較兩組細胞中各基因mRNA上的表達差異。

1.4Exo的提取與鑒定 收集誘導的M2型巨噬細胞上清液,4 ℃低溫冷凍離心機中以4 633 r/min離心15 min,去除沉淀;繼續4 ℃,8 459 r/min離心30 min,棄沉淀并收集上清液。通過0.22 μm濾膜過濾后,加入Exo提取試劑液A,4 ℃靜置12 h,再4 ℃,8 459 r/min離心60 min,保留沉淀并加入保存液試劑B重懸沉淀。通過使用透射電鏡觀察顆粒物的形態、粒徑分析儀檢測粒徑分布及Western印跡法檢測CD9、CD63及Tsg101的蛋白表達情況來鑒定分離的Exo。

1.5Western印跡檢測Exo標志蛋白表達 在Exo中加入預冷的放射免疫沉淀分析(RIPA)裂解液進行裂解,考馬斯亮藍法進行蛋白定量。測定蛋白濃度后,取等量樣品,98 ℃水浴鍋中加熱15 min后離心。上樣后經過十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)分離蛋白,200 mA轉移至PVDF膜,5%脫脂奶粉室溫封閉1 h,加入稀釋好的一抗工作液,4 ℃搖床孵育過夜。次日TBST洗膜,加入相應稀釋后的二抗工作液,隨后加入化學發光液ECL顯色,凝膠成像系統拍照,以GAPDH作為內參蛋白。

1.6細胞免疫熒光染色檢測Exo傳遞 取分離的Exo懸液200 μl,加入等量稀釋液混合均勻,再取1.6 μl PKH67染液,添加200 μl稀釋液對染液進行稀釋,將稀釋后的Exo懸液與稀釋后的PKH67溶液混合,輕輕吹打混勻,避光染色5 min,加入0.1%牛血清白蛋白(BSA)溶液終止染色。4 ℃,9 266 r/min離心20 min,棄上清,重懸沉淀后,將其加入培養的EC9706細胞中(M2-Exo+EC9706組),兩者共孵育24 h。EC9706細胞為對照(EC9706)組。孵育結束后,加入4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染核10 min,封片、干燥,通過熒光顯微鏡觀察EC9706細胞對熒光標記的Exo的攝取情況。

1.7CCK-8法檢測細胞增殖活性 將對數生長期的EC9706細胞按1×105個/孔接種于96孔培養板中,置于37 ℃、5%CO2條件下過夜培養。次日,加入0.1 mg/ml Exo與細胞共培養(M2-Exo+EC9706組),未加Exo的為對照(EC9706組),于24、48、72 h時,加入10 μl CCK-8試劑液至待測細胞孔,繼續孵育4 h,通過全自動酶標儀測定450 nm處各孔細胞的光密度(OD)值。

1.8EdU實驗檢測細胞增殖水平 收集EC9706細胞或與Exo共培養48 h的EC9706細胞(M2-Exo+EC9706組),未加Exo的為對照(EC9706組),按1×105個/孔接種在24孔板,置于37 ℃、5% CO2條件下培養24 h,次日,加入10 μmol/L EdU試劑液,培養2 h后,滴加4%多聚甲醛,室溫下固定20 min,加入甘氨酸孵育5 min,0.5% Triton X-100穿膜處理10 min,利用Apollo567在避光條件下室溫染色30 min,結束后采用甲醇清洗細胞,再用DAPI染核,干燥、封片,通過激光共聚焦顯微鏡觀察染色情況。

1.9Transwell實驗檢測細胞遷移與侵襲 收集EC9706細胞或與Exo共培養48 h的EC9706細胞(M2-Exo+EC9706組),未加Exo的為對照(EC9706組),調整密度為2×104個/ml。在Transwell小室的上室加入稀釋后的基質膠進行包被,待膠凝固后,吸取200 μl細胞懸液加入上室,下室加入600 μl含10%胎牛血清的細胞培養液,置于37 ℃、5%CO2條件下過夜培養。次日,取出小室,加入4%多聚甲醛,室溫固定30 min,再用0.1%結晶紫染色10 min,通過光學顯微鏡拍攝圖像并記錄統計。細胞遷移檢測實驗不在Transwell小室的上室鋪基質膠,其余操作步驟均與上述一致。

1.10HUVEC的成管實驗 將稀釋后的基質膠均勻平鋪于24孔板孔底,置于37 ℃條件下待膠凝固。取對數生長期的HUVEC,0.25%胰蛋白酶消化,調整濃度為1×105個/ml,加入0.1 mg/ml Exo與HUVEC共培養24 h后,將處理后的HUVEC均勻接種于鋪好基質膠的24孔板上,置于37 ℃、5%CO2條件下培養48 h,通過倒置生物顯微鏡觀察HUVEC管腔形成情況并拍攝圖像,ImageJ軟件分析形成管的長度。

1.11統計學分析 采用GraphPad Prism 8.0軟件進行單因素方差分析、LSD-t檢驗。

2 結 果

2.1誘導后M2型巨噬細胞的鑒定結果 實驗組TNF-α、IL-6和iNOS mRNA表達水平較對照組顯著下調(P<0.001),M2型巨噬細胞相關基因Arg1、TGF-β和巨噬細胞CD206的mRNA表達水平均較對照組顯著上調(P<0.001),見表1。

2.2M2型巨噬細胞Exo的分離與鑒定結果 通過透射電鏡觀察到分離的顆粒物為典型的球狀小囊泡。納米顆粒跟蹤分析儀(NTA)測量發現該粒度直徑峰值大約分布在100 nm。Western印跡檢測到Exo標志蛋白CD9、CD63和TSG101均高水平表達,由此判斷分離的顆粒物為Exo,見圖1、表2。

表1 兩組巨噬細胞表型相關基因表達水平比較

圖1 Exo的鑒定

表2 M2型巨噬細胞與M2型巨噬細胞來源Exo中CD9、CD63和TSG101蛋白表達水平比較

2.3M2型巨噬細胞來源Exo傳遞到EC9706細胞檢測結果 將分離的M2型巨噬細胞來源Exo與EC9706細胞共培養,在熒光顯微鏡可見經過PKH67標記的Exo分布于EC9706細胞的細胞核周圍,可見有明顯綠色熒光標記的Exo表達,說明Exo可被EC9706細胞攝取,而未與Exo共培養的EC9706細胞周圍無綠色熒光表達,見圖2。

2.4M2型巨噬細胞來源Exo對EC9706細胞增殖的影響 EdU染色結果中EdU陽性紅色細胞為增殖細胞,M2-Exo+EC9706組細胞內EdU陽性細胞數較單純培養的EC9706組顯著增加(P<0.001)。CCK-8法檢測結果顯示,與EC9706細胞比較,經過與M2型巨噬細胞來源Exo共培養的EC9706細胞,在處理24、48及72 h后,細胞的增殖活性顯著升高(P<0.001),見圖3、表3。

圖2 免疫熒光染色觀察Exo被EC9706細胞攝取情況(×100)

2.5M2型巨噬細胞來源Exo對EC9706細胞遷移與侵襲的影響 Transwell實驗結果顯示,與EC9706組,與M2-Exo+EC9706組遷移數目與侵襲數目均顯著增加(P<0.001),見表3、圖4。

2.6M2型巨噬細胞來源Exo對HUVEC血管生成的影響 成管實驗檢測結果顯示,M2-Exo+HUVEC組形成的小管長度較HUVEC組顯著增加〔(24.45±2.27)vs(17.63±1.45)mm;t=87.149,P=0.000〕,見圖5。

表3 M2型巨噬細胞來源Exo對EC9706細胞增殖、遷移與侵襲、HUVEC形成小管長度的影響

圖4 M2型巨噬細胞來源Exo對EC9706細胞遷移與侵襲的影響(結晶紫染色,×100)

圖5 M2型巨噬細胞來源Exo對HUVEC血管生成的影響(×200)

3 討 論

腫瘤細胞與其周圍微環境之間有相互作用,且細胞外基質在促進腫瘤進展方面有重要作用。腫瘤的間質成分由內皮細胞、血管平滑肌細胞、成纖維細胞和炎癥細胞等組成,這些細胞會創造一個微環境從而改變腫瘤細胞的特性,并參與腫瘤的發展過程及對治療方案的反應〔6,8〕。作為食管癌腫瘤微環境的常見組成部分,腫瘤相關巨噬細胞(TAM)通過分泌多種生長因子和細胞因子來促進腫瘤發展。一般來說,巨噬細胞具有極化為M1型或M2型的特性,其中,TAM在表型和功能上均傾向M2表型,能夠抑制抗腫瘤免疫反應、調節腫瘤細胞耐藥性及加速腫瘤血管生成〔9,10〕。近年來,關于TAM與多種腫瘤之間的聯系已被研究者們明確,TAM為潛在的癌癥治療靶點。

隨著腫瘤的持續生長,腫瘤細胞通過一些途徑如血液、淋巴液等轉移到其他部位生成腫瘤,這種腫瘤稱為繼發性腫瘤。腫瘤的這種繼發性生長源于多步驟過程,其中原發性腫瘤細胞從原發部位脫離,侵入組織基底膜并導致細胞間黏附能力喪失,這增強了腫瘤細胞的遷移潛能及向血管或淋巴管的內滲,腫瘤細胞通過循環系統運輸并最終移動到遠處〔4,11,12〕。腫瘤基質細胞來源的Exo是腫瘤微環境中細胞間通訊的主要媒介,在腫瘤轉移中發揮關鍵作用。例如,Lan等〔13〕研究表明M2型巨噬細胞調節結直腸癌細胞的遷移和侵襲取決于M2型巨噬細胞來源的Exo,M2型巨噬細胞來源的Exo能夠促進結腸癌中細胞遷移和侵襲的潛能;Wu等〔14〕研究發現,整合素αMβ2(CD11b/CD18)在M2型巨噬細胞來源的Exo中具有顯著的特異性和有效性,阻斷CD11b和(或)CD18能夠致使M2型巨噬細胞來源的Exo介導的肝細胞癌細胞轉移明顯減少,從機制上講,M2型巨噬細胞來源的Exo介導CD11b/CD18的細胞間轉移,從而激活受體肝細胞癌細胞中的基質金屬蛋白酶-9信號途徑以促進腫瘤發生遷移。與上述研究結果一致,本研究通過使用M2型巨噬細胞來源的Exo與食管癌細胞系EC9706共培養后發現,該作用增加了EC9706細胞的增殖活性,并促進了細胞的轉移與侵襲能力。

腫瘤血管能夠為腫瘤細胞提供氧氣與營養物質以維持其生長及擴散,因此,血管生成對于癌癥的發展和轉移至關重要,靶向抑制腫瘤血管生成也是食管癌治療的一個重要手段〔15〕。研究表明,M2型巨噬細胞可通過旁分泌效應調控血管周圍環境和相關細胞生長及遷移。Yang等〔16〕研究指出,M2型巨噬細胞來源的Exo可以促進體外小鼠主動脈內皮細胞的血管生成從而促進腫瘤的增長;Hughes等〔17〕揭示M2型巨噬細胞來源的Exo能夠加速惡性腫瘤的血管生成,因為這種Exo可以釋放IL-1β、VEGF、TNF-α 及其他一些促血管生成的細胞因子。在本研究中,通過將HUVEC與M2型巨噬細胞來源Exo共培養后,HUVEC的血管生成能力顯著提高,這進一步驗證了M2型巨噬細胞通過Exo途徑促進腫瘤血管生成的作用。

綜上,M2型巨噬細胞來源的Exo對食管癌腫瘤細胞生長、轉移及血管生成有促進的作用,這為后續進一步探索靶向腫瘤微環境中M2型巨噬細胞來源的Exo從而建立食管癌治療方案的探究奠定了實驗基礎。