發酵蒲公英黃酮的安全性評價及對斑馬魚心臟毒性的保護作用

摘 要 以斑馬魚為模型，評價發酵蒲公英黃酮（Fermented Dandelion Flavonoids，FDF）的發育毒性并探討其是否對特非那定引起的心臟毒性具有保護作用。采用不同濃度（50、100、150、200、250、300、350 μg·mL-1）的FDF處理受精后7～9 hpf（hours post fertilization）的斑馬魚胚胎至96 hpf，顯微鏡下觀察其發育情況， 24 hpf時記錄胚胎自主運動頻率，仔魚孵出后記錄心率、拍照測量體長、卵黃囊體積并統計孵化率，評估FDF對斑馬魚胚胎發育的影響；選擇24 hpf的斑馬魚胚胎，設置對照組、溶劑對照組（DMSO）、模型組（1.5 μg·mL-1特非那定）、FDF組（10、25、50、100 μg·mL-1）、特非那定（1.5 μg·mL-1）+FDF（10、25、50、100 μg·mL-1）組，記錄48 hpf初孵仔魚心率、拍照測量靜脈竇-動脈球（SV-BA）距離，探究FDF是否對特非那定誘導的斑馬魚心臟毒性具有保護作用。結果：與對照組相比，50～200 μg·mL-1的FDF處理可促進斑馬魚胚胎發育，高于250 μg·mL-1 FDF組孵化率顯著降低（p＜0.05），胚胎發育受到抑制，350 μg·mL-1孵化率為0； FDF暴露后胚胎自主運動頻率顯著降低（p＜0.05）；72 hpf時，FDF 濃度高于50 μg·mL-1使斑馬魚仔魚卵黃囊體積極顯著增大（p＜0.01），當FDF濃度在100 μg·mL-1以上時斑馬魚仔魚體長極顯著降低（p＜0.01），250 μg·mL-1的FDF導致斑馬魚心率顯著降低（p＜0.05）。建立特非那定誘導斑馬魚心臟毒性模型后觀察到：48 hpf時，與對照組相比，高于10 μg·mL-1的FDF暴露使斑馬魚心率顯著升高（p＜0.05），添加特非那定后斑馬魚心率極顯著降低（p＜0.01），SV-BA距離極顯著升高（p＜0.01），表明模型建立成功。與特非那定組相比，10～100 μg·mL-1 FDF預暴露對斑馬魚心率和SV-BA距離均無顯著影響，但25 μg·mL-1 FDF預暴露組對特非那定引起的心率降低有緩解趨勢。研究表明，低濃度（≤100 μg·mL-1）FDF暴露可促進斑馬魚胚胎發育，對斑馬魚無毒性；高濃度（≥250 μg·mL-1）FDF有輕微的心臟毒性，抑制胚胎發育并降低孵化率；FDF對特非那定誘導的斑馬魚心臟毒性具有一定的緩解作用。

關鍵詞 發酵蒲公英；黃酮；斑馬魚；特非那定；安全性評價；胚胎發育；心臟毒性

中圖分類號：Q955 文獻標志碼：A DOI：10.19415/j.cnki.1673-890x.2024.23.001

中草藥是以植物為主的藥材，含有豐富的蛋白質、多糖、黃酮類等活性物質。研究發現，在利用中草藥時，其活性物質存在轉化利用率較低、藥效不足、毒副作用大等問題[1]。微生物發酵是傳統中草藥加工炮制的方法之一，是利用微生物豐富的酶系對中草藥的藥物成分和毒性成分進行分解轉化，從而達到提高中草藥生物活性物質利用率并降低其毒副作用的目的[2]。在禁抗背景下，中草藥因發酵后其生物活性成分含量增加、毒性降低、無藥物殘留，已成為高效的抗生素替代產品廣泛應用到動物生產中。

蒲公英（Taraxacum mongolicum Hand.-Mazz.）為菊科蒲英屬多年生草本植物，在亞洲、歐洲和北美均有分布，具有很強的適應性，在我國也有豐富的資源[3]。蒲公英含有黃酮類、多糖類、酚酸類、植物甾醇類、萜類等生物活性物質[4]，黃酮類化合物是其主要的有效成分之一。近年來，有關中藥黃酮的提取及在動物上的應用研究的報道很多，如信盼等研究顯示香蘭青的總黃酮可通過抑制炎癥反應和干預TGFβ1/Smad信號通路的轉導發揮抗動脈粥樣硬化的作用[5]；何偉平等對蕎麥花葉總黃酮的研究發現其可抑制Wnt/β-catenin通路激活，減輕心律失常大鼠心肌組織氧化應激及炎癥損傷，改善大鼠心律失常癥狀[6]；譚瑩等發現豆蔻素可通過Nrf2-NF-κ b介導的機制有效地保護Lps誘導的心臟損傷[7]；本實驗室前期研究發現通過益生菌發酵后的蒲公英黃酮含量顯著升高，體內外抗氧化活性和體外抑菌活性均顯著增強[8-9]。牛瑞萍研究也顯示，與添加抗生素的飼料組相比，添加發酵蒲公英的飼料可使肉雞的免疫功能增強，表明發酵蒲公英可作為抗生素代替品應用于飼料中[10]。同時很多中草藥黃酮藥物已被商業化生產，廣泛應用到動物養殖中[11]。中草藥雖然被認為藥效好、安全性高、副作用小，但隨著其在人類健康和動物生產中的廣泛應用，一些安全性問題也隨之出現[12]。因此，中草藥及其產品的安全性評價對高效利用中草藥有著重要意義。

斑馬魚是一種新型模式生物。研究發現，藥物暴露能夠引起斑馬魚出現與哺乳動物類似的生理反應和病理響應[13]，且與哺乳動物相比，實驗成本相對較低，具有胚胎透明、體外發育、繁殖力強等優勢，已被逐漸應用于中藥安全性評價[14-16]。中藥成分復雜、毒性靶器官不明確，以斑馬魚胚胎作為實驗動物能對發育毒性進行準確、快速評價[17-18]。雖然蒲公英自古以來被作為一種藥食同源的中草藥廣泛應用于人類及動物上[19-20]，但目前對蒲公英的安全性評估研究較少，而關于發酵蒲公英黃酮對動物組織器官是否具有毒性的研究報道目前尚未出現。本研究以斑馬魚胚胎為實驗對象，分析發酵蒲公英黃酮對其胚胎發育的影響，評價其安全性，同時探討發酵蒲公英黃酮預暴露是否對特非那定誘導斑馬魚心臟毒性具有保護作用，為蒲公英的深度開發利用及在動物生產中的安全應用提供參考依據。

1" 材料與方法

1.1" 試驗材料

1.1.1" 供試動物

本試驗所用斑馬魚成魚購于國家斑馬魚中心，為野生型AB，養殖于斑馬魚循環水養殖系統，每日投喂斑馬魚飼料和初孵豐年蝦各2次，養殖過程中控制光暗周期（14 h/10 h）、水溫（28.5±1 ℃），飼喂后清除殘餌、糞便。在實驗前1 d取健康性成熟的雌雄斑馬魚按1∶2的比例分別放入孵化缸內，用隔板分開，次日取掉隔板將雌雄魚混合，1 h后收集受精卵，清洗后放于恒溫培養箱（28.5±1 ℃）中培養，以備使用。

1.1.2" 主要試劑和儀器

標準品特非那定（Sigma公司）、標準品二甲基亞砜DMSO（國藥集團）；顯微鏡BX53、體式顯微鏡SZX2-ILLTQ；斑馬魚養殖飼養系統（上海海圣生物科技有限公司）；SPX-280B-G 型光照培養箱（中國上海基星生物科技有限公司）。

1.2" 試驗方法

1.2.1" 蒲公英的發酵及黃酮的提取

蒲公英的發酵和黃酮的提取參照任雪榮的方法[8]進行，即將釀酒酵母、植物乳桿菌按7∶3的比例混合發酵蒲公英，其接菌量為10%，發酵料液比為1∶1.2，再加入0.5%的酵母膏作為輔料并在37 ℃條件下發酵50 h，制備發酵蒲公英。

采用水提、醇沉的方法獲得蒲公英黃酮，將發酵蒲公英在45 ℃烘箱中烘干水分，再將其粉碎，按料液比1∶20，溫度80 ℃，時間30 min進行水提，獲得發酵蒲公英水提物。將蒲公英水提物在5 000 r·min-1條件下離心10 min，再取出上清液，在60 ℃烘箱中烘干水分，加入40%的乙醇，料液比1∶35，提取溫度為70 ℃，提取時間30 min，將醇提物低溫烘干后，可得發酵蒲公英黃酮（Fermented Dandelion Flavonoids， FDF）[8]。實驗前將配制10 mg·mL-1的蒲公英黃酮溶液于4 ℃冰箱中保存備用。

1.2.2" FDF對斑馬魚胚胎發育的影響

根據預試驗結果，設置空白對照組（斑馬魚培養用水）、7個FDF濃度組（50、100、150、200、250、300、350 μg·mL-1）。試驗在24孔板中進行，每組設3個重復孔，每孔加入2 mL試驗溶液，篩選7～9 hpf發育正常的胚胎放入提前準備好的24孔板中，每孔放10枚胚胎，置于恒溫培養箱（28.1±1 ℃）進行孵化，每天更換試驗溶液，試驗持續到96 hpf，期間每隔12 h觀察胚胎發育情況，記錄死亡數，在24 hpf記錄15 s內胚胎自主運動頻率，48 hpf時拍照對比各組色素沉著情況，72 hpf記數初孵仔魚的心率、拍照測量其體長及卵黃囊體積，在96 hpf統計孵化率。

卵黃囊體積依據以下公式計算：V=a×b2/6 （1）

式中，a和b分別為卵黃囊主軸和副軸的長度。

1.2.3" FDF對特非那定誘導斑馬魚心臟毒性的保護作用

根據文獻報道[20]，當水中特非那定濃度達到2.5 μg·mL-1時斑馬魚心臟與對照組相比有明顯損傷。因此，本試驗先用2.5 μg·mL-1特非那定誘導斑馬魚，通過心率、SV-BA間距作為評價指標進行測試，而后根據測試結果將特非那定濃度調整到1.5 μg·mL-1作為模型建立的適宜濃度。

試驗設置4個處理組，分別為對照組（斑馬魚養殖用水）、溶劑對照組（0.5% DMSO）、模型組（1.5 μg·mL-1特非那定）、FDF組（10、25、50、100 μg·mL-1）、特非那定（1.5 μg·mL-1）+FDF（10、25、50、100 μg·mL-1）組。將24 hpf發育正常的胚胎移入無菌24孔板中，每個組設3個重復孔，每孔10枚胚胎，放入恒溫培養箱（28.1±1）℃中培養。暴露到48 hpf時記錄初孵仔魚心率，麻醉后在顯微鏡下拍照，測量初孵仔魚心臟靜脈竇（SV）和動脈球（BA）之間的距離。統計數據，比較不同處理組與對照組之間的差異。

1.3" 數據統計分析

試驗所有數據均用平均值±標準誤表示，運用SPSS 26.0對數據進行單因素方差分析（ANOVA）和Duncan氏法多重比較，p＜0.05為差異顯著，p＜0.01為差異極顯著，并采用Sigma Plot 10.0軟件作圖。

2" "結果與分析

2.1" "FDF對斑馬魚胚胎發育的影響

2.1.1" "FDF對斑馬魚胚胎孵化率的影響

由圖1可見，不同濃度的FDF暴露顯著影響斑馬魚胚胎的孵化率。隨著暴露濃度的升高，斑馬魚孵化率呈現降低趨勢，50～200 μg·mL-1 FDF組的胚胎孵化率與對照組無顯著差異，當FDF濃度達到250 μg·mL-1時孵化率顯著降低（p＜0.05），達到300 μg·mL-1時孵化率極顯著降低（p＜0.01），350 μg·mL-1組未見仔魚孵化出膜。

2.1.2" "FDF對斑馬魚胚胎形態的影響

如圖2所示，與空白對照組相比，50～200 μg·mL-1 FDF暴露組的胚胎在24 hpf尾部延伸已超出頭部且眼部黑色素沉著明顯，在48 hpf已有大量胚胎孵化出膜，而250～350 μg·mL-1 FDF暴露組的胚胎發育明顯減緩，孵化延遲。

2.1.3" FDF對斑馬魚胚胎自主運動頻率的影響

由圖3可見，不同濃度的FDF暴露顯著影響斑馬魚胚胎自主運動。隨著暴露濃度的升高，斑馬魚胚胎自主運動頻率呈現降低趨勢，與對照組相比，50、100、250 μg·mL-1 FDF暴露組的胚胎自主運動頻率顯著降低（p＜0.05），150、300、350 μg·mL-1 FDF組的胚胎自主運動頻率極顯著降低（p＜0.01）。

2.1.4" FDF對斑馬魚初孵仔魚心率的影響

由圖4可見，與對照組相比，50～200 μg·mL-1 FDF暴露對斑馬魚初孵仔魚心率無顯著影響，當FDF濃度達到250 μg·mL-1時初孵仔魚心率顯著低于對照組（p＜0.05）。

2.1.5" FDF對斑馬魚初孵仔魚體長和卵黃囊體積的影響

由圖5可見，隨著暴露濃度的升高，斑馬魚初孵仔魚體長減小，卵黃囊體積增大，與對照組相比，100～250 μg·mL-1 FDF組初孵仔魚的體長極顯著降低（p＜0.01），50～250 μg·mL-1 FDF組斑馬魚初孵仔魚的卵黃囊體積極顯著增大（p＜0.01）。

2.2" FDF對特非那定誘導的斑馬魚心臟毒性的保護作用

2.2.1" FDF對特非那定誘導的斑馬魚心率降低的影響

FDF對特非那定誘導的斑馬魚心率的影響見圖6。與對照組相比，10 μg·mL-1的FDF暴露組斑馬魚心率顯著升高（p＜0.05），25～100 μg·mL-1的FDF組斑馬魚心率極顯著升高（p＜0.01），特非那定添加組斑馬魚的心率極顯著降低（p＜0.01）；與特非那定組相比，10～100 μg·mL-1 FDF預暴露組的斑馬魚心率均無顯著差異，但25 μg·mL-1 FDF預暴露組對特非那定引起的心率降低有緩解趨勢。

2.2.2" FDF對特非那定誘導的斑馬魚SV-BA距離的影響

FDF對特非那定誘導的斑馬魚SV-BA距離的影響見圖7，與對照組相比，10～100 μg·mL-1的FDF暴露對斑馬魚初孵仔魚的SV-BA距離無顯著影響，添加特非那定后斑馬魚初孵仔魚的SV-BA距離顯著增加（p＜0.01）；與特非那定組相比，添加10～100 μg·mL-1 FDF對特非那定引起的斑馬魚初孵仔魚的SV-BA距離變化無顯著影響。

3" 討論與結論

蒲公英是藥食兩用的中藥材，在我國傳統醫藥中具有重要藥用和食用價值[21]。蒲公英富含黃酮類化合物，具有抗氧化、抗炎、抗腫瘤[22]和增強免疫力[23]等藥理活性。譚麗杰等利用高糖誘導的心肌細胞損傷模型，發現蒲公英總黃酮通過上調miR-129-5p可提高細胞活性，改善氧化應激并減少細胞凋亡[24]。張家琪等研究發現蒲公英黃酮可通過SATB2干預氧化應激和炎癥反應，對LPS誘導的結腸上皮細胞損傷具有一定的保護作用[25]。Eziz等通過益生菌制劑發酵，發現蒲公英黃酮含量較未發酵蒲公英提高了2.74倍[26]。但目前尚未有對發酵蒲公英黃酮用藥劑量的安全性評價報道，因此進行其安全性評價具有重要意義。

斑馬魚模型是一種新型模式生物，在神經系統、心血管系統[27]等方面都與人類的對應組織具有極其相似的發育機制與特點。目前很多國家已廣泛將斑馬魚模型應用于化合物的安全性評價與活性篩選[28]。因此本研究采用斑馬魚模型對FDF的整體發育急性毒性進行評價，為FDF的綜合開發利用提供參考。

本試驗采用7～9 hpf的斑馬魚胚胎，將其暴露于不同濃度的FDF中，觀察至96 hpf結果顯示，FDF濃度在50～200 μg·mL-1時對胚胎發育有促進作用，250 μg·mL-1及以上濃度處理的胚胎發育明顯減緩，孵化時間延遲，與對照組相比其孵化率顯著降低，說明200 μg·mL-1及以下的FDF可促進胚胎發育，這在一定程度上是斑馬魚胚胎機體應激的結果。72 hpf時，與對照組相比，250 μg·mL-1的FDF使斑馬魚初孵仔魚心率顯著降低，其他各濃度組（50、100、150、200 μg·mL-1）的斑馬魚心率均無顯著變化；100～250 μg·mL-1的FDF使斑馬魚初孵仔魚體長顯著降低；50 μg·mL-1及以上濃度FDF處理的斑馬魚卵黃囊體積均顯著增大。仔魚孵出后，卵黃囊體積增大、體長減小均影響斑馬魚生長發育，即100 μg·mL-1及以上的FDF對斑馬魚產生發育毒性。引起斑馬魚出膜前后生長發育的不統一可能是不同濃度FDF處理后的仔魚出膜時間不統一但拍照測量時間相同所導致，具體機制還需要更多相關實驗來證實。

藥物引起的心臟毒性是藥物安全評價中一類嚴重的不良反應[29]。斑馬魚胚胎全身透明，便于在體視顯微鏡下直接觀察心率、心臟形態及血液循環等變化[30]。斑馬魚的心率反映了心臟的泵血功能。實驗中斑馬魚的 SV-BA 分別代表斑馬魚的血液進入心房的部位和血液流出心室的部位，其距離的變化可反映心臟損傷程度[31]。特非那定是一種抗組胺藥，有著嚴重的導致心律失常的不良反應[32] 。在科學研究中，特非那定已被廣泛作為誘導劑誘導斑馬魚的心臟損傷，以此探究如原花青素[33]、丹參[34] 、牡丹籽蛋白水解物[35]等天然產物對心臟的保護作用。因此，本試驗采用心率、SV-BA距離為指標來判斷FDF對特非那定誘導的斑馬魚心臟毒性的保護作用。48 hpf時，與對照組相比，25～100 μg·mL-1濃度的FDF使斑馬魚的心率顯著升高，特非那定各組（特非那定、+10 μg·mL-1 FDF、 +25 μg·mL-1 FDF、+50 μg·mL-1 FDF、+100 μg·mL-1 FDF）的心率顯著降低；與特非那定組相比，10、25、50、100 μg·mL-1 FDF預暴露的特非那定組對心率、SV-BA距離無顯著差異，但特非那定+25 μg·mL-1 FDF組有心率升高的趨勢，說明FDF對特非那定誘導的斑馬魚心臟毒性有一定程度的緩解作用。

本試驗結果顯示FDF對斑馬魚毒性較小，在低濃度下對斑馬魚形態、心率無顯著差異；在高濃度下會影響斑馬魚的形態，致畸表現為卵黃囊吸收延遲、體長減小及心率顯著降低，但致畸毒性較小。本試驗結果證明FDF應用較安全，毒副作用較小，且能一定程度地減緩特非那定對心臟的毒性作用，但要合理控制用量。本研究可為發酵蒲公英黃酮的安全使用提供數據支撐和理論依據。

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（責任編輯：易" 婧）