化濁解毒疏肝方對肝郁型功能性消化不良大鼠內臟敏感性及MAPK通路的影響

張玉卓 王立美 張亞秋 賈文文 王娜 王麗麗

(1河北省中醫藥科學院內科,河北 石家莊 050031;2石家莊市人民醫院心內科;3河北省中醫院脾胃科)

功能性消化不良(FD)是一種臨床綜合征,其特征是上腹部疼痛或燒灼感、早飽、飯中或飯后飽脹,這些癥狀可導致胃功能障礙〔1〕。FD的發病機制較為復雜,內臟高敏感性被認為是FD發病的重要機制〔2〕。目前西醫學對于 FD的治療主要是從控制飲食、抑制胃酸及抗焦慮抑郁等方面入手,但治療效果不佳〔3〕。中醫學則認為肝郁是FD的主要發病機制〔4〕,中醫通過辨證論治治療FD取得了良好的成效〔5〕。李佃貴教授認為,飲食不節,肝氣不舒,或氣郁化火、肝膽濕熱致使脾胃升降失和,運化受阻,濁毒內蘊而引發消化系統疾病〔6〕,治療多以化濁解毒調肝中藥為主,臨床應用多年,確有奇效。已有研究報道,化濁解毒調肝法可用于治療慢性萎縮性胃炎〔7〕。但關于化濁解毒疏肝方對肝郁型功能性消化不良大鼠內臟敏感性的影響尚不清楚,因此,本研究通過構建FD大鼠模型,探討化濁解毒疏肝方對FD大鼠模型抑郁狀態、胃腸動力、胃敏感性的影響及其可能的作用機制,旨在為FD的治療提供理論依據。

1 材料與方法

1.1驗動物 90只雄性Wistar大鼠購自北京維通利華實驗動物技術有限公司,生產許可證號為SCXK(甘)2018-0003。動物實驗均遵循3R原則,并得到醫院動物倫理委員會的批準。

1.2主要試劑 5-羥色胺(HT)酶聯免疫吸附試驗(ELISA)檢測試劑盒(貨號:JL10725)購自上海江萊生物科技有限公司;兔源一抗磷酸化(p)-細胞外調節蛋白激酶(ERK)1/2(貨號:K006217P)、ERK1/2(貨號:K106589P)、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH,貨號:K000027M )及辣根過氧化物酶(HRP)標記的山羊抗兔二抗(貨號:se134 )均購自北京索萊寶生物科技有限公司;p-p38絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)抗體(貨號:3438-100)購自艾美捷科技有限公司;p38MAPK抗體(貨號:ab4822)購自英國Abcam公司;電化學發光(ECL)試劑盒(貨號:10001)購自北京科宇深藍科技有限公司。

1.3化濁解毒疏肝方的制備 化濁解毒疏肝方由黃芩12 g、羅勒6 g、石菖蒲9 g、佩蘭9 g、藿香9 g、柴胡12 g、枳殼9 g、絞股藍12 g等組成,首先將上述藥物中加水浸泡1 h,然后煎煮2次,每次50 min,將2次煎液混合,濃縮成含生藥0.7、1.4、2.8 g/ml,置于4 ℃保存。

1.4FD模型的構建 參考文獻〔8〕復制FD模型,每天上午8點開始,用包裹有海綿的長止血鉗夾住大鼠尾部末端1/3處,通過該手段激怒大鼠使其相互廝打,每次夾尾持續時間為30 min,連續10 d,交替進行多種刺激:禁水禁食24 h、冷水下強迫游泳、晝夜顛倒、45 °傾斜籠子24 h。每天隨機不重復進行刺激,若大鼠出現飲食量減少,精神倦怠,毛發枯燥無光澤,易怒等癥狀,則視為造模成功。

1.5實驗分組 大鼠隨機分為對照組、模型組、化濁解毒疏肝方低劑量(中藥低劑量)組、化濁解毒疏肝方中劑量(中藥中劑量)組、化濁解毒疏肝方高劑量(中藥高劑量)組、陽性對照(多潘立酮)組,每組15只。除對照組外,其他組均需構建FD模型,造模成功后,參考文獻〔9,10〕及前期預實驗結果,中藥低、中、高劑量組分別按照7、14、28 g/kg的劑量灌胃,多潘立酮組按照10 mg/kg的劑量灌胃多潘立酮,對照組、模型組灌胃等量的生理鹽水,各組每日藥物處理1次,持續處理21 d。

1.6大鼠一般狀態觀察 觀察并記錄末次給藥結束后大鼠精神狀態、自由活動、飲食情況、皮毛生長及大便情況。

1.7糖水偏好實驗和曠場實驗 參考文獻〔11〕進行糖水偏好實驗。大鼠接受48 h的適應訓練,適應訓練24 h后進行1 h的糖水偏好測試。在48 h的適應訓練中,將一瓶裝有1%蔗糖溶液的水瓶、一瓶裝有自來水的水瓶分別放置在喂食隔間的左側和右側,每12 h更換一次,以防止慣性依賴造成的誤差。 適應訓練結束后,僅提供自來水6 h,然后禁止大鼠進食和飲水18 h。 隨后,在測試階段,給予大鼠兩個瓶子;一個為1%蔗糖溶液,另一個是自來水,1 h后,取走瓶子,糖水消耗率(%)=(糖水攝入量/總液體攝入量)×100%。

參考文獻〔12〕進行曠場實驗。將大鼠放在長、寬、高分別為70、70、40 cm的自制箱中,箱的內壁為黑色,箱的底面為25個10 cm×10 cm的正方形,水平得分為5 min內大鼠三爪以上進入箱底正方形數,進入一個為1分;垂直得分為雙前肢抬起高度超過1 cm的次數,每1次計1分。

1.8大鼠胃排空率及小腸推進率測定〔10〕各組選取5只大鼠,術前12 h禁食不禁水,灌胃營養性半固體糊,30 min后腹腔注射10%水合氯醛麻醉并處死大鼠,取出完整胃,稱取質量為全質量;剪開胃壁并用生理鹽水洗凈,濾紙吸干,稱取質量為凈質量,胃排空率(%)=(全質量-凈質量)/全質量×100%。取小腸全段,測量小腸總長度及幽門到營養性半固體糊上緣的距離,小腸推進率(%)=營養性半固體糊推進距離/小腸全長×100%。

1.9大鼠胃敏感性分析〔3〕經口將連接球囊的聚乙烯管插入麻醉大鼠的胃中,將2根金屬電極分別固定在大鼠兩側斜方肌用來記錄肌電活動。大鼠醒后,分別以20、40、60 mmHg的壓力向球囊施加壓力,每次持續30 s,每3 min 1次。以頸斜方肌肌電均方根變化率作為胃敏感性的評價指標,均方根變化率=(加壓期均方根-基礎均方根)/基礎均方根×100%。

1.10蘇木素-伊紅(HE)染色檢測大鼠胃竇組織病理變化 將固定在4%多聚甲醛中的胃竇組織用乙醇溶液脫水,并進行石蠟包埋,切成5 μm厚的切片,脫蠟,再水化,用蘇木素和伊紅染色,在光學顯微鏡下觀察大鼠胃竇組織病理變化。

1.11ELISA檢測胃組織勻漿中5-HT水平 將各組剩余的10只大鼠處死,收集胃組織及胃竇,胃竇固定于4%多聚甲醛中,胃組織保存于-80 ℃中。嚴格按照5-HT ELISA檢測試劑盒說明書檢測胃組織勻漿中5-HT水平。

1.12Western印跡檢測胃組織中MAPK通路相關蛋白 使用RIPA裂解緩沖液裂解并提取胃組織勻漿中的總蛋白,并通過二辛可寧酸測定進行蛋白質定量,蛋白質經電泳、轉膜、封閉后,加入一抗p-ERK1/2、ERK1/2、p-p38MAPK、p38MAPK、GAPDH在4 ℃下孵育過夜,再加入HRP耦聯的羊抗兔二抗在常溫下孵育1 h,最后通過ECL試劑盒檢測蛋白印跡情況。

1.13統計學分析 采用SPSS19.0軟件進行單因素方差分析、SNK-q檢驗。

2 結 果

2.1各組一般情況比較 對照組精神狀態良好,飲水和飲食正常,活動正常,皮毛光亮且光滑,糞便正常;模型組出現皮毛光澤度變差、活動能力下降、飲食量減少、易暴怒、大便不成形等現象;中藥低、中、高劑量組精神狀態相對穩定,皮毛光澤度有所改善,大便逐漸成形,且呈劑量依賴性;多潘立酮組一般情況與化濁解毒疏肝方高劑量組無明顯差異。

2.2各組糖水消耗率及曠場實驗得分比較 與對照組比較,模型組糖水消耗率、曠場實驗水平得分、垂直得分顯著降低(P<0.05);與模型組比較,中藥低、中、高劑量組糖水消耗率、曠場實驗水平得分、垂直得分顯著升高,且呈劑量依賴性(P<0.05);中藥高劑量組與多潘立酮組上述指標差異無統計學意義(P>0.05),見表1。

2.3各組胃排空率及小腸推進率比較 與對照組比較,模型組胃排空率、小腸推進率顯著降低(P<0.05);與模型組比較,多潘立酮組和中藥低、中、高劑量組胃排空率、小腸推進率顯著升高(P<0.05),見表1。

2.4各組胃竇組織病理變化比較 對照組胃竇組織結構完整,無炎性細胞浸潤;模型組胃竇黏膜伴有炎性細胞浸潤;與模型組比較,中藥低、中、高劑量組和多潘立酮組胃竇組織可見少量炎性細胞浸潤,但嚴重程度不及模型組,見圖1。

2.5各組胃敏感性比較 與對照組比較,模型組在20、40、60 mmHg壓力下的頸斜方肌肌電均方根變化率顯著升高(P<0.05);與模型組比較,中藥低、中、高劑量組20、40、60 mmHg壓力下的頸斜方肌肌電均方根變化率顯著降低,且呈劑量依賴性(P<0.05);中藥高劑量組與多潘立酮組上述指標差異無統計學意義(P>0.05),見表2。

2.6各組胃組織勻漿中5-HT水平比較 與對照組比較,模型組胃組織勻漿中5-HT水平顯著降低(P<0.05);與模型組比較,中藥低、中、高劑量組胃組織勻漿中5-HT水平顯著升高,且呈劑量依賴性(P<0.05);中藥高劑量組與多潘立酮組上述指標差異無統計學意義(P>0.05),見表2。

2.7各組胃組織中MAPK通路相關蛋白表達比較 與對照組比較,模型組胃組織中 p-ERK1/2/ERK1/2、p-p38MAPK/p38MAPK水平顯著升高(P<0.05);與模型組比較,中藥低、中、高劑量組胃組織中 p-ERK1/2/ERK1/2、p-p38MAPK/p38MAPK水平顯著降低,且呈劑量依賴性(P<0.05);中藥高劑量組與多潘立酮組上述指標差異無統計學意義(P>0.05),見表2、圖2。

表1 各組糖水消耗率及曠場實驗得分及胃排空率和小腸推進率比較

圖1 各組胃竇組織病理(HE染色,×200)

表2 各組頸斜方肌肌電均方根變化率及胃組織勻漿中5-HT水平和MAPK通路相關蛋白表達比較

1～6:對照組、模型組、中藥低劑量組、中藥中劑量組、中藥高劑量組、多潘立酮組圖2 Western印跡檢測各組胃組織MAPK通路相關蛋白表達

3 討 論

FD是一種常見的功能性胃腸病,其患病率接近20%〔13〕。該病不僅影響患者生活質量,還給醫療保健系統帶來了巨大的經濟負擔〔14〕。據報道,FD除胃腸道功能障礙外,約50%患者同時存在抑郁和焦慮等情感行為,且胃腸道功能障礙的嚴重程度與抑郁和焦慮的得分呈正比關系〔15〕。本研究采用慢性應激刺激法構建FD大鼠模型,結果發現,模型組大鼠出現皮毛光澤度變差、活動能力下降、飲食量減少、易暴怒、大便不成形等現象,提示造模成功。本研究還通過糖水偏好實驗和曠場實驗來評估大鼠的抑郁狀態,結果發現,FD大鼠模型伴有抑郁狀態。胃腸運動功能紊亂是FD發生的主要生理病理改變之一〔16〕,5-HT作為一種單胺類神經遞質物質,具有調節精神情緒及胃腸道動力的作用,其含量降低可導致胃腸推動力的下降〔17〕。本研究結果表明,FD模型大鼠胃腸運動功能紊亂。據報道,30%～40%的FD患者存在胃高敏感性,且胃敏感性的增加與上腹痛等癥狀的發生密切相關〔18〕。本研究提示,FD模型大鼠胃敏感性升高;采用慢性應激刺激法構建FD大鼠模型具有胃腸運動功能紊亂、伴有抑郁、胃敏感性升高等特點。

中醫學認為,FD屬于“胃脘痛”“痞滿”等范疇。由于飲食習慣、結構的改變及生活工作壓力的驟增,目前飲食不節、情志不舒多是FD發病的主要病因之一,飲食不節,則脾胃失和,清陽不升,濁陰不降,濕熱痰濁蘊結中焦,積久成熱成毒;情志不舒,肝失條達,則肝胃不和,濕熱久郁成瘀成毒,體內外濁毒纏綿膠著,互相搏結,致使脾胃不和,引發FD〔6〕。因此,FD病位在脾、胃、肝,治療多以化濁解毒疏肝中藥為主。化濁解毒疏肝方中羅勒、黃芩具有化濕解毒之功效,柴胡、枳殼具有理氣消積的作用,而藿香、佩蘭、絞股藍、石菖蒲等發揮了芳香化濁的作用。據報道,化濁解毒疏肝方可激活Rac1-cofilin通路發揮抗抑郁作用〔19〕;化濁解毒疏肝方治療膽汁反流性胃炎療效明顯〔20〕。本研究結果提示,化濁解毒疏肝方對FD大鼠具有較好的治療作用。

MAPK是絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶家族,該通路在炎癥、腫瘤等一系列疾病的病理生理過程中發揮重要作用〔21〕,并協同參與對腸道局部免疫及內臟高敏性的調控〔22〕。機體內腦腸肽水平異常或者體內外異常刺激均可直接或間接激活MAPK信號通路,通路中ERK1/2、P38和c-Jun氨基末端激酶(JNK)被大量活化,從而產生級聯反應。其中下游靶基因原癌基因(c-fos)是被公認的傷害性刺激神經元的標志物,當其表達異常增加時,會提升痛覺敏感性,使痛閾下調,導致功能性腸病呈現超高敏狀態〔23〕,進而出現腹痛、腹脹、抑郁等一系列臨床癥狀。已有研究報道,促腎上腺皮質激素釋放因子通過激活MAPK通路誘導低度炎癥,進而導致FD〔24〕。本研究表明,化濁解毒疏肝方對FD大鼠抑郁狀態及胃腸運動功能的改善作用,對胃敏感性的降低作用可能與抑制MAPK通路有關。

綜上,化濁解毒疏肝方可顯著改善FD大鼠抑郁狀態及胃腸運動功能,并降低胃敏感性,該機制可能與抑制MAPK通路有關,然而具體機制是否與MAPK通路有關,有待后續實驗深入探究。