補腎益智方對SAMP8小鼠海馬α-Syn和PSD-95表達的影響

張彩霞 周泰冰 接琳琳 盧強 于海 吳君

(山東中醫藥高等專科學校,山東 煙臺 264199)

阿爾茨海默病(AD)是一種神經退行性疾病,中老年群體最常見,主要表現為學習認知障礙和行為改變,嚴重影響中老年人的生活質量〔1〕。隨著全球人口老齡化的加劇,預計到2050年AD患者將達到1.154億〔2〕,因此迫切需要對AD進行有效干預和治療。中醫認為AD認知障礙主要與腎虛髓虧、痰蒙腦竅有關,故中醫治療AD常用具有益精填髓、豁痰開竅功效的補腎類中藥復方〔3〕。補腎益智方是由枸杞子、山茱萸、益智仁、石菖蒲等組成的中藥復方,臨床試驗和動物實驗均表明,補腎益智方可通過影響突觸可塑性、神經炎癥、神經元分化與凋亡等方面,進而改善記憶障礙,而且副作用較少〔4,5〕。前期實驗室水迷宮實驗表明,補腎益智方能顯著提高AD模型鼠學習記憶能力〔6〕。本研究中通過觀察補腎益智方對 7月齡SAMP8 小鼠海馬內α-突觸核蛋白(Syn)和PSD-95表達的影響,探討其改善AD認知功能的機制,為補腎益智方在中醫辨治AD治療提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1實驗動物 7月齡雄性快速老化模型鼠SAMP8,108只,同月齡SAMR1正常老化小鼠,雄性,36只,均購自北京華阜康生物科技有限公司,動物許可證號 SCXK(京)2019-0008,SPF級。

1.2實驗藥物 補腎益智方組成:熟地黃15 g、枸杞子20 g、益智仁6 g、山茱萸12 g、當歸10 g、丹參15 g、石菖蒲10 g、郁金10 g等,以上藥物經山東天江藥業制成免煎顆粒。補腎益智方劑量設定根據成人的臨床給藥劑量 1.34 g/(kg·d)的2倍、4倍確立〔7〕,低、高劑量補腎益智方藥液終濃度分別為2.68、5.36 g/(kg·d)。

1.3實驗試劑 兔抗PSD-95多克隆抗體(ab238-135),鼠抗α-Syn多克隆抗體(ab1903)和兔抗Nestin多克隆抗體(ab221660)購自Abcam公司;熒光素-5-異硫氰酸鹽(FITC)標記的羊抗兔IgG(111-095-003)和TRITC標記的羊抗小鼠IgG(115-025-062)購自美國Jackson Immuno Research。

1.4分組、給藥與取材 隨機將SAMP8小鼠分為模型組、補腎益智方低、高劑量組。對照組為同月齡SAMR1小鼠。補腎益智方低、高劑量組分別給予相應劑量藥液灌胃,模型組和對照組均給予等量生理鹽水灌服。連續灌胃42 d。水合氯醛麻醉。一部分用4%多聚甲醛經心臟灌流固定,剝離小鼠大腦,常規制作石蠟切片,進行免疫熒光染色。另一部分置于冰上迅速剝離小鼠腦組織,進行Real-Time聚合酶鏈反應(PCR)和Western印跡檢測。

1.5免疫熒光染色 切片脫蠟,抗原修復,內源性過氧化物酶封閉;1%牛血清白蛋白(BSA)37 ℃孵育35 min。甩掉血清,分別滴加一抗(兔抗PSD-95 1∶200或鼠抗α-Syn 1∶200),4 ℃孵育過夜。滴加二抗(FITC標記的羊抗兔IgG 1∶400或TRITC標記的羊抗小鼠IgG 1∶400),37 ℃避光孵育50 min;4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染液染細胞核,封片。免疫熒光雙標記染色一抗為鼠抗α-Syn(1∶200)分別與兔抗PSD-95(1∶200)或兔抗Nestin(1∶500)的混合液,二抗為FITC標記的羊抗兔IgG(1∶400)和TRITC標記的羊抗小鼠IgG(1∶400)混合液,其他步驟相同。激光共聚焦顯微鏡觀察、攝片。

1.6Real-Time PCR 參照Zhou等〔8〕提取總RNA實驗步驟,提取總RNA,測定RNA濃度和純度,逆轉錄反應合成cDNA,進行Real-Time PCR實驗。引物序列:α-Syn上游:5′-CGTACAAGTGCTCAGTTCCAAT-3′,下游:5′-CCACAACAATATCCACAGCACA-3′;PSD-95上游:5′-ATGATCTTCTCTCCGAGTTCCC-3′,下游:5′-GAGGAGACAAGTGGTAATCGC-3′;GAPDH上游:5′-GAAGGTGGTGAAGCAGGCATCT-3′,下游:5′-CGGCATCGAAGGTGGAAGAGTG-3′。

1.7Western印跡檢測 提取海馬組織總蛋白。配制十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠,上樣,電泳,轉膜,5%脫脂奶粉溶液室溫封閉60 min;4 ℃一抗孵育過夜;羊抗兔二抗(1∶5 000)37 ℃搖床孵育55 min;電化學發光(ECL)反應3 min,暗室膠片曝光。

1.8統計學處理 采用ImageJ圖像軟件分別測量連續免疫熒光圖片α-Syn、PSD-95和Nestin陽性細胞平均光密度值和Western印跡條帶光密度值,采用SPSS20.0軟件進行統計分析。

2 結 果

2.1α-Syn定位于海馬區且在補腎益智方灌胃后表達降低 免疫熒光結果顯示,灌胃6 w后,各組海馬齒狀回、CA2和CA3區中均可檢測到大量的α-Syn陽性表達,呈點狀密集分布。與對照組比較,模型組海馬區α-Syn平均光密度值顯著升高(P<0.01)。與模型組比較,補腎益智方低、高劑量組海馬區α-Syn平均光密度值均顯著降低(P<0.05,P<0.01)。與補腎益智方低劑量組相比,補腎益智方高劑量組海馬區α-Syn平均光密度值差異無統計學意義(P>0.05)。Real-Time PCR和Western印跡結果顯示,與對照組比較,模型組海馬α-Syn mRNA和蛋白水平顯著更高(P<0.01,P<0.05)。與模型組比較,補腎益智方低、高劑量組海馬α-Syn mRNA和蛋白水平中顯著降低(P<0.05,P<0.01)。與補腎益智方低劑量組相比,補腎益智方高劑量組海馬α-Syn mRNA和蛋白水平差異無統計學意義(P>0.05)。見圖1、表1、圖2。

圖1 各組海馬區齒狀回α-Syn(免疫熒光染色,×400)

表1 各組海馬區α-Syn、PSD-95和Nestin 免疫陽性細胞平均光密度值及α-Syn、PSD-95 mRNA比較

圖2 各組海馬區α-Syn-PSD-95雙標記染色(免疫熒光染色,×400)

2.2α-Syn-PSD-95和α-Syn-Nestin免疫熒光雙標記檢測 α-Syn-PSD-95免疫熒光雙標記實驗表明:α-Syn主要表達于突觸結構。海馬齒狀回區,α-Syn分別密集分布于PSD-95陽性細胞和Nestin陽性細胞周邊。在CA1、CA2和CA3區,α-Syn主要分布于PSD-95陽性細胞一側。與模型組比較,補腎益智方低劑量組與高劑量組海馬齒狀回中Nestin平均光密度值均顯著增強(P<0.01)。見表1,圖2～4。

圖3 各組海馬CA3區α-Syn-Nestin雙標記染色(免疫熒光染色,×400)

2.3PSD-95定位于海馬區且補腎益智方灌胃后表達升高 免疫熒光結果顯示,補腎益智方灌胃42 d后,各組海馬齒狀回和CA區中均可檢測到PSD-95陽性細胞。與對照組比較,模型組海馬中PSD-95平均光密度值顯著降低(P<0.01)。與模型組比較,補腎益智方低、高劑量組海馬PSD-95平均光密度值均顯著增強(P<0.01)。與補腎益智方低劑量組相比,補腎益智方高劑量組海馬PSD-95平均光密度值差異無統計學意義(P>0.05)。

Real-Time PCR和Western印跡結果顯示,與對照組比較,模型組海馬PSD-95 mRNA和蛋白水平顯著降低(P<0.05)。與模型組比較,PSD-95 mRNA和蛋白水平在補腎益智方低、高劑量組海馬中均顯著升高(P<0.01,P<0.05)。與補腎益智方低劑量組相比,補腎益智方高劑量組海馬PSD-95 mRNA和蛋白水平差異無統計學意義(P>0.05)。見表1,圖5,圖6。

圖4 各組海馬CA2區α-Syn-Nestin雙標記染色(免疫熒光染色,×400)

圖6 Western印跡檢測各組海馬PSD-95和α-Syn 蛋白水平

3 討 論

AD 的病因基礎是腎虛髓虧,關鍵因素是痰、瘀共為濁邪,中醫常以“腎-髓-腦”為軸線,以補腎為先的理念論治AD,臨床已取得滿意療效〔9〕。補腎益智方中熟地黃、枸杞子、山茱萸可補腎填精,石菖蒲、當歸、郁金和遠志可化痰濕,散瘀血,氣血通行流利臻于和平,諸藥合用具有補腎健腦、活血益氣、開竅醒神的功效,恰好解決了 AD 本虛標實的病機特點〔10〕。臨床實踐證明,補腎益智方在老年遺忘型輕度認知功能障礙方面有療效〔11〕。實驗發現補腎益智方能有效改善6月齡SAMP8小鼠的學習和記憶能力〔12〕。越來越多的證據表明,突觸的變化和丟失是導致AD認知損傷最早最重要的病理原因〔13〕。海馬作為人體記憶和認知功能中樞,其神經元再生的減少和突觸形態結構、數量及功能狀態改變是AD早期學習和認知障礙的基礎〔14〕。

α-Syn是在突觸前成分中廣泛表達的一種可溶性神經元蛋白,有調節突觸囊泡運輸,維持神經元細胞膜穩態及調控多巴胺合成等作用〔15〕。Singh等〔16〕發現A53T α-Syn 轉基因鼠突觸后功能障礙和突觸可塑性異常,導致記憶和認知功能障礙。其機制一方面是由于α-Syn阻止突觸囊泡的形成,導致神經遞質釋放減少和細胞膜的通透性增加,引起Ca2+內流和興奮性毒性,神經元功能障礙甚至死亡〔17〕。另一方面,α-Syn寡聚體可通過降低微管的穩定性,破壞肌動蛋白和微管之間的相互作用,軸漿運輸減少,進而降低了突觸小泡的轉運功能及抑制微管蛋白的聚合作用〔18〕。本實驗與Singh等〔16〕結果一致。這可能是因為可溶性的α-Syn過度表達時,聚集形成可溶性的毒性寡聚體,進而降低SYN參與突觸傳遞效能的調控,影響突觸重塑和認知,導致記憶障礙〔19〕。另外,α-Syn與Tau和β-淀粉樣蛋白(Aβ)分子之間關系密切,表達水平彼此影響,導致AD認知功能損傷〔20〕。PSD-95是一種重要的成熟谷氨酸能突觸蛋白,有促進突觸前成分成熟,維持突觸后成分結構穩定,調節突觸可塑性和增加樹突棘數目和穩定性的作用,是檢測突觸重建水平的重要標志〔21〕。實驗證明,敲除PSD-95會阻礙鈣離子信號傳導,進而影響空間學習和記憶能力〔22〕。本實驗與Van Guilder 等〔23〕發現,PSD-95 隨著年齡增長表達逐漸下降的研究結果一致。結合PSD-95在穩定突觸可塑性方面的重要作用,推測SAMP8小鼠海馬區 PSD-95 表達下降可能與其記憶功能減退有關。

本實驗結果表明,補腎益智方通過影響α-Syn水平,有可能改善突觸前成分的結構與功能,進而影響突觸的可塑性和認知。本文補腎益智方低劑量組和高劑量組PSD-95 mRNA和蛋白量與模型組比較均顯著升高,這可能與穩定突觸連接,改善相關信號傳遞的功能有關。Jiao等〔24〕發現,敲除Tau基因能夠破壞PSD-95途徑,進而使α-Syn聚合體增加,導致神經元變性和功能異常。另外,也發現補腎益智方灌胃的SAMP8小鼠海馬區α-Syn表達降低時Nestin表達增高。這可能因為在AD中,α-Syn可通過激活Toll樣受體通路,破壞突觸功能和促進神經元死亡導致記憶障礙〔25〕,補腎益智方灌胃后可降低小鼠海馬α-Syn表達,進而增強海馬內源性神經干細胞的增殖和突觸重塑。本文結果顯示,與補腎益智方低劑量組相比較,高劑量組海馬中α-Syn、PSD-95和Nestin平均光密度值、mRNA和蛋白量未發現明顯變化,其原因可能與實驗動物月齡或所選藥物劑量等因素有關。

綜上,補腎益智方通過影響α-Syn、PSD-95和Nestin表達,調節突觸可塑性和神經干細胞的增殖,進而改善SAMP8小鼠學習和記憶功能,但其具體的作用機制仍需要研究探討。