艾司氯胺酮通過(guò)激活CREB/BDNF信號(hào)通路減輕抑郁癥大鼠海馬神經(jīng)元損傷

陳笛 溫昌明 李祥欣 孫軍 高軍 張?jiān)谛?張東煥 張保朝

(南陽(yáng)市中心醫(yī)院,河南 南陽(yáng) 473000)

抑郁癥是一種常見的心理疾病,患者焦慮、消極厭世、思維遲緩、認(rèn)知能力下降,易自殘甚至自殺,對(duì)患者自身安全及家人生活造成不利影響〔1,2〕。生理、心理、環(huán)境等多方因素均是抑郁癥的誘因,研究顯示,長(zhǎng)期的抑郁癥狀會(huì)損傷患者大腦結(jié)構(gòu)及功能〔3〕,海馬神經(jīng)元是應(yīng)激敏感區(qū)域,影像學(xué)結(jié)果顯示抑郁癥患者海馬區(qū)域密度有所下降,可見神經(jīng)元樹突減少及壞死〔4〕;應(yīng)激構(gòu)建的大鼠模型也存在海馬神經(jīng)元損傷〔5〕。因此從減輕神經(jīng)元損傷方面入手探求治療藥物是可行方案之一。艾司氯胺酮是常用麻醉藥物氯胺酮的異構(gòu)體,具有鎮(zhèn)痛與鎮(zhèn)靜的作用,在心血管、精神疾病治療方面不良反應(yīng)小,此外在抑郁癥患者中具有一定應(yīng)用〔6,7〕,但抗抑郁作用機(jī)制并未明確,可能是通過(guò)改善神經(jīng)可塑性發(fā)揮作用的。腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(BDNF)是神經(jīng)元分化、生長(zhǎng)等一系列活動(dòng)中的必需物質(zhì),受環(huán)磷腺苷效應(yīng)元件結(jié)合蛋白(CREB)的靶向調(diào)控〔8〕,研究顯示,抑郁癥患者血清BDNF水平明顯降低,給予抗抑郁藥物治療后,其水平升高〔9〕。本研究探究艾司氯胺酮調(diào)控CREB/BDNF通路對(duì)抑郁癥大鼠海馬神經(jīng)元的影響。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、主要試劑與儀器 72只SPF級(jí)Wistar雄性大鼠〔SCXK(粵)2019-0047〕購(gòu)自廣州中醫(yī)藥大學(xué),飼養(yǎng)環(huán)境:晝夜交替,室溫養(yǎng)育。帕羅西汀(BB3116)購(gòu)自上海源葉;艾司氯胺酮(批準(zhǔn)文號(hào):國(guó)藥準(zhǔn)字H20193336)購(gòu)自恒瑞醫(yī)藥;CREB抑制劑-k252a(E0441)購(gòu)自selleck;5-羥色胺(HT,ml059562)、多巴胺(DA,ml003201)、去甲腎上腺素(NE,ml002873)試劑盒購(gòu)自上海酶聯(lián);蘇木素-伊紅(HE)染色試劑盒(C0105S)、尼氏(Nissl)染色試劑(C0117)購(gòu)自上海碧云天;CREB(GTX112846)、p-CREB(GTX130379)、BDNF(GTX132621)、GAPDH(GTX124502)購(gòu)自GeneTex;山羊抗兔lgG(ab6721)購(gòu)自美國(guó)abcam公司;曠場(chǎng)分析系統(tǒng)(BYZ-DG902)購(gòu)自東莞博之遠(yuǎn)生物科技發(fā)展有限公司。

1.2大鼠分組及造模 將72只大鼠隨機(jī)分為空白組、模型組、帕羅西汀組(10 mg/kg)〔10〕、艾司氯胺酮組〔7〕、k252a(20 μl/kg)組〔11〕、艾司氯胺酮+k252a組,每組12只。除空白組外大鼠參照文獻(xiàn)方法〔12〕構(gòu)建抑郁大鼠模型,所有大鼠單籠飼養(yǎng);28 d內(nèi)隨機(jī)給予禁食24 h(與禁水不能連著刺激)、禁水24 h、夾尾、足底電擊、4 ℃冰水中強(qiáng)迫游泳、熱應(yīng)激、噪聲等應(yīng)激。在此期間空白組喂養(yǎng)28 d,不予應(yīng)激。帕羅西汀組腹腔注射10 mg/kg帕羅西汀(28 d);艾司氯胺酮組腹腔注射15 mg/kg艾司氯胺酮(28 d);k252a組以前囟為基點(diǎn),前0.8 mm,右1.5 mm,深3.5 mm處勻速注入20 μl/kg k252a(25 mmol/L,1次注射);艾司氯胺酮+k252a組進(jìn)行15 mg/kg艾司氯胺酮腹腔注射與腦定位注射20 μl/kg k252a處理。

1.3大鼠行為學(xué)觀察 曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn):實(shí)驗(yàn)開始前,大鼠在通風(fēng)、暗光實(shí)驗(yàn)室中適應(yīng)10 min以上。將礦場(chǎng)分析箱分為25個(gè)方格并編號(hào),將大鼠放入正中格(13),觀察其3 min內(nèi)活動(dòng)情況,穿越方格數(shù)為水平活動(dòng)得分(四肢全部進(jìn)入),以后肢直立為垂直活動(dòng)得分(離開地面1 cm),以3 min中內(nèi)停留不動(dòng)為不動(dòng)時(shí)間。糖水消耗試驗(yàn):在造模前對(duì)各組大鼠進(jìn)行蔗糖攝入訓(xùn)練,完成訓(xùn)練階段的糖水習(xí)慣化。大鼠禁水16 h(不禁食),在大鼠籠內(nèi)隨機(jī)擺放兩個(gè)飲水瓶(1%蔗糖水和清水),4 h后,計(jì)算大鼠4 h內(nèi)清水與糖水消耗量。糖水偏好系數(shù)=糖水?dāng)z入量/(糖水?dāng)z入量+清水?dāng)z入量)×100%。

1.4動(dòng)物取材及指標(biāo)檢測(cè) 行為學(xué)結(jié)束后,大鼠迅速處死,在冰上取大鼠腦組織,在海馬區(qū)(距離前囟-2.28～-4.08 mm處)取腦組織,一部分按一定比例(1∶9)加入生理鹽水以制備海馬組織勻漿,一部分腦組織液氮保存,一部分腦組織進(jìn)行甲醛固定、梯度乙醇脫水處理、石蠟包埋、切片。

1.5酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)大鼠海馬組織5-HT、DA、NE表達(dá)水平 取1.4中海馬組織勻漿,通過(guò)ELISA試劑盒檢測(cè)其5-HT、DA、NE水平,嚴(yán)格參照各自試劑盒操作說(shuō)明書進(jìn)行。

1.6HE染色和Nissl染色分別觀察大鼠海馬神經(jīng)元損傷情況 HE染色:取1.4中石蠟海馬組織標(biāo)本,常規(guī)脫蠟(二甲苯)、梯度乙醇脫苯、沖洗,將脫蠟至水的切片放入蘇木素水溶液中染色,酸水及氨水中分色各5 s,流水沖洗1 h,置于蒸餾水中,酒精脫水(70%與90%)各10 min,放于伊紅染色液中3 min,二甲苯透明,中性樹脂封片,光學(xué)顯微鏡下觀察。Nissl染色:取1.4中石蠟海馬組織標(biāo)本,二甲苯中脫蠟10 min(行3次),脫蠟至水、Nissl染色液中染色10 min、蒸餾水洗滌2次、脫水、透明、封固后于光鏡下觀察CA1區(qū)神經(jīng)元數(shù)目。

1.7免疫組化法觀察海馬組織BDNF表達(dá)情況 取1.4中石蠟切片,檸檬酸修復(fù)液修復(fù),胎牛血清封閉,添加兔抗BDNF,冰箱冷藏孵育24 h,加入二抗,光學(xué)顯微鏡觀察海馬組織BDNF情況。

1.8Western印跡檢測(cè)大鼠海馬組織CREB、BDNF通路表達(dá)情況 取1.4中液氮保存的海馬組織冰上裂解,離心取上清液,蛋白質(zhì)試劑盒提取蛋白,二喹啉甲酸(BCA)試劑盒定量,取50 μg行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE),將所得蛋白低溫轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上,封閉,添加CREB、p-CREB、BDNF、GAPDH一抗,稀釋比分別為1∶1 000、1∶1 000、1∶1 000、1∶5 000,4 ℃孵育12 h,加入二抗(稀釋比為1∶5 000)孵育,電化學(xué)發(fā)光(ECL)試劑進(jìn)行顯色后系統(tǒng)拍照,采用ImageJ軟件計(jì)算表達(dá)量。

1.9統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS23.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)、方差分析,兩兩比較行SNK-q法。

2 結(jié) 果

2.1艾司氯胺酮對(duì)抑郁癥大鼠行為學(xué)的影響 與空白組相比,模型組水平運(yùn)動(dòng)得分、垂直運(yùn)動(dòng)得分、糖水偏好率明顯下降,停留不動(dòng)時(shí)間明顯增長(zhǎng)(均P<0.05);與模型組相比,帕羅西汀組、艾司氯胺酮組水平運(yùn)動(dòng)得分、垂直運(yùn)動(dòng)得分、糖水偏好率明顯升高,停留不動(dòng)時(shí)間明顯縮短,k252a組水平運(yùn)動(dòng)得分、垂直運(yùn)動(dòng)得分、糖水偏好率明顯降低,停留不動(dòng)時(shí)間明顯增長(zhǎng)(均P<0.05);與艾司氯胺酮組相比,艾司氯胺酮+k252a組水平運(yùn)動(dòng)得分、垂直運(yùn)動(dòng)得分、糖水偏好率明顯降低,停留不動(dòng)時(shí)間明顯增長(zhǎng)(均P<0.05),見表1。

2.2艾司氯胺酮對(duì)抑郁癥大鼠海馬組織勻漿5-HT、DA、NE水平的影響 與空白組相比,模型組海馬組織勻漿5-HT、DA、NE水平明顯降低(均P<0.05);與模型組相比,帕羅西汀組、艾司氯胺酮組海馬組織勻漿5-HT、DA、NE水平明顯升高,k252a組海馬組織勻漿5-HT、DA、NE水平明顯降低(均P<0.05);與艾司氯胺酮組相比,艾司氯胺酮+k252a組海馬組織勻漿5-HT、DA、NE水平明顯降低(均P<0.05),見表1。

表1 各組運(yùn)動(dòng)能力、糖水偏好、海馬組織勻漿5-HT、DA、NE水平表達(dá)

2.3光學(xué)顯微鏡觀察艾司氯胺酮對(duì)抑郁癥大鼠海馬神經(jīng)元的影響 HE染色顯示,空白組海馬神經(jīng)元結(jié)構(gòu)完整,排列整齊;模型組海馬神經(jīng)元核固縮,出現(xiàn)空泡、變性,排列疏松;與模型組相比,帕羅西汀組、艾司氯胺酮組神經(jīng)元排列較為整齊,核固縮、空泡現(xiàn)象緩解,而k252a組神經(jīng)元損傷加重;與艾司氯胺酮組相比,艾司氯胺酮+k252a組神經(jīng)元損傷加重。Nissl染色顯示,空白組海馬組織尼氏體豐富;模型組尼氏體減少、皺縮,神經(jīng)元數(shù)量減少;相較于模型組,帕羅西汀組、艾司氯胺酮組尼氏體數(shù)量增多,神經(jīng)元數(shù)量增加,而k252a組尼氏體數(shù)量、神經(jīng)元數(shù)量減少;與艾司氯胺酮組相比,艾司氯胺酮+k252a組尼氏體數(shù)量、神經(jīng)元數(shù)量減少,見圖1。

圖1 各組海馬神經(jīng)元(×200)

2.4免疫組化法觀察 與空白組相比,模型組海馬組織BDNF陽(yáng)性細(xì)胞增多;與模型組相比,帕羅西汀組、艾司氯胺酮組海馬組織BDNF陽(yáng)性細(xì)胞減少,k252a組海馬組織BDNF陽(yáng)性細(xì)胞增多;與艾司氯胺酮組相比,艾司氯胺酮+k252a組海馬組織BDNF細(xì)胞增多,見圖2。

圖2 各組海馬組織BDNF表達(dá)(免疫組化,×400)

2.5Western印跡試驗(yàn)檢測(cè)艾司氯胺酮對(duì)抑郁癥大鼠海馬組織CREB/BDNF通路的影響 與空白組相比,模型組海馬組織CREB、p-CREB、BDNF表達(dá)明顯降低(P<0.05),與模型組相比,帕羅西汀組、艾司氯胺酮組海馬組織CREB、p-CREB、BDNF表達(dá)明顯升高,k252a組海馬組織CREB、p-CREB、BDNF表達(dá)明顯降低(均P<0.05);與艾司氯胺酮組相比,艾司氯胺酮+k252a組大鼠海馬組織CREB、p-CREB、BDNF表達(dá)明顯降低(均P<0.05),見表2、圖3。

表2 各組海馬組織CREB/BDNF通路蛋白表達(dá)影響

1～6:空白組、模型組、帕羅西汀組、艾司氯胺酮組、k252a組、艾司氯胺酮+k252a組圖3 Western印跡檢測(cè)各組海馬組織CREB、p-CREB、BDNF蛋白

3 討 論

抑郁癥不僅影響患者心理、精神狀態(tài),也會(huì)對(duì)患者大腦造成實(shí)質(zhì)損傷,研究表明,抑郁癥與神經(jīng)損傷互為因果,抑郁癥也是一種神經(jīng)功能障礙性疾病,神經(jīng)元損傷是其中的關(guān)鍵一環(huán),因此,改善神經(jīng)元損傷并探討相應(yīng)作用機(jī)制對(duì)抑郁癥的治療十分重要。

氯胺酮是常用麻醉劑,研究顯示其可作為抗抑郁藥物使患者獲益〔13,14〕,可快速發(fā)揮作用,減少患者自殺念頭。但氯胺酮是一個(gè)優(yōu)缺點(diǎn)都很明顯的抗抑郁藥物,氯胺酮主要使用途徑為靜脈注射,對(duì)于需要用此藥治療的患者來(lái)說(shuō)意味的高額價(jià)格負(fù)擔(dān)與不便。艾司氯胺酮是右旋氯胺酮,與氯胺酮相比,鎮(zhèn)痛效果更佳,且易于體內(nèi)清除、副作用低,可經(jīng)鼻給藥,有抗抑郁作用。2019年艾司氯胺酮被批準(zhǔn)用以治療難治性抑郁癥。Pereira等〔7〕研究顯示,艾司氯胺酮可緩解抑郁模型大鼠抑郁癥狀,且血清皮質(zhì)酮與促腎上腺皮質(zhì)激素水平下降。Canuso等〔15〕采用雙盲多中心法將68名抑郁癥患者分為艾司氯胺酮治療組與安慰劑組,發(fā)現(xiàn)艾司氯胺酮治療組蒙哥馬利奧斯博格抑郁評(píng)定量表評(píng)分顯著降低。Nunes等〔16〕認(rèn)為艾司氯胺酮可緩解精神分裂癥患者陰性癥狀。本研究結(jié)果表明,艾司氯胺酮可有效改善抑郁癥大鼠抑郁癥狀與海馬神經(jīng)元損傷,降低海馬神經(jīng)元可能為其發(fā)揮抗抑郁行為的原因,但具體機(jī)制有待進(jìn)一步探究。

BDNF廣泛分布于中樞神經(jīng)細(xì)胞,在海馬中大量表達(dá),BDNF可促進(jìn)神經(jīng)元分化、成熟已屬于業(yè)內(nèi)共識(shí),而神經(jīng)元的損傷與抑郁癥的發(fā)生有密切聯(lián)系〔17〕。趙指亮等〔18〕研究顯示,高齡抑郁癥患者血清BDNF下調(diào),且下調(diào)程度與抑郁程度有關(guān)。在大鼠抑郁癥模型中,預(yù)知子提取物可通過(guò)升高海馬BDNF水平影響大鼠抑郁行為〔19〕。BDNF受CREB調(diào)控,CREB是與抑郁癥相關(guān)通路的交匯點(diǎn),可調(diào)控多個(gè)神經(jīng)系統(tǒng)功能,研究顯示,CREB屬于抑郁癥患者易感基因〔20〕。此外CREB調(diào)控功能也受其自身磷酸化的影響,p-CREB可能是抗抑郁癥治療的分子標(biāo)志物,抑郁癥患者p-CREB、CREB水平均降低。本研究證明,CREB/BDNF通路與抑郁癥有一定聯(lián)系,艾司氯胺酮可能通過(guò)激活CREB/BDNF通路發(fā)揮降低神經(jīng)元損傷、抗抑郁作用。為驗(yàn)證這一猜想,通過(guò)對(duì)模型大鼠及艾司氯胺酮處理模型大鼠分別疊加CREB抑制劑k252a,發(fā)現(xiàn)k252a可加重抑郁大鼠神經(jīng)元損傷,加重抑郁,k252a可逆轉(zhuǎn)艾司氯胺酮對(duì)模型大鼠的治療作用,進(jìn)一步提示了艾司氯胺酮可能通過(guò)調(diào)控CREB/BDNF通路發(fā)揮抗神經(jīng)元損傷作用,進(jìn)而改善抑郁癥狀。