POU6F2-AS2靶向miR-125b調(diào)控口腔鱗狀細(xì)胞癌增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移的機(jī)制

李婧 張發(fā)奎 鄧智元

(1青海大學(xué)附屬醫(yī)院口腔頜面外科,青海 西寧 810001;2中南大學(xué)湘雅口腔醫(yī)院口腔頜面外科)

口腔鱗狀細(xì)胞癌(OSCC)與頭、頸部鱗狀細(xì)胞癌,是世界上最常見(jiàn)的癌癥之一〔1〕。目前研究發(fā)現(xiàn),檳榔、煙草是導(dǎo)致OSCC發(fā)生的主要病因〔2〕,雖然OSCC的診斷和治療取得了較大進(jìn)步,但由于OSCC發(fā)病機(jī)制不明確,針對(duì)OSCC侵襲轉(zhuǎn)移及監(jiān)測(cè)復(fù)發(fā)的分子標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)缺乏,OSCC的5年生存率仍未得到明顯提高〔3〕。探究OSCC侵襲轉(zhuǎn)移過(guò)程的靶標(biāo)分子,對(duì)提高OSCC生存率具有潛在意義。近來(lái)研究發(fā)現(xiàn),微小RNA(miR)-125b能調(diào)節(jié)與遷移、侵襲、凋亡、增殖等致癌表型有關(guān)的一系列不同靶基因,參與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程〔4〕,且miR-125b在OSCC中表達(dá)下調(diào),與OSCC發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切〔5〕。另有研究報(bào)道,具有基因重組轉(zhuǎn)錄功能的新型長(zhǎng)鏈非編碼RNA(LncRNA)-POU6F2-AS2也參與OSCC發(fā)生發(fā)展過(guò)程〔6〕。但LncRNA-POU6F2-AS2調(diào)控OSCC的基因和途徑均不明確,其是否與miR-125b之間存在調(diào)控關(guān)系也不甚明確。本研究通過(guò)diana軟件預(yù)測(cè)到LncRNA-POU6F2-AS2與miR-125b有靶向結(jié)合位點(diǎn),對(duì)OSCC中LncRNA-POU6F2-AS2及miR-125b表達(dá)進(jìn)行干預(yù)表達(dá),并驗(yàn)證二者的關(guān)系,以期闡明LncRNA-POU6F2-AS2在OSCC中的靶向調(diào)控機(jī)制。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞來(lái)源及主要試劑與儀器 人正常口腔上皮細(xì)胞系(HOK,購(gòu)自上海冠導(dǎo)生物工程有限公司,貨號(hào):GD-C26719840);OSCC細(xì)胞系(CAL-27、TSCCa、Tca8113,均購(gòu)自上海細(xì)胞研究所,貨號(hào):MZ-1290、MZ-2347、MZ-1689);CCK-8試劑盒(購(gòu)自上海經(jīng)科化學(xué)科技有限公司,貨號(hào):CK04-2);Lipofectamine3000轉(zhuǎn)染試劑盒(購(gòu)自上海恒斐生物科技有限公司,貨號(hào):L3000-015);基質(zhì)膠(購(gòu)自上海晶抗生物工程有限公司,貨號(hào):JK-R5450);增殖標(biāo)記蛋白(Ki67)、E-鈣黏蛋白(cadherin)、Yes相關(guān)蛋白(YAP)、抗氧化蛋白質(zhì)(PRXL2)、類(lèi)胡蘿卜素2相關(guān)因子(NRF)2、鈣信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)因子(TACSTD)2等抗體(均購(gòu)自美國(guó)abcam公司,貨號(hào):ab16667、ab40772、ab56701、ab109118、ab89443、ab227689);實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)儀購(gòu)自西安天隆科技有限公司,型號(hào):L988);酶標(biāo)儀(購(gòu)自上海研卉生物科技有限公司,型號(hào):HBS-1096A);光學(xué)顯微鏡(購(gòu)自日本尼康,型號(hào):E100)。

1.2細(xì)胞培養(yǎng) HOK及OSCC細(xì)胞系(CAL-27、TSCCa、Tca8113)復(fù)蘇后,用RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)。

1.3qRT-PCR檢測(cè)LncRNA-POU6F2-AS2、miR-125b相對(duì)表達(dá)水平 提取OSCC細(xì)胞系(CAL-27、TSCCa、Tca8113)和HOK細(xì)胞總RNA,逆轉(zhuǎn)得到cDNA,進(jìn)行PCR,用2-ΔΔCt法計(jì)算LncRNA-POU6F2-AS2、miR-125b表達(dá)水平。引物序列(5′-3′):LncRNA-POU6F2-AS2正向:ACAGCAGTGCCAGAAGGAGT,反向:TTTGCAGACCTGAGCTTGTG;miR-125b正向:TCCCTGAGACCTAACTTGTG,反向:CTGAA-GCTTTCTGGCGATTC;U6正向:CTCGCTTCGGCAGCA,反向:AACGCTTCACGAATTTGCGT;β-actin正向:TCCCTGGAGAAGAGCTACGA,反向:AGCACTGTGTTGGCGTACAG。

1.4細(xì)胞轉(zhuǎn)染及分組處理 取CAL-27細(xì)胞按照5×104個(gè)/孔的密度接種于96孔板內(nèi),并分為空白對(duì)照組、LncRNA-POU6F2-AS2干擾載體(Si-POU6F2-AS2)組、LncRNA干擾陰性對(duì)照(Si-NC)組、miR-125b激動(dòng)劑(miR-125b-mimic)組、miR-125b激動(dòng)劑陰性對(duì)照(miR-125b-NC)組,每組6個(gè)復(fù)孔。用脂質(zhì)體法向CAL-27細(xì)胞轉(zhuǎn)染LncRNA-POU6F2-AS2干擾載體及其陰性對(duì)照載體,得到Si-POU6F2-AS2組及Si-NC組;向CAL-27細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-125b mimic及其陰性對(duì)照試劑,得到miR-125b-mimic組及miR-125b-NC組。轉(zhuǎn)染后24 h,取細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

1.5CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖活性 取轉(zhuǎn)染后24 h的各組細(xì)胞,加入CCK-8溶液10 μl后繼續(xù)培養(yǎng)2 h,檢測(cè)各組細(xì)胞的OD值,計(jì)算細(xì)胞存活率。

1.6Transwell小室法檢測(cè)細(xì)胞遷移侵襲能力 用不含10%胎牛血清的培養(yǎng)基重懸轉(zhuǎn)染后24 h的各組細(xì)胞,將100 μl細(xì)胞懸液加入上室(侵襲檢測(cè)時(shí)預(yù)鋪基質(zhì)膠),下室加入500 μl培養(yǎng)液(含10%胎牛血清)孵育24 h后,用4%多聚甲醛固定細(xì)胞,并用結(jié)晶紫染色后,于光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行計(jì)數(shù)。

1.7RT-qPCR檢測(cè)LncRNA-POU6F2-AS2、miR-125b的相對(duì)表達(dá) 取1.4中轉(zhuǎn)染24 h后的各組細(xì)胞,提取總RNA,按1.3中檢測(cè)方法,檢測(cè)各組細(xì)胞LncRNA-POU6F2-AS2、miR-125b表達(dá)水平。

1.8Western印跡檢測(cè)各組細(xì)胞Ki67、E-cadherin、YAP、PRXL2、NRF2、TACSTD2蛋白表達(dá)1.4中提取各組細(xì)胞總蛋白并檢測(cè)蛋白濃度后,凝膠電泳分離蛋白樣品并轉(zhuǎn)膜,脫脂奶粉封閉4 h后,4 ℃下與一抗(Ki67、E-cadherin、YAP、PRXL2、NRF2、TACSTD2抗體,均為1∶1 000,GAPDH 1∶2 000)孵育過(guò)夜,加二抗(1∶5 000)于室溫下孵育3 h。顯影,用化學(xué)發(fā)光成像分析系統(tǒng)拍照并分析灰度值。

1.9共轉(zhuǎn)染Si-POU6F2-AS2與miR-125b-inhibitor后對(duì)細(xì)胞Ki67、E-cadherin、YAP蛋白相對(duì)表達(dá)水平檢測(cè) 取CAL-27細(xì)胞系,以5×104個(gè)/孔的密度接種于96孔板內(nèi),將Si-POU6F2-AS2與miR-125b-inhibitor及其陰性對(duì)照試劑共轉(zhuǎn)染,并分為Si-NC+miR-125b-NC組、Si-NC+miR-125b-inhibitor組、Si-POU6F2-AS2+miR-125b-NC組、Si-POU6F2-AS2+miR-125b-inhibitor組及未轉(zhuǎn)染組(空白對(duì)照組),每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔。Si-POU6F2-AS2+miR-125b-inhibitor組用Lipofectamine3000轉(zhuǎn)染試劑盒分別轉(zhuǎn)染Si-POU6F2-AS2和miR-125b-inhibitor;Si-POU6F2-AS2+miR-125b-NC組轉(zhuǎn)染Si-POU6F2-AS2和miR-125b-NC;Si-NC+miR-125b-inhibitor組轉(zhuǎn)染Si-NC和miR-125b-inhibitor;Si-POU6F2-AS2+miR-125b-NC組轉(zhuǎn)染Si-POU6F2-AS2和miR-125b-NC;空白對(duì)照組不做任何處理;各轉(zhuǎn)染組均按轉(zhuǎn)染試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。各組轉(zhuǎn)染后24 h,取細(xì)胞用1.8中方法檢測(cè)各組細(xì)胞Ki67、E-cadherin、YAP蛋白相對(duì)表達(dá)水平。

1.10統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS24.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)、單因素方差分析、SNK-q檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1不同細(xì)胞系中LncRNA-POU6F2-AS2及miR-125b表達(dá) 與正常口腔上皮細(xì)胞系(HOK)相比,OSCC細(xì)胞系(CAL-27、TSCCa、Tca8113)中LncRNA-POU6F2-AS2表達(dá)明顯升高,miR-125b表達(dá)明顯降低(P<0.05),其中 CAL-27細(xì)胞系LncRNA-POU6F2-AS2表達(dá)最高,miR-125b表達(dá)最低,見(jiàn)表1。

表1 不同細(xì)胞系中LncRNA-POU6F2-AS2及miR-125b表達(dá)比較

2.2抑制LncRNA-POU6F2-AS2或激活miR-125b表達(dá)對(duì)細(xì)胞LncRNA-POU6F2-AS2及miR-125b蛋白表達(dá)的影響 與空白對(duì)照組比較,Si-POU6F2-AS2組、miR-125b-mimic組細(xì)胞LncRNA-POU6F2-AS2表達(dá)降低,miR-125b表達(dá)升高(P<0.05),見(jiàn)表2。

2.3抑制LncRNA-POU6F2-AS2或激活miR-125b表達(dá)對(duì)細(xì)胞增殖活性的影響 與空白對(duì)照組比較,Si-POU6F2-AS2組及miR-125b-mimic組細(xì)胞增殖活性明顯降低(P<0.05),見(jiàn)表2。

2.4抑制LncRNA-POU6F2-AS2或激活miR-125b表達(dá)對(duì)細(xì)胞侵襲遷移能力的影響 與空白對(duì)照組比較,Si-POU6F2-AS2組及miR-125b-mimic組細(xì)胞侵襲遷移能力明顯降低(P<0.05),見(jiàn)表2、圖1。

2.5抑制LncRNA-POU6F2-AS2或激活miR-125b表達(dá)對(duì)細(xì)胞Ki67、E-cadherin、YAP、PRXL2、NRF2、TACSTD2蛋白表達(dá)的影響 與空白對(duì)照組比較,Si-POU6F2-AS2組及miR-125b-mimic組細(xì)胞Ki67、YAP、PRXL2、NRF2、TACSTD2蛋白表達(dá)明顯降低,E-cadherin蛋白表達(dá)明顯升高(P<0.05),Si-NC組及miR-125b-NC組上述指標(biāo)與空白對(duì)照組相比,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),見(jiàn)表2、圖2、表3。

表2 各組細(xì)胞中LncRNA-POU6F2-AS2和miR-125b表達(dá)、細(xì)胞增殖活性、侵襲、遷移能力及Ki67、E-cadherin、YAP蛋白表達(dá)比較

圖1 各組空白細(xì)胞遷移及侵襲(結(jié)晶紫染色,×200)

1～5:空白對(duì)照組、Si-NC組、miR-125b-NC組、Si-POU6F2-AS2組、miR-125b-mimic組圖2 各組細(xì)胞Ki67、E-cadherin、YAP、PRXL2、NRF2、TACSTD2蛋白表達(dá)

2.6共轉(zhuǎn)染Si-POU6F2-AS2與miR-125b-inhibitor對(duì)細(xì)胞Ki67、E-cadherin、YAP蛋白相對(duì)表達(dá)水平的影響 與空白對(duì)照組比較,Si-NC+miR-125b-inhibitor組細(xì)胞Ki67、YAP蛋白表達(dá)明顯升高,E-cadherin表達(dá)明顯降低(P<0.05);Si-POU6F2-AS2+miR-125b-NC組細(xì)胞Ki67、YAP蛋白表達(dá)明顯降低,E-cadherin表達(dá)明顯升高(P<0.05)。與Si-POU6F2-AS2+miR-125b-NC組相比,Si-POU6F2-AS2+miR-125b-inhibitor組細(xì)胞Ki67、YAP蛋白表達(dá)明顯升高,E-cadherin表達(dá)明顯降低(P<0.05),見(jiàn)圖3、表4。

表3 各組細(xì)胞中PRXL2、NRF2、TACSTD2蛋白表達(dá)水平比較

1～5:空白對(duì)照組、Si-NC+miR-125b-NC組、Si-NC+miR-125b-inhibitor組、Si-POU6F2-AS2+miR-125b-NC組、Si-POU6F2-AS2+miR-125b-inhibitor組圖3 各組細(xì)胞Ki67、E-cadherin、YAP蛋白表達(dá)

表4 各組細(xì)胞中Ki67、E-cadherin、YAP蛋白表達(dá)水平比較

3 討 論

OSCC是常見(jiàn)的口腔癌類(lèi)型,占全球所有惡性腫瘤的近3%〔7〕,其進(jìn)展緩慢,但通常確診時(shí)已為晚期〔8〕。故闡明OSCC發(fā)生和發(fā)展的分子機(jī)制對(duì)OSCC的診斷治療及預(yù)后檢測(cè)具有重要意義。Xu等〔9〕研究發(fā)現(xiàn),LncRNA-POU6F2-AS2在結(jié)腸癌中呈高表達(dá),并能通過(guò)抑制miR-377表達(dá)促進(jìn)結(jié)腸癌的增殖、侵襲遷移過(guò)程。李理等〔10〕研究發(fā)現(xiàn),LncRNA-POU6F2-AS2在胃癌組織中高表達(dá),且其表達(dá)與胃癌患者腫瘤分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及生存預(yù)后關(guān)系密切。Liu等〔6〕首次提出,LncRNA-POU6F2-AS2通過(guò)調(diào)控DNA修復(fù)參與OSCC病理過(guò)程,但其調(diào)控機(jī)制不明。本研究結(jié)果提示,LncRNA-POU6F2-AS2與OSCC增殖、侵襲及遷移等惡性生物學(xué)關(guān)系密切,但其調(diào)控的分子機(jī)制還不甚明確。另外,研究證實(shí),OSCC發(fā)展過(guò)程中,細(xì)胞膜上E-cadherin及胞間連接復(fù)合物不斷被水解,可使細(xì)胞間黏附能力下降,腫瘤細(xì)胞易發(fā)生侵襲和轉(zhuǎn)移〔11〕;轉(zhuǎn)錄共激活因子YAP與E-cadherin表達(dá)呈負(fù)相關(guān),可與Smad蛋白家族結(jié)合,通過(guò)激活轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF)-β的釋放與分泌,促進(jìn)細(xì)胞脫黏附、運(yùn)動(dòng)遷移能力,導(dǎo)致OSCC增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移能力增強(qiáng)〔12〕。本研究表明,抑制OSCC中LncRNA-POU6F2-AS2表達(dá),可抑制細(xì)胞增殖、侵襲、遷移能力,緩解其惡性生物學(xué)進(jìn)程。但LncRNA-POU6F2-AS2的靶向調(diào)控機(jī)制,還需進(jìn)一步研究。

研究證實(shí),microRNA的異常降解參與OSCC的發(fā)生發(fā)展過(guò)程,且對(duì)OSCC的臨床診斷、治療及預(yù)后檢測(cè)有著重要的作用〔13〕,其中miR-125家族成員參與各種癌細(xì)胞的細(xì)胞分化、增殖、轉(zhuǎn)移、凋亡和免疫防御等生物學(xué)過(guò)程〔14〕。miR-125b為miR-125家族成員之一,由染色體11q23及21q21基因轉(zhuǎn)錄而來(lái),并參與調(diào)節(jié)與遷移、侵襲、凋亡、增殖等致癌表型有關(guān)的不同靶基因表達(dá)來(lái)調(diào)控多種腫瘤生物學(xué)過(guò)程〔15〕。Pei等〔16〕發(fā)現(xiàn),miR-125b和E-cadherin減少與人類(lèi)轉(zhuǎn)移性黑色素瘤發(fā)生關(guān)系密切,且miR-125 b能夠通過(guò)干擾抑制黏著斑激酶(FAK)表達(dá),上調(diào)E-cadherin表達(dá),抑制癌細(xì)胞的侵襲、遷移過(guò)程;Lu等〔17〕發(fā)現(xiàn),miR-125b可直接綁定到長(zhǎng)鏈非編碼LncRNA-PICSAR上,并通過(guò)抑制YAP1的表達(dá)而發(fā)揮減毒和抗癌作用,證實(shí)miR-125b在腫瘤生長(zhǎng)及侵襲遷移過(guò)程發(fā)揮重要的監(jiān)管作用。研究發(fā)現(xiàn),miR-125b在OSCC發(fā)生發(fā)展過(guò)程中也扮演重要的角色〔18〕,Nakanishi等〔19〕發(fā)現(xiàn),miR-125b低表達(dá)OSCC患者總體生存率降低,可能與其可靶向上調(diào)TACSTD2蛋白表達(dá),促進(jìn)口腔上皮細(xì)胞侵襲遷移及腫瘤集落的形成,進(jìn)而促進(jìn)OSCC患者腫瘤轉(zhuǎn)移有關(guān)。Chen等〔20〕發(fā)現(xiàn),miR-125b表達(dá)下調(diào)與OSCC預(yù)后不良關(guān)系密切,且miR-125b能通過(guò)靶向抑制PRXL2-NRF2信號(hào)軸的激活,促進(jìn)腫瘤氧化應(yīng)激反應(yīng),進(jìn)而抑制OSCC的侵襲與遷移。本研究結(jié)果與文獻(xiàn)〔19,20〕結(jié)果一致,提示過(guò)表達(dá)miR-125b表達(dá)可抑制其靶標(biāo)分子TACSTD2及PRXL2-NRF2信號(hào)軸的激活,抑制OSCC的增殖、侵襲遷移過(guò)程。但miR-125b的異常轉(zhuǎn)錄也受長(zhǎng)鏈非編碼基因的調(diào)控〔5〕,Yang等〔21〕研究證實(shí),LncRNA-POU6F2-AS2可通過(guò)靶向下調(diào)miR-125b表達(dá)加重非小細(xì)胞肺癌的致癌性;進(jìn)一步分析提示,miR-125b-inhibitor能逆轉(zhuǎn)LncRNA-POU6F2-AS2低表達(dá)對(duì)OSCC的增殖、侵襲遷移的抑制作用。

綜上,敲低Lnc RNA-POU6F2-AS2可能通過(guò)上調(diào)miR-125b表達(dá)抑制OSCC細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為,但LncRNA-POU6F2-AS2在OSCC中的調(diào)控機(jī)制有待進(jìn)一步探究。