小檗堿通過NF-κB/iNOS-COX-2信號通路對睡眠剝奪大鼠認知功能的影響

雷雨 劉偉 王鵬

(武漢市精神衛生中心精神科,湖北 武漢 430022)

睡眠剝奪(SD)指由于各種因素影響,致使機體喪失部分或全部正常睡眠質量的情況,這種情況可能會造成機體一些正常功能的改變,如認知功能出現障礙、精神方面出現焦慮、抑郁等〔1,2〕,這不僅會降低工作效率,嚴重的話還可能會導致事故發生,威脅生命健康〔3〕。研究顯示,海馬炎癥在認知功能障礙中存在重要作用〔4〕。核因子(NF)-κB是細胞信號轉錄最重要的通路之一,在炎癥反應、細胞凋亡等多種生理病理過程中發揮調節作用〔5〕。誘導型一氧化氮合酶(iNOS)、環氧化酶(COX)-2是受NF-κB調控的兩條參與炎癥信號轉導的下游信號通路,對細胞炎癥損傷和疼痛反應具有促進作用〔6,7〕。小檗堿是從黃連植物中提取的生物堿化合物,目前主要應用于胃腸道相關疾病的治療,除此之外,它還具有抗炎、抗高血壓、降低血糖、抗腫瘤等生物活性〔8〕。本研究探討小檗堿對SD大鼠認知功能障礙的影響及可能的機制。

1 材料與方法

1.1實驗動物 8周齡SPF級Wistar大鼠,體質量(200±20)g,購于上海斯萊克實驗動物有限責任公司,許可證號:SCXK(滬)2017-0005。

1.2主要試劑、儀器 鹽酸小檗堿片購于天子福國際藥業(江蘇)有限公司(國藥準字H32024328);艾司唑侖片購于廣東臺城制藥股份有限公司(國藥準字H44021098);超氧化物歧化酶(SOD)檢測試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)檢測試劑盒、丙二醛(MDA)檢測試劑盒(S0087、S0056、S0131S)購于上海碧云天生物技術有限公司;大鼠腫瘤壞死因子(TNF)-α酶聯免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒、大鼠白細胞介素(IL)-6、大鼠IL-17 ELISA試劑盒、大鼠S100B ELISA試劑盒、兔抗NF-κB p-p65、兔抗COX-2、兔抗iNOS、山羊抗兔IgG購于Abcam公司(ab236712、ab234570、ab214028、ab234573、ab763-02、ab179800、ab178945、ab6721);大鼠神經元特異性烯醇化酶(NSE)ELISA試劑盒購于上海酶研生物科技有限公司(EK-R38046)。

DX-4XC金相顯微鏡購于寧波德迅檢測設備有限公司;Alpha View凝膠成像儀購于蘇州阿爾法生物實驗器材有限公司;YH-MWM Morris水迷宮實驗裝置購自武漢一鴻科技有限公司。

1.3動物分組、給藥及SD模型構建 將大鼠隨機分為對照組、SD組、小檗堿低、中、高劑量組(小檗堿-L組、小檗堿-M組、小檗堿-H組)、艾司唑侖組,每組15只。大鼠在適應1 w后,開始進行實驗。小檗堿-(L、M、H)組分別灌胃30 mg/kg、60 mg/kg和120 mg/kg小檗堿〔9〕,對照組和SD組灌胃等量生理鹽水,艾司唑侖組灌胃0.1 mg/kg艾司唑侖〔10〕。所有組給藥均為1次/d,持續1 w。給藥完成后,除對照組外,其他各組通過平臺水環境法制備大鼠SD模型。將大鼠放置在四周環水的平臺上,平臺高出水面1 cm左右,水溫維持在22 ℃。大鼠站立在平臺上,這期間可自由飲食飲水,一旦進入睡眠,會因肌肉松弛掉入水中驚醒,如此反復多次,從而達到剝奪睡眠效果,模型構建持續72 h〔11〕。

1.4Morris水迷宮實驗 SD模型構建成功后,各組大鼠進行Morris水迷宮訓練。將大鼠按第Ⅰ～Ⅳ象限順序面壁放入水池,大鼠入水間隔20 min/次。設備自動記錄大鼠入水到成功找到平臺并停留3 s以上的時間,即逃避潛伏期。大鼠由入水到平臺停留時間設定為60 s,若超過60 s大鼠未能成功找到平臺,則將其引導至平臺,并在平臺停留10 s,其逃避潛伏期記為60 s。大鼠逃避潛伏期越短表示其認知能力及記憶鞏固能力越強。72 h后,大鼠進行末次實驗,作為最終逃避潛伏期。

1.5Y迷宮實驗 Y迷宮由3臂隔離分為Ⅰ區、Ⅱ區、Ⅲ區3個工作區。三臂交臂處定為隔離區。迷宮外壁均使用黑色膠紙密封。隨機選取任意一臂作為起始臂,擋住3臂末端,觀察8 min內大鼠進入3個工作區的情況,若連續3次進入不同區域,則記為正確,否則記為錯誤。行為正確率=正確次數/總檢測次數×100%。

1.6大鼠海馬組織中TNF-α、IL-6、IL-17、MDA、SOD和GSH-Px水平檢測 各組使用戊巴比妥鈉麻醉后,腹主動脈取血,離心后取血清放入-20 ℃備用。隨后將大鼠斷頭處死,各組10只大鼠取出海馬組織(5只用于TNF-α、IL-6、IL-17水平檢測,5只用于MDA、SOD、GSH-Px水平檢測),迅速放入液氮進行低溫保存。制備成組織勻漿后,分別使用TNF-α、IL-6、IL-17 ELISA檢測試劑盒和MDA、SOD、GSH-Px檢測試劑盒對海馬組織中TNF-α、IL-6、IL-17、MDA、SOD和GSH-Px水平進行檢測。操作步驟遵循試劑盒要求進行。

1.7大鼠血清中S100B和NSE水平檢測 取大鼠冷凍血清,解凍后,采用試劑盒對血清中S100B和NSE水平進行檢測。

1.8Western印跡大鼠海馬組織中NF-κB p-p65、COX-2及iNOS蛋白表達情況 各組剩余5只大鼠取出海馬組織,制備組織勻漿,使用蛋白提取試劑盒和二喹啉甲酸(BCA)蛋白濃度檢測試劑盒分別提取和檢測蛋白濃度,之后進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)、轉膜、封閉,加入NF-κB p-p65、COX-2、iNOS及β-actin(1∶2 000)抗體,4 ℃孵育過夜,孵育完成后添加Ⅱ抗IgG(1∶5 000)室溫避光孵育1 h,使用化學發光液使蛋白條帶顯影,ImageJ軟件分析蛋白條帶灰度值。

1.9統計學方法 采用SPSS22.0軟件進行t檢驗,方差分析和SNK-q檢驗。

2 結 果

2.1各組Morris水迷宮實驗的逃避潛伏期 與對照組比較,SD組逃避潛伏期明顯增加(P<0.05)。與SD組比較,小檗堿-L、M、H組和艾司唑侖組逃避潛伏期明顯降低(P<0.05),與小檗堿-L、M組比較,小檗堿-H組和艾司坐侖組逃避潛伏期明顯減短(P<0.05)。艾司唑侖組與小檗堿-H組逃避潛伏期比較無明顯差異(P>0.05)。見表1。

2.2各組Y迷宮實驗的行為正確率 與對照組比較,SD組行為正確率明顯降低(P<0.05)。與SD組比較,小檗堿-L、M、H組和艾司唑侖組行為正確率明顯升高(P<0.05),與小檗堿-L、M組比較,小檗堿-H組和艾司坐侖組行為正確率明顯升高(P<0.05)。艾司唑侖組與小檗堿-H組行為正確率比較無明顯差異(P>0.05)。見表1。

2.3各組血清中S100B和NSE水平 與對照組比較,SD組血清中S100B和NSE水平明顯升高(P<0.05)。與SD組比較,小檗堿-L、M、H組和艾司唑侖組S100B和NSE水平明顯降低(P<0.05),且小檗堿對大鼠血清中S100B和NSE水平的抑制作用具有一定劑量效應關系。艾司唑侖組與小檗堿-H組血清中S100B和NSE水平比較無明顯差異(P>0.05)。見表1。

2.4各組海馬組織NF-κB/iNOS-COX-2信號通路相關蛋白表達情況 與對照組比較,SD組海馬組織中NF-κB p-p65、iNOS和COX-2蛋白表達明顯增加(P<0.05)。與SD組比較,小檗堿-L、M、H組和艾司唑侖組NF-κB p-p65、iNOS和COX-2蛋白表達明顯降低(P<0.05),且小檗堿對大鼠海馬組織中NF-κB p-p65、iNOS和COX-2蛋白表達的抑制作用具有一定劑量效應關系。艾司唑侖組與小檗堿-H組海馬組織中NF-κB p-p65、iNOS和COX-2表達比較無明顯差異(P>0.05)。見表1、圖1。

表1 各組逃避潛伏期、行為正確率、血清中S100B和NSE水平、海馬組織中NF-κB p-p65、iNOS和COX-2蛋白表達

1～6:對照組、SD組、小檗堿-L組、小檗堿-M組、小檗堿-H組、艾司唑侖組圖1 各組NF-κB p-p65、iNOS和COX-2蛋白表達

2.5各組海馬組織中TNF-α、IL-6、IL-17、MDA、SOD和GSH-Px水平 與對照組比較,SD組海馬組織中TNF-α、IL-6、IL-17、MDA水平明顯升高,SOD、GSH-Px水平明顯降低(P<0.05)。與SD組比較,小檗堿-L、M、H組和艾司唑侖組海馬組織中TNF-α、IL-6、IL-17、MDA水平明顯降低,SOD、GSH-Px水平明顯升高(P<0.05),且小檗堿對大鼠海馬組織中上述指標作用效果具有一定劑量效應關系。艾司唑侖組與小檗堿-H組大鼠海馬組織中上述指標水平比較無明顯差異(P>0.05)。見表2。

表2 各組海馬組織中TNF-α、IL-6、IL-17、MDA、SOD、GSH-Px水平對比

3 討 論

快速睡眠持續剝奪24 h或72 h,會對認知功能和空間學習產生危害〔11〕。本研究結果提示,小檗堿干預對SD大鼠認知功能和空間學習有一定保護作用。SD能夠降低機體記憶力、引起大腦海馬組織出現炎癥反應和應激損傷〔12〕。TNF-α、IL-6是炎癥反應中較重要的兩種促炎因子,對炎癥反應發生、發展具有調控作用〔13〕。IL-17能夠激活包括NF-κB在內的多種炎癥信號通路,其在SD導致的炎癥反應中可能存在較重要的作用〔14〕。睡眠具有抗氧化應激作用,SD造成大腦氧化抗氧化失衡,從而導致腦損傷出現〔15〕。本研究結果提示,小檗堿能夠通過抑制促炎因子產生、提高抗氧化酶表達,抑制炎癥和氧化應激反應并減輕相應細胞和組織損傷。

S100B蛋白和NSE蛋白是診斷腦損傷嚴重程度的兩種主要指標,S100B蛋白主要在腦組織中存在,NSE蛋白主要在神經元、紅細胞中存在,當機體出現腦損傷時,S100B和NSE會被釋放到血液〔16〕。因而,當血液中S100B和NSE蛋白水平升高,表明機體腦微結構,如神經元、神經末梢等受到損傷,這與失眠和認知功能障礙存在一定因果關系〔17〕。本研究提示,小檗堿干預能夠降低S100B和NSE水平,對SD大鼠腦組織損傷產生一定保護作用。

SD會引起頭痛、頭昏、精神萎靡等情況,影響大腦正常認知功能〔18〕。NF-κB被證明在頭痛發病過程中起到重要作用,NF-κB本身及其調控的iNOS和COX-2兩條下游通路能夠誘導產生NO、前列腺素(PG)E2、TNF-α、IL-6等炎癥介質,引起細胞損傷,導致疼痛反應,促進炎癥、氧化應激反應發展〔19〕。韓宏亮等〔6〕研究發現,抑制NF-κB/iNOS-COX-2信號通路,可減少TNF-α等炎癥介質產生,減輕神經節衛星膠質細胞炎癥反應。本研究提示,小檗堿能夠下調NF-κB p-p65、iNOS和COX-2蛋白表達,其可能通過抑制NF-κB/iNOS-COX-2通路激活,減少炎癥介質產生,減輕炎癥和氧化應激反應,保護SD大鼠認知功能。

綜上,SD確實會降低大鼠認知功能,小檗堿干預對SD大鼠認知功能具有保護作用,且存在劑量效應關系。小檗堿對SD大鼠認知功能的保護作用可能與其降低NF-κB p-p65、iNOS和COX-2蛋白表達,抑制NF-κB/iNOS-COX-2信號通路激活,減少TNF-α等炎癥介質產生,上調抗氧化酶等有關。