基于BMP2/Smad4信號通路探究蛇床子素對骨質疏松性骨折大鼠愈合過程的影響

黃鑫 吳永光 王炯

(華中科技大學協和江北醫院骨科,湖北 武漢 430100)

骨質疏松性骨折(OPF)由骨質疏松(OP)癥患者骨微結構退化和骨量減少所引起OP并發癥,常發生于老年人群〔1〕。盡管臨床中通過使用雌激素替代療法來降低OPF的發生風險,但雌激素的長期使用會導致多種婦科疾病的發生,因此迫切需要尋找新型替代藥物〔2〕。蛇床子素是一種從蛇床子中提取的具有藥理作用的活性成分,已有多項研究表明其可刺激骨形成及成骨細胞分化,有效改善OP〔3〕,除此之外,其在股骨橫向骨折小鼠的骨折修復中具有明顯的促進作用〔4〕。骨形態發生蛋白(BMP)2/Smad4信號通路在骨相關疾病中具有廣泛的研究,激活該通路可促進老年OPF骨折愈合能力〔1〕。有報道稱,蛇床子素可通過激活BMP2/Smad信號通路促進骨髓間充質干細胞(BMSCs)成骨分化〔5〕,但關于蛇床子素調控BMP2/Smad4信號通路改善OPF的相關體內研究報道還未發現。本研究基于BMP2/Smad4信號通路探究蛇床子素對OPF大鼠愈合過程的影響。

1 材料與方法

1.1實驗動物 將90只從濟南朋悅實驗動物繁育有限公司購買的雌性SD大鼠(體質量270～310 g,SPF級)飼養于濕度及溫度適宜、12 h/12 h晝夜周期的環境,許可證:SCXK(魯)2019 0003。

1.2試劑和儀器 蛇床子素(CFN98765,武漢中標科技有限公司);兔抗Runt相關轉錄因子(RUNX)2、Smad4、β-actin抗體(12556、38454、4970,Cell Signaling Technology);兔抗BMP2抗體(18933-1-AP,Proteintech);兔抗成骨細胞特異性轉錄因子(Osterix)抗體、Goat Anti-Rabbit IgG H&L辣根過氧化物酶(HRP,ab209484、ab6721,Abcam);蘇木素-伊紅(HE)染色試劑盒(G1120-100,北京祥生興業科技有限公司);二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量試劑盒(WLA004a,沈陽萬類生物科技有限公司);抗酒石酸酸性磷酸酶(TRACP)ELISA試劑盒(E02T0537,上海藍基生物科技有限公司);堿性磷酸酶(ALP)試劑盒(LCS36163,廈門侖昌碩生物科技有限公司);shRNA及shRNA-BMP2重組慢病毒由上海基因醫藥合成;Dexa Pro-I雙能X線骨密度儀、LCT200 Micro-CT儀、EnVision?多功能酶標儀〔匯佳生物股份(中國)有限公司〕。

1.3分組與OPF大鼠模型建立 隨機選取15只大鼠作假手術(Sham)組,其余大鼠進行OPF模型建立:腹腔注射30 mg/kg 戊巴比妥鈉(3%)將大鼠麻醉后從腰背側開口切除雙側卵巢以建立OP大鼠模型,Sham組切除卵巢旁等體積的脂肪組織,術后連續3 d肌肉注射80×104U青霉素以防止感染,6 w后通過X射線測定大鼠BMD,BMD于造模前相比顯著低則建立成功,在OP造模成功后麻醉全部大鼠,于右側大腿外側開口以暴露股骨,線鋸橫向將股骨鋸斷后使用克氏針固定斷端,縫合切口后注射青霉素以防止感染〔6〕;將OP大鼠分為OPF組、低劑量組(10 mg/kg蛇床子素)、高劑量組(20 mg/kg蛇床子素)〔7〕、高劑量+NC組(2 μl shRNA)、高劑量+shRNA-BMP2組(2 μl shRNA-BMP2),15只/組,除Sham組及OPF組外其余組灌胃相應劑量蛇床子素,而OPF組及Sham組則灌胃等量的生理鹽水,高劑量+NC組、高劑量+shRNA-BMP2組在灌胃第1天于尾靜脈注射2 μl相應劑量慢病毒,其余組則注射等量生理鹽水,灌胃8 w(1次/d)后備用。

1.4骨痂部位BMD檢測 在OP模型構建后及灌胃結束后分別麻醉各組大鼠,以骨痂為中心使用雙能X線BMD儀檢測骨痂BMD(掃描模式:速度:60 mm/s,分辨率:1 mm×1 mm)。

1.5血清骨代謝指標TRACP和ALP水平檢測 于大鼠腹主動脈血抽取3 ml血液后靜置0.5 h,經過3 000 r/min離心(10 min)后分離出血清并使用試劑盒檢測血清TRACP和ALP水平。

1.6三點彎曲實驗進行股骨生物力學性能檢測 每組隨機選取5只大鼠,分離右側股骨去除周圍的軟組織后取出克氏針,將股骨放置到生物力學試驗儀器上,以中點作加壓點,2 mm/min加載速度施壓到股骨斷裂,并通過計算機計算最大載荷、剛度。

1.7Micro-CT掃描股骨骨痂 每組另外取5只大鼠右側股骨,使用Micro-CT以股骨骨折處為中心掃描,CT-Analyser軟件分析骨痂的骨小梁分離度(Tb.Sp)、骨小梁數量(Tb.N)、骨體積分數(BV/TV,骨體積/組織體積)、骨小梁厚度(Tb.Th)。

1.8HE染色觀察大鼠骨痂組織形態 取顯微掃描后的股骨骨痂組織,放入多聚甲醛中固定2 d后使用硝酸溶液中(8%)脫鈣6 w后制作成石蠟切片(4 μm),使用二甲苯進行2次脫蠟及水化,HE染色后封片,光鏡下選取5個視野觀察(×200)。

1.9Western印跡檢測骨痂組織Osterix、RUNX2及BMP2/Smad4通路蛋白表達 取每組剩余大鼠股骨骨痂組織,使用裂解液將組織裂解后提取其中的總蛋白,BCA法定量所得蛋白濃度,每組以40 μg蛋白樣品上樣,通過十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)對蛋白進行分離并轉移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上,使用牛血清白蛋白將膜進行1 h的封閉,兔抗RUNX2、BMP2、Smad4、Osterix、β-actin抗體(1∶1 000)孵育過夜后進行2 h的二抗(HRP標記的山羊抗兔IgG,1∶5 000)孵育,經TBST洗膜后滴加1 ml ECL化學發光試劑進行顯色,凝膠成像儀曝光并觀察,測定RUNX2、BMP2、Smad4、Osterix、β-actin灰度值,計算各蛋白水平(n=5)。

1.10統計學方法 采用SPSS20.0軟件進行方差分析,兩組間采用SNK-q檢驗。

2 結 果

2.1蛇床子素對大鼠股骨骨痂BMD影響 與Sham組比較〔(0.268±0.032)g/cm2〕,OPF組股骨骨痂BMD〔(0.126±0.020)g/cm2〕顯著減小(P<0.05);與OPF組比較,低、高劑量組BMD依次顯著升高〔(0.164±0.024)、(0.201±0.022)g/cm2,P<0.05〕;與高劑量組比較,高劑量+NC組BMD無明顯變化〔(0.202±0.023)g/cm2,P>0.05〕,高劑量+shRNA-BMP2組BMD顯著減小〔(0.140±0.020)g/cm2,P<0.05〕。

2.2蛇床子素對大鼠血清TRACP和ALP水平的影響 與Sham組比較,OPF組血清TRACP顯著升高,ALP水平顯著降低(P<0.05);與OPF組比較,低、高劑量組TRACP水平依次顯著降低,ALP水平顯著升高(P<0.05);與高劑量組比較,高劑量+NC組TRACP和ALP水平無明顯變化(P>0.05),高劑量+shRNA-BMP2組TRACP水平顯著升高,ALP水平顯著降低(P<0.05),見表1。

2.3蛇床子素對大鼠生物力學性能的影響 與Sham組比較,OPF組股骨剛度及最大載荷顯著減小(P<0.05);與OPF組比較,低、高劑量組剛度及最大載荷顯著增大(P<0.05);相較于高劑量組,高劑量+NC組剛度及最大載荷無明顯變化(P>0.05),高劑量+shRNA-BMP2組剛度及最大載荷顯著減小(P<0.05),見表1。

2.4蛇床子素對大鼠骨折愈合相關指標的影響 與Sham組比較,OPF組BV/TV、Tb.Th、Tb.N顯著減小,Tb.Sp顯著增大(P<0.05);與OPF組比較,低、高劑量組BV/TV、Tb.Th、Tb.N顯著增大,Tb.Sp顯著減小(P<0.05);與高劑量組比較,高劑量+NC組BV/TV、Tb.Th、Tb.N、Tb.Sp無明顯變化(P>0.05),高劑量+shRNA-BMP2組BV/TV、Tb.Th、Tb.N顯著減小,Tb.Sp顯著增大(P<0.05),見表1、圖1。

表1 各組血清TRACP、ALP水平、生物學性能、骨折愈合相關指標

圖1 各組股骨顯微CT切面

2.5骨痂組織形態學觀察 Sham組大量形成骨小梁,相互交織成網狀,排列緊密且厚度均勻;OPF組骨小梁細薄且顯著減少,缺乏連接且稀疏排列,成骨細胞少;與OPF組比較,低、高劑量組、高劑量+NC組骨小梁明顯增粗且數目增多,相互交織成網狀且間隙較小、成骨細胞的數量存在不同程度增多;與高劑量組比較,高劑量+shRNA-BMP2組上股骨愈合程度減慢,見圖2。

圖2 各組骨痂組織形態(HE染色,×200)

2.6蛇床子素對骨痂組織RUNX2、Osterix表達的影響 與Sham組比較,OPF組骨痂組織RUNX2、Osterix表達顯著降低(P<0.05);與OPF組比較,低、高劑量組RUNX2、Osterix表達顯著升高(P<0.05);與高劑量組比較,高劑量+NC組RUNX2、Osterix表達無明顯變化(P>0.05),高劑量+shRNA-BMP2組RUNX2、Osterix表達顯著降低(P<0.05),見表2、圖3。

2.7蛇床子素對骨痂組織BMP2、Smad4表達的影響 與Sham組比較,OPF組骨痂組織BMP2、Smad4表達顯著降低(P<0.05);與OPF組比較,低、高劑量組BMP2、Smad4表達顯著升高(P<0.05);與高劑量組比較,高劑量+NC組BMP2、Smad4表達無明顯變化(P>0.05),高劑量+shRNA-BMP2組BMP2、Smad4表達顯著降低(P<0.05),見圖3、表3。

表2 各組骨痂組織RUNX2、Osterix表達

1～6:Sham組,OPF組,低劑量組,高劑量組,高劑量+NC組,高劑量+shRNA-BMP2組圖3 蛇床子素對骨痂組織RUNX2、Osterix、BMP2、Smad4表達的影響

表3 各組骨痂組織BMP2、Smad4表達

3 討 論

OP患者由于骨骼退化或骨量減少造成骨骼脆性增加,從而導致OPF的發生,近年來OPF發生率不僅有所增加,還逐漸趨于年輕化〔8〕。目前,基于OPF的藥物治療集中于抑制破骨細胞功能或促進成骨上,而目前關于促進OPF患者愈合方面的抗OP藥物選擇性有限。因此,迫切需要尋找促進OPF愈合的新型藥物〔9〕。

傳統中草藥對各種疾病的預防及治療效果極佳,蛇床子素是從傘形科植物蛇床子中提取的有效活性成分,在OP治療中具有很大的潛能〔10,11〕。蛇床子素通過激活cAMP/CREB信號途徑來提高成骨相關因子Osterix表達,以此增強股骨骨折小鼠骨強度及促進骨折修復〔12〕。蛇床子素可抑制核因子κB受體活化因子配體(RANKL)所誘導的破骨細胞生成,以防止卵巢切除大鼠的骨質流失〔13〕。蛇床子素通過促進軟骨細胞BMP-2和成骨標志物骨鈣素(OCN)的表達來促進軟骨內骨化,加速股骨開放性骨折小鼠骨融合及骨折修復〔4〕。本研究結果表明蛇床子素可顯著改善OPF大鼠OP,增加生物力學強度,促進骨折愈合。

BMP在骨骼的發育、生長及骨折修復中均具有重要作用,BMP2作為其家族重要成員,參與骨骼的發育及組織構建,BMP2表達障礙患者易發生骨骼病及骨折〔1,14,15〕。BMP與其受體結合后可激活Smad途徑,Smad4作為該途徑中的信號分子已被證實通過在成骨及破骨細胞發育和功能中起到重要作用而參與調節骨代謝〔1,15〕。研究發現,Smad與RUNX2可通過相互作用共同參與調控成骨細胞的分化及表型基因表達〔8〕。miR-330-5p低表達可通過激活雙糖鏈蛋白聚糖介導的BMP/Smad通路來抑制OP小鼠骨質流失〔16〕。蛙卵蛋白水解物可通過上調TGFβ/BMP2通路蛋白BMP2、Smad4表達增加OP大鼠Tb.Th,降低骨折風險〔17〕。雷奈酸鍶可有效提高BMP-2和骨力學性能,加快OPF大鼠愈合期進程〔18〕。蛇床子素可通過激活雌激素-α/BMP-2/Smad通路體改OP大鼠生物力學特性及BMD,以此防治骨質流失,起到抗OP的作用〔19〕。本研究結果表明,蛇床子素在OPF大鼠中可激活BMP2/Smad4,與前人研究結果相似〔19〕。除此之外,本研究還發現,BMP2沉默表達可逆轉蛇床子素對OPF大鼠OP的改善及骨折的愈合,該結果表明,蛇床子素可能通過激活BMP2/Smad4通路來促進OPF大鼠骨折處愈合。

綜上,蛇床子素通過激活BMP2/Smad4信號通路來促進OPF大鼠的骨折處愈合。本研究不僅為OPF治療新藥的尋找提供參考,還可為臨床中蛇床子素在OP及骨折中的應用提供參考。目前,本研究缺乏蛇床子素在OPF中更深層次的機制探討,因此,這將成為接下來的首要研究內容。