氯胺酮對肝損傷大鼠腦認知功能、肝細胞活性及NO、cGMP水平的作用機制

蔡昊彤 陳權 尤麗娜 尚游 張玲 張存誠

(1錦州醫科大學附屬第一醫院麻醉科,遼寧 錦州 121000;2天津市第一中心醫院)

肝臟作為機體代謝的主要器官之一,具有物質代謝、解毒等多種生理功能,肝臟損傷也是臨床中常見的病理過程,其中包括休克、感染、肝臟外傷及肝移植所致的肝臟功能損害、衰竭等,都會影響臨床的預后及轉歸〔1〕。現階段對于肝損傷防治主要以藥物為主,隨著各種新藥及聯合用藥的廣泛增多對肝損傷的預防及治療有重要作用〔2〕。麻醉藥物不僅只發揮神經阻滯作用,某些麻醉藥物可通過清除氧自由基和增強超氧化物歧化酶活性的雙重作用,進而達到藥物治療的目的〔3〕。因此,選擇適宜麻醉藥物對于肝損傷的治療是十分必要的。氯胺酮是N-甲基-D-天冬氨酸受體的非競爭性拮抗劑,作為臨床常用的靜脈麻醉藥物,具有鎮痛效果好、無明顯呼吸抑制等優勢。相關研究表示,氯胺酮可能通過調控相關蛋白表達進而發揮肝保護作用,但是也被提出能夠損害機體的學習和記憶能力,使實驗動物部分區域的神經元凋亡,對大鼠認知功能障礙程度及作用機制尚缺乏研究報道〔4〕。當肝損傷時,外周血中一氧化氮(NO)、尿液環磷酸鳥苷(cGMP)升高,cGMP能夠激活效應分子和依賴性蛋白激酶等從而介導肝損傷。NO具有多種生物學活性,在肝損傷中反應血管舒張狀態和調控免疫功能等作用,NO的生物學效應都是通過增加cGMP的合成來實現的〔5〕。本文探討氯胺酮對肝損傷大鼠腦認知功能、肝細胞活性及NO、cGMP水平的作用機制。

1 材料與方法

1.1實驗大鼠 選取雌雄各半的健康級大鼠40只,4～6月齡,體質量160～250 g,由基爾頓生物科技(上海)提供,嚴格按照《實驗動物管理條例》規定進行實驗,動物許可證號:SYXK(上):2019-0025,室溫控制在15～18 ℃室內飼養,濕度約為70%每日12 h光照,喂養條件為自由攝取標準飼料,飲用干凈自來水。

1.2儀器與試劑 透射電鏡(美國Bio-Rad公司),顯微鏡(重慶光學儀器廠產XSZ-5B),切片機(上海醫用儀器廠),一次性無菌注射器、丙泊酚(桂林中輝科技發展有限公司),生理鹽水(重慶天圣制藥有限公司),氯胺酮(重慶藥友制藥有限公司),檸檬酸緩沖液、細胞檢測試劑盒(上海生物工程有限公司)。胎牛血清(南京建成生物工程研究所),TCNEL(武漢中健科技開發公司)。

1.3建模 將40只大鼠20～25 ℃、相對濕度40%～70%、光照周期12 h環境中適應性喂養1 w,隨機挑選10只為正常組,其余30只均制備肝損傷大鼠模型,稱取D-氨基半乳糖(GalN)與脂多糖(LPS)后溶于生理鹽水,制成D-GalN 200 mg/ml,LPS 5 μg/ml溶液,與實驗前2 h腹腔注射1次2.0 ml/kg,連續干預7 d,模型建立參考吳林嵐等〔6〕標準。

1.4分組與給藥 所有大鼠經建模成功后采用隨機數字法分為正常組、模型組、氯胺酮組、丙泊酚組,平均每組10只大鼠。除正常組均建立肝損傷模型,丙泊酚組使用丙泊酚0.5 ml/次,1次/d注射,氯胺酮組采用氯胺酮1.0 mg/次,1次/d進行注射,正常組及模型組采用等劑量的生理鹽水處理,1次/d,連續干預10 d。

1.5標本采集 干預后,禁食14～16 h大鼠,抽取腹部靜脈血1 ml,5 ℃測空腹血糖,3 500 r/min離心10 min,上清液1 ml裝于1.5 ml Eppendorf管中,-20 ℃冰箱保存待測。經腹腔注射氯胺酮40 mg/kg麻醉,待大鼠麻醉后打開腹腔,取直徑5 mm、厚1 mm的肝組織,浸泡于甲醛液中固定,以上標本均暫凍存于-70 ℃冰箱中備用。

1.6肝組織勻漿CⅣ、血清NO、cGMP檢測 肝組織勻漿CⅣ檢測抽空腹靜脈用放射免疫RIA法檢測,血清NO、cGMP檢測采用酶聯免疫吸附試驗嚴格按照說明書標準進行測定。

1.7Morris水迷宮檢測認知功能 干預結束后,對各組大鼠進行Morris水迷宮測試,為水深30 cm、池底黑色、水溫28 ℃,測試第1天將大鼠放入水中進行自由活動,以適應測試環境減少應激反應。正式測試時將大鼠引導至水池第三象限的平臺上,停留20 s后將其放入水中,讓大鼠自行尋找平臺,每天測試4次,每次間隔5 min,每日以大鼠4次測試潛伏期的平均值作為當日結果,連續干預3 d后進行定位航行測試,每日固定時間將大鼠放入標記好的入水點中,記錄大鼠在2 min內爬上平臺并停留所消耗的時間,連續測試5 d,即為逃避潛伏期,逃避潛伏期完成后的第2天進行空間探索測試,先將平臺撤去將大鼠從第三象限入水,記錄大鼠在2 min內穿越原平臺所在區域的次數和時間。

1.8蘇木素-伊紅(HE)染色 取大鼠肝組織樣品后經過梯度濃度酒精脫水,再放置于二甲苯中透明,后放入石蠟中包埋。使用切片機將組織切片,每張切片厚度為4～5 μm。染色前,將石蠟切片置于二甲苯中脫去石蠟,10%中性甲醛固定做石蠟切片,依次由無水乙醇、90%乙醇、80%乙醇和 70%乙醇脫水后用清水沖洗,在90 ℃烤箱中烘烤 20 min 后于蘇木素中染色10 min,清洗后,伊紅染色1 min。60 ℃烘干后進行中性樹脂封片,將組織切片于顯微鏡下觀察后拍照。

1.9TUNEL檢測細胞凋亡 將厚度為2 μm的肝組織石蠟切片脫蠟至水,磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗3次,3 min/次,1%H2O2室溫孵育15 min,抑制內源性過氧化物酶,PBS沖洗3次,每次3 min,20 μg/ml蛋白酶K消化20 min,37 ℃,PBS沖洗3次,每次3 min,浸入TUNEL混合液中37 ℃,1 h,PBS沖洗3次,每次3 min,0.03%H2O2顯色10 min,流水沖洗終止反應,蘇木素染1 min后水洗,鹽酸乙醇分化30 s,水洗藍化以常規樹脂封片,光鏡下觀察凋亡細胞呈棕黃色。每張切片在200倍鏡下隨機選擇10個視野進行觀察,計數凋亡指數(AI)=凋亡細胞個數/細胞總數×100%。

1.10Western印跡檢測肝組織NO、cGMP蛋白表達 取肝組織切片,使用3%的H2O2和0.01 mol/L的PBS沖洗,使用微波修復抗原,再次使用3%的H2O2溶液孵育10 min,PBS沖洗后微波修復抗原,使用4%牛血清蛋白孵育15 min,加入一抗NO(1∶100)、cGMP(1∶500),使用0.01 mol/L的PBS沖洗并加入二抗羊抗兔IgG(1∶10 000),孵育60 min,PBS沖洗,加入鏈霉、親和素、生物素、辣根過氧化物酶復合物(SABC 1∶300)孵育60 min,二氨基聯苯胺(DAB)顯色,分別雜交,PBS沖洗,后將膜浸入電化學發光(ECL)工作液,檢測獲取圖像。

1.11統計學分析 采用軟件SPSS20.0軟件進行χ2檢驗、重復測量方差分析、t檢驗。

2 結 果

2.1各組肝組織HE染色 正常組肝板紋理清晰,肝細胞結構排列整齊有序;模型組炎細胞浸潤明顯,核固縮嚴重,脂肪滴較多,索狀結構不清,肝竇間狹窄、充血,肝細胞排列紊亂;氯胺酮組肝板紋理較清楚,有少量炎性細胞,肝細胞排列較整齊,索狀結構趨于清晰;丙泊酚組肝板紋理稍顯清晰,肝細胞仍有腫脹、充血現象、炎性細胞及中央靜脈擴張仍有脂肪滴產生。見圖1。

圖1 各組肝組織(×200)

2.2各組認知功能比較 與正常組比較,模型組逃避潛伏期明顯升高,原平臺穿越次數、原平臺穿越時間明顯降低(P<0.05);與模型組比較,氯胺酮組逃避潛伏期明顯升高,原平臺穿越次數、原平臺穿越時間明顯降低(P<0.05);與氯胺酮組比較,丙泊酚組逃避潛伏期明顯降低,原平臺穿越次數、原平臺穿越時間明顯升高(P<0.05)。見表1。

2.3各組肝組織勻漿CⅣ、血清NO、cGMP比較 與正常組比較,模型組肝組織勻漿CⅣ、血清NO、cGMP水平明顯較高(P<0.05);與模型組比較,氯胺酮組以上指標明顯降低(P<0.05);與氯胺酮組比較,丙泊酚組以上指標明顯升高(P<0.05)。見表1。

2.4各組肝組織中細胞AI比較 與正常組比較,模型組肝細胞凋亡指數明顯升高(P<0.05);與模型組比較,氯胺酮組上述指標明顯降低(P<0.05);與氯胺酮組比較上述指標明顯升高(P<0.05)。見圖1、表2。

2.5各組肝組織NO、cGMP蛋白比較 與正常組比較,模型組NO、cGMP蛋白水平明顯較高(P<0.05);與模型組比較,氯胺酮組以上指標明顯降低(P<0.05);與氯胺酮組比較,丙泊酚組以上指標明顯升高(P<0.05)。見表2、圖2。

表1 各組認知功能及肝組織勻漿CⅣ、血清NO、cGMP比較

表2 各組肝組織細胞凋亡指數及NO、cGMP蛋白表達比較

圖2 各組肝組織NO、cGMP蛋白表達

3 討 論

肝損傷是指在一系列病理化因素的作用下,肝細胞發生不同程度的腫脹、變性、壞死及凋亡現象,是各種肝臟疾病發生發展最基本狀態,也是多種肝病發展的必經階段,因此,阻斷肝損傷是現階段肝臟疾病治療中的關鍵問題〔7〕。氯胺酮可作用于脊髓部位發揮鎮痛、鎮靜、催眠作用,在中樞和外周神經系統共同發揮拮抗交感活性效應,并通過激活相關信號通路而抑制炎癥作用〔8〕。相關研究發現,氯胺酮抗抑郁的同時伴隨腦內葡萄糖代謝率升高,能夠使兔中樞神經系統產生損害和毒性作用,因此,氯胺酮對于認知功能及神經功能具有一定的副作用〔9,10〕。丙泊酚也是臨床常用靜脈麻醉藥,在肝保護方面也具有一定的積極影響,但在認知功能方面對海馬環路具有一定抑制作用,容易引起短期遺忘等相關機制〔11〕。

較多研究表明,麻醉劑可能通過引起海馬區神經元損傷進而造成學習能力和記憶能力的損害,但麻醉劑是如何引起海馬神經元毒性的目前還尚不明確〔12〕。本文結果表明,氯胺酮可大鼠的神經功能產生損害,使大鼠認知功能產生障礙。相關研究表明,氯胺酮可能刺激海馬區神經元系統進而造成學習記憶能力損害,但對于氯胺酮引起海馬神經元毒性原因還處于研究階段〔13〕。已經證實的是氯胺酮作為N-甲基-D-天冬氨酸的一種非競爭性拮抗劑,可能通過阻斷N-甲基-D-天冬氨酸受體減弱突觸的可塑性,阻斷各種刺激減少的中樞神經系統發育進而影響學習和記憶能力〔14〕。丙泊酚作為一種快速、短效的靜脈全身麻醉藥已廣泛應用于臨床。在臨床應用中發現丙泊酚可引起患者興奮、活躍等精神癥狀,尤其在麻醉恢復后的短時間內,可誘導改善認知功能和神經敏感性。Zhou等〔15〕研究表示,氯胺酮可能通過提高膽堿酯酶活性、降低乙酰膽堿水平,進而降低大鼠的學習和記憶能力。肝損傷中氯胺酮可能通過誘導壞死因子引起神經興奮增強,抑制海馬神經元發生,擴大神經系統炎癥級聯反應,導致神經系統毒性損傷。

肝組織勻漿CⅣ和血清NO、cGMP均與肝損傷存在一定的相關性,過量的NO可造成組織和細胞的損傷,可使肝臟等產生負性肌力作用,和肝臟的收縮力降低,而關于NO的損傷機制相關研究認為可能是由cGMP所介導的〔16〕。相關研究發現,氯胺酮可能對血清因子具有調節作用。本文結果表明,氯胺酮可能對改善肝組織勻漿CⅣ、血清NO、cGMP水平等具有一定作用。相關研究表示,通過血清濃度高低可以反映肝臟組織的敏感性,在肝部受損時CⅣ、NO、cGMP合成增多,3項指標的升高也標志著肝臟受損程度的加重,氯胺酮可能通過抑制肝組織中NO合成酶的活性,抑制肝細胞中鳥苷酸環化酶等因子的轉化,使cGMP、CⅣ等表達降低〔17〕。有研究〔18〕表示,肝組織勻漿CⅣ、血清NO、cGMP指標與肝損傷存在顯著的相關性,氯胺酮通過抑制cGMP與合成酶、水解酶等的動態表達,降低了組織內血清濃度和CⅣ、NO水平,表示血清標志物能在一定程度上反映肝部損傷的進展,氯胺酮可能通過降低肝組織勻漿CⅣ和血清NO、cGMP,有效阻止了肝損傷的發展。

肝細胞凋亡不僅是肝臟疾病早期損傷的重要病理改變,也是肝纖維化與肝硬化等晚期病變形成的基本條件,細胞凋亡作為引起肝損傷產生的核心機制之一,與肝部病變有著密切的聯系。本文結果表明,采用氯胺酮干預治療,對于肝損傷大鼠的細胞凋亡可能具有抑制作用。有研究〔19〕表示,氯胺酮可能通過抑制小鼠急性肝損傷早期的NO、cGMP血清水平,使肝臟脂肪酸合成酶抗原多效應細胞及巨噬細胞活性降低,并可能通過維持肝損傷大鼠的肝組織屏障,促肝進細胞的增生,進而減少內皮細胞的損傷和凋亡。氯胺酮可能對急性肝損傷大鼠肝細胞的凋亡具有抑制作用。相關研究表明,氯胺酮對肝細胞凋亡的抑制作用可能是其減輕肝組織炎癥壞死的重要機制,但氯胺酮是否具有良好的抗肝細胞凋亡的作用仍需要進一步研究〔20〕。

肝損傷中炎癥、組織壞死等病理現象的產生,常伴隨為肝組織內蛋白機制的增高。本文結果提示,氯胺酮可能對降低NO、cGMP蛋白表達改善肝損傷。肝損傷時肝臟對內毒素的滅活解毒能力下降,可能致使NO、cGMP等蛋白在體內蓄積,引起內毒素血癥的發生并損傷肝細胞活性,導致膽紅素結合與排泄障礙進一步加重肝臟損傷,從而形成惡性循環。氯胺酮可能通過降低NO蛋白表達,抑制肝臟組織內炎癥反應,改善因蛋白表達過高而引起的肝細胞凋亡現象。氯胺酮還可能通過抑制NO、cGMP表達使其肝組織中蛋白活性降低,并將沉積在肝組織內的細胞基質降解能力提高,進而抑制肝損傷機制的發展〔21〕。

綜上,氯胺酮可降低大鼠肝組織勻漿CⅣ、血清NO、cGMP水平,改善肝組織中細胞凋亡,降低NO、cGMP蛋白表達,但氯胺酮作為臨床鎮靜麻醉藥物,可能對認知功能產生損傷,且現階段對于氯胺酮在臨床中的應用還有待研究。