夏枯草硫酸多糖下調miR-886-5p對肺結核模型大鼠的干預效果及作用機制

蔣琳華 陳秀琴 王瑜偉

(重慶市中醫院檢驗科 川渝共建感染性疾病中西醫結合診治重慶市重點實驗室,重慶 400021)

肺結核是慢性肺部傳染病,患病者通常會出現咳痰、咳血、咳嗽、胸悶等癥狀。感染結核分歧桿菌是基本病因,可通過患病者飛沫傳染,是否感染還取決于人體免疫、結核分枝桿菌數量、毒力有關,老年人發病率較高,能誘發全身多器官病變〔1,2〕。miR-886-5p可通過靶作用于程序性細胞死亡而調節免疫反應〔3〕。氨基轉移酶(ALT)主要存在于各細胞中,肝細胞中最多。谷草轉氨酶(AST)主要分布在肝臟、心肌等組織,是肝臟檢查的常用指標。腫瘤壞死因子(TNF)-α主要由巨噬細胞分泌,可促進T細胞產生炎癥因子。白細胞介素(IL)-6是種功能廣泛的多效性細胞因子,有調節免疫答應的作用〔4〕。有研究發現,轉化生長因子(TGF)-β1/Smad3信號通路參與了肺結核病變的發展〔5〕。另有研究發現,夏枯草硫酸多糖可緩解大鼠肝纖維化程度,在抗腫瘤中有重要意義〔6〕。夏枯草硫酸多糖有抗氧化、免疫調節功能及抗病毒的作用〔7〕。由于目前,臨床治療手段不甚理想,且夏枯草硫酸多糖對肺結核干預的研究較少,因此,本研究探究夏枯草硫酸多糖下調miR-886-5p對肺結核模型大鼠的干預效果及作用機制。

1 對象與方法

1.1研究動物 選取50只6～8周齡的SPE級Wistar大鼠,體質量160～210 g,由廣東至遠生物提供,動物許可證號:SYXK(粵)2021-0251,大鼠飼養于恒溫25 ℃,相對濕度為40%～60%的環境中。本次試驗操作均參照動物試驗倫理要求的相關規定,且經醫院倫理委員會批準同意。

1.2分組與建模 大鼠隨機選取10只為正常組,其余40只參照江葉舟等〔8〕研究建立肺結核模型作為建模大鼠,正常組給予普通飼料喂養,肺結核模型組給予高脂飼料(蛋白質20%,脂肪30%,碳水化合物50%)喂養,喂養4 w后每組隨機抽樣2只,取肺組織蘇木素-伊紅(HE)染色,發現肺組織可見大量炎性細胞浸潤為建模成功。建模成功后將肺結核模型組剩余的38只大鼠分為模型組(14只)、低劑量組(12只)、高劑量組(12只)。

1.3給藥干預 給予上述處理10 w后,于第11周開始給藥。低劑量組給予夏枯草硫酸多糖60 mg/kg,每4 d 1次,共3次。高劑量組給予夏枯草硫酸多糖100 mg/kg,每4 d 1次,共3次。正常組和模型組給予等量的生理鹽水。以上各組均連續灌胃2 w。

1.4病理形態學觀察 采血后取肺組織進行脫水、透明、包埋、制備橫切面石蠟切片,做HE染色,光鏡下觀察肺組織的病理形態改變。

1.5miR-886-5p水平檢測 miR-886-5p檢測采用ABI3500熒光定量PCR儀,反射條件為90 ℃ 10 min,變性15 s,63 ℃退火15 s,75 ℃延伸15 s,40個循環,延伸階段進行熒光檢測,計算出miR-886-5p表達水平,重復實驗5次。

1.6ALT、AST、TNF-α、IL-6水平檢測 抽取各組大鼠主動脈血5 ml,離心處理(離心半徑3 cm,轉速2 000 r/min,離心時間15 min),分離血清。通過酶聯免疫吸附試驗對ALT、AST、TNF-α、IL-6水平檢測,試劑盒由上海優利科生命科學有限公司(產品規格:48T/96T,貨號:YLK-E1138),重復實驗5次。

1.7肺組織中TGF-β1/Smad3信號通路蛋白測定 通過Western印跡對肺組織中的TGF-β1/Smad3信號通路蛋白TGF-β1、Smad3表達量進行檢測,加裂解液,離心,分離血清,二喹啉甲酸(BCA)法測定濃度,變性后,等量蛋白上樣,經過十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)、轉膜、5%脫脂奶粉常溫靜置1 h,加入1∶1 000 TGF-β1、1∶1 000 Smad3的一抗,4 ℃孵育12 h,加入相應的1∶10 000二抗,常溫孵育2 h,使用凝膠成像系統分析數據,以GAPDH為內參照,定量分析蛋白表達情況。二抗由北京百奧萊博科技有限公司(貨號:K28002)提供,重復實驗5次。

1.8統計學處理 采用SPSS19.0軟件進行方差齊性檢驗、獨立樣本t檢驗。

2 結 果

2.1肺結核模型的判定 如圖1所示,造模后病理切片顯示,正常組肺組織形態正常,結構均勻,未見炎性細胞浸潤;肺結核模型組有大量細胞變性,嚴重的炎性充血、水腫,大量炎性細胞浸潤;提示造模成功。

圖1 兩組光鏡下肺組織病理(HE染色,×400)

2.2病理特征比較 如圖2所示,正常組肺組織形態正常,結構均勻,無炎性細胞浸潤;模型組肺組織有大量細胞變性,嚴重的水腫,大量炎性細胞浸潤;低劑量組肺組織病變減輕,炎性細胞浸潤明顯減少;高劑量組肺組織形態基本正常,輕微炎性細胞浸潤。

圖2 各組肺組織病理特征(HE染色,×400)

2.3各組miR-886-5p表達水平比較 如表1所示,與正常組相比,模型組、低劑量組、高劑量組miR-886-5p表達水平升高,具有統計學差異(P<0.05);與模型組相比,低劑量組、高劑量組miR-886-5p表達水平降低,差異具有統計學意義(P<0.05);與低劑量組相比,高劑量組miR-886-5p表達水平降低,差異具有統計學意義(P<0.05)。

2.4各組ALT、AST水平比較 如表1所示,與正常組相比,模型組、低劑量組、高劑量組ALT、AST水平升高,具有統計學差異(P<0.05);與模型組相比,低劑量組、高劑量組ALT、AST水平降低,差異具有統計學意義(P<0.05);與低劑量組相比,高劑量組ALT、AST水平降低,差異具有統計學意義(P<0.05)。

2.5各組TNF-α、IL-6水平比較 如表1所示,與正常組相比,模型組、低劑量組、高劑量組TNF-α、IL-6水平升高,具有統計學差異(P<0.05);與模型組相比,低劑量組、高劑量組TNF-α、IL-6水平降低,差異具有統計學意義(P<0.05);與低劑量組相比,高劑量組TNF-α、IL-6水平降低,差異具有統計學意義(P<0.05)。

2.6各組肺組織TGF-β1/Smad3通路蛋白相對表達量 如表1、圖3所示,與正常組相比,模型組、低劑量組、高劑量組TGF-β1、Smad3表達量升高,具有統計學差異(P<0.05);與模型組相比,低劑量組、高劑量組TGF-β1、Smad3表達量降低,具有統計學差異(P<0.05);與低劑量組相比,高劑量組TGF-β1、Smad3表達量降低,具有統計學差異(P<0.05)。

表1 各組miR-886-5p、ALT、AST、TNF-α、IL-6表達水平及肺組織TGF-β1/Smad3通路蛋白相對表達量比較

圖3 各組肺組織TGF-β1/Smad3通路蛋白表達

3 討 論

肺結核是種慢性傳染病,人類免疫缺陷病毒(HIV)感染者、塵肺患者、糖尿病患者、免疫力低下者容易感染該病。患者咳嗽、大笑、談話、打噴嚏的時候可把含有結核分歧桿菌通過呼吸道進行傳播,被其他健康人吸入從而引發感染〔9,10〕。該病可以通過胸部X線檢查,可發現肺結核病變位置、范圍、形態等,根據其判斷有無空洞、病變性質等。夏枯草為多年生草本植物,其適應性較強,整個生長過程不易發生病蟲害,有消腫、清肝、清火明目的功效。夏枯草主要的活性成分是夏枯草硫酸多糖,屬于含有硫酸基的多糖,有抗炎、抗氧化的作用〔11,12〕。

miR-886-5p可較好地反映機體感染結核桿菌后機體發生的免疫答應,能作為肺結核嚴重程度的指標〔13〕。由于結核病和乙肝均是在患者免疫力低下的時候發生,臨床上兩種疾病合并發生較為常見,且長時間用抗結核藥物會引發藥物性肝損傷,保護好肝功能尤為重要〔14〕。ALT存在肝細胞質內,是由兩條相同的多肽鏈亞單位組成,是肝臟功能的重要指標,其正常參考值為0～40 U/L〔15〕。AST主要分布在肝臟、心肌等組織中,是反映肝損傷的主要指標,一旦肝細胞受損,AST會大量釋放入血〔16〕。TNF-α可激活不同的途徑誘導凋亡,可以促進T細胞產生各種炎癥〔17〕。IL-6是一種多效細胞因子,在機體發生炎癥反應、感染時,多種細胞因子可誘導機體產生IL-6〔18〕。本研究結果顯示,夏枯草硫酸多糖可以起到抑制大鼠肺組織miR-886-5p的水平,具有抗炎、抗氧化的作用。可以使ALT、AST、TNF-α、IL-6水平降低,提示其與肺結核緊密相關,可改善肝功能,減輕炎癥反應。

TGF-β1/Smad3信號通路參與了多種炎癥反應相關的疾病〔19〕。有研究表明,TGF-β1/Smad3信號通路導致肺纖維化,參與了復雜多樣的生物過程,有促細胞、抗增生的作用〔20〕。TGF-β1分布廣泛,通過信號傳導完成TGF-β1生物學作用。Smad3是TGF-β1表達的下游信號通路,與眾多的心肌、肺、腎等組織纖維化緊密相關〔21〕。本研究結果顯示,夏枯草硫酸多糖有抗炎、抗氧化應激的作用,通過抑制TGF-β1/Smad3信號通路蛋白可以減少肺結核大鼠的病變,發揮抗炎作用,減輕細胞浸潤,表明TGF-β1/Smad3信號通路與肺結核的發生緊密相關。但目前未有研究將其用于肺結核的研究中,因此上述研究需后續研究進一步分析驗證。

綜上所述,肺結核發生后炎性因子、肝功能指標上升,經過夏枯草硫酸多糖干預后可使炎癥及肺結核組織病變減輕、肝功能改善,經過夏枯草硫酸多糖下調miR-886-5p干預后可使肺結核臨床癥狀改善,其機制可能與TGF-β1/Smad3通路被抑制有關。