諸氏鯔蝦虎魚胚胎及早期仔魚發育研究

高彩霞 賴素群 曾進

(廣東省實驗動物監測所,廣東省實驗動物重點實驗室,廣州 510663)

諸氏鯔蝦虎魚(Mugilogobiuschulae)隸屬于鱸形目(Perciformes)、蝦虎魚科(Gobiidae)、鯔蝦虎魚屬(Mugilogobius),為暖水性小型海洋魚類[1],廣泛分布于我國南海、東海等西太平洋沿岸海域,具有體形小、繁殖量大、胚胎透明、繁殖周期短、易于人工飼養等特點,是我國目前唯一一種已制定質量控制國家標準的海水實驗魚[2-3]。目前我國已成功實現諸氏鯔蝦虎魚全人工繁育,開展了染色體組型分析[4]、全基因組測序[5]、遺傳標記[1]、營養需求[6-7]、微生物控制[8-10]等生物學和質量控制技術研究,建立了封閉群和近交系[11](全同胞兄妹交配至18代),制定了諸氏鯔蝦虎魚急性毒性、攝食抑制、生長抑制、生殖毒性等一系列毒理學評價標準[12-15],并廣泛應用于重金屬污染物[16-17]、有機物[18]、無機物[19]、環境內分泌干擾物[20]、鉆井液[21]等海洋生態毒理研究。諸氏鯔蝦虎魚的胚胎和早期仔魚是海洋生態毒理學研究常用的實驗材料,其發育研究具有重要的參考價值[22],但迄今未見相關的研究報道。

本研究觀察了諸氏鯔蝦虎魚胚胎和早期仔魚的發育特征,以期豐富其早期生物學研究基礎資料和科學數據,為后續建立諸氏鯔蝦虎魚胚胎毒性試驗方法提供參考依據。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物

諸氏鯔蝦虎魚親本取自廣東省實驗動物重點實驗室。雄性親本平均全長(32.15±3.12)mm,體質量為(346.23±4.83)mg,雌性親本平均全長(29.33±4.56)mm,體質量為(254.92±7.05)mg。選取雌、雄親魚各10尾,按數量比1∶1配比10對親本,分別放于繁殖缸(長20 cm、寬10 cm、高15 cm)內進行循環水養殖。養殖用水為砂濾海水,平均水溫為(25.46±0.10)℃,鹽度為27.00±1.00,溶解氧為(7.01±0.75)mg/L,光照時長∶黑暗時長為14 h∶10 h。每日按照魚體質量的2%投喂1次“日清丸”牌配合飼料。

1.1.2 主要試劑與儀器

Tricaine(三卡因)麻醉劑(TCI,T0941);正置光學顯微鏡(徠卡,Leica DM 1000,德國)。

1.2 方法

1.2.1 產卵、孵化及胚胎的發育觀察

提前2 h將魚巢放置在繁殖缸中,每日觀察親魚狀態及產卵情況。待親魚自然產卵受精后,取出魚巢,用鑷子輕輕剝取10～20枚受精卵,置于滴有孵化用海水的玻片上,用Leica DM 1000正置光學顯微鏡觀察并拍照后,將附卵魚巢放回繁殖缸中,繼續由親魚護理孵化。

對首次收集的受精卵連續觀察5 h,其后每隔1 h另取1次受精卵觀察和拍照。

1.2.2 早期仔魚發育觀察

將孵化出的仔魚移至水溫為(25.0±1.0)℃、鹽度為18.00±1.00的養殖箱內飼養,定時進行光照,光照時長∶黑暗時長為14 h∶10 h,每日投喂1次輪蟲作為餌料(每尾仔魚投喂5～10個輪蟲)。每天隨機取10尾仔魚,用20 mg/L Tricaine麻醉后,測量魚體全長,用Leica DM 1000正置光學顯微鏡觀察仔魚的發育情況。

2 結果與分析

諸氏鯔蝦虎魚胚胎發育歷時73 h 20 min,所需積溫為1 833.33 ℃·h。發育過程可劃分為8個階段:合子期、卵裂期、囊胚期、原腸期、神經胚期、器官形成期、將孵期和孵化期(見表1)。

表1 諸氏鯔蝦虎魚胚胎發育分期及主要特征

2.1 受精卵

諸氏鯔蝦虎魚剛產下的卵呈球狀,卵徑為(0.26±0.03)mm,表面有黏絲(見圖1-1)。受精5 min后卵膜吸水膨脹,呈長梭狀,長徑為(0.81±0.05)mm,短徑為(0.39±0.01)mm。有1～8個油球,多數為2～4個,卵一端具黏絲,受精卵可由黏絲相互連結、整齊地附著在魚巢上。受精18 min后,原生質向動物極移動和集中,逐漸在動物極形成半圓形的隆起,即為胚盤(見圖1-2)。

注:1.受精卵;2.胚盤隆起;3.2細胞期;4.4細胞期;5.8細胞期;6.16細胞期;7.32細胞期;8.64細胞期;9.多細胞期;10.高囊胚期;11.低囊胚期;12.原腸早期;13.原腸中期;14.原腸末期;15.胚體形成期;16.胚孔封閉期;17.視囊形成期;18.肌節出現期;19.聽囊形成期;20.晶體形成期;21.心臟跳動期;22.眼黑色素期;23.胸鰭原基期;24.將孵期;25.孵化期。

2.2 卵裂期

諸氏鯔蝦虎魚的卵子為端黃卵,卵裂方式屬于盤狀卵裂。第1次卵裂發生在受精后35 min,從受精卵正中間開始出現分裂溝,并在5 min內完成首次分裂,到達2細胞期(見圖1-3)。受精后58 min,在第1次形成卵裂面的垂直線上出現縱溝,每個卵裂球均等地一分為二,完成第2次分裂,進入4細胞期(見圖1-4)。受精后1 h 21 min,發生第3次卵裂,卵裂面垂直于前兩次卵裂,進入8細胞期(見圖1-5)。隨后,胚盤細胞每間隔20～30 min進行1次有絲分裂,依次分裂形成16細胞、32細胞、64細胞等(見圖1-6～圖1-8)。隨著細胞的不斷分裂,在整體胚盤體積無明顯變化或稍有增大的情況下,胚盤細胞逐漸變小并開始層疊。單個胚盤細胞也由邊界分明、清晰可見逐漸變為分裂溝縱橫交錯、細小而難以區分,此時進入多細胞期(見圖1-9)。

2.3 囊胚期

諸氏鯔蝦虎魚受精卵經卵裂不斷地細分變小,直到細胞邊界模糊、難以區分。細胞層疊并隆起,囊胚吸附在動物極的絨毛膜一側并開始包裹動物極的原生質膜,呈帽狀。隨著囊胚不斷地擴展并包裹絨毛膜而形成囊胚腔。在受精后3 h 20 min,由于細胞分裂堆積而呈高帽狀,進入高囊胚期(見圖1-10);隨后,細胞繼續經過多次分裂,不斷變小變多,胚層逐漸變薄并向下擴張,在受精后4 h 10 min,胚盤隆起變得最低,此時期為低囊胚期(見圖1-11)。

2.4 原腸期

諸氏鯔蝦虎魚受精卵在受精后6 h 左右開始進入原腸胚期,此時胚體沿著卵黃囊逐漸向植物極移動,邊緣細胞增多并且包裹卵黃囊。受精后6 h 20 min,胚體進一步向植物極擴張,胚盤下包至整個卵黃囊的1/3左右,此時進入原腸早期(見圖1-12)。受精后6 h 50 min,原腸胚包裹卵黃囊的1/2,可明顯觀察到胚層包裹所形成的胚環和胚盾,此時進入原腸中期(見圖1-13)。隨著胚層不斷地包裹、延伸,胚體下包至卵徑的4/5,在受精后7 h 22 min進入到原腸末期(見圖1-14)。

2.5 神經胚期

諸氏鯔蝦虎魚受精后9 h 50 min,胚環縮小,胚層細胞包圍植物極,胚體背部增厚,形成神經板。胚盾伸長,卵黃栓出現,前端略膨大形成腦泡,胚體形態初現(見圖1-15),受精后11 h 40 min,胚層逐漸下包收縮成1個小圓孔,進入胚孔封閉期(見圖1-16)。

2.6 器官形成期

諸氏鯔蝦虎魚受精后16 h 10 min,胚體進入到器官形成期,此時頭部出現1對圓形突起,克氏囊出現(見圖1-17)。隨著發育的進行,胚體在16 h 50 min出現3～7對肌節,此時視囊明顯(見圖1-18)。受精后18 h 28 min,在視囊的后面出現聽囊,肌節增加至9～11對,出現尾芽,胚體出現間歇性顫動,心臟原基出現(見圖1-19)。

受精后19 h 46 min,眼囊中央內陷形成晶狀體,胚體頭部出現橢圓形腦泡,圍心腔出現,胚體背腹兩處逐漸形成鰭褶,肌節逐漸呈“V”字形,胚體尾部形成褶皺,并與卵黃囊分離(見圖1-20)。

受精后22 h 40 min,心室擴大、隆起,心臟形成,并開始出現微弱、有規律的搏動,頻率為22～25次/min,之后逐漸加強。同時胚體頭部與卵黃囊分離,向前延伸,與腹部幾乎成直線,尾鰭繼續延伸,可見明顯的胚體擺動,視泡更為明顯(見圖1-21)。

受精后40 h 42 min,晶體周圍出現黑色素,眼逐漸變黑,此時進入眼黑色素期。該時期胚體背部出現點狀、塊狀色素斑;心跳127～130次/min,身體血管開始分化,血液呈微紅色;肌節增至26～28對,尾部擺動明顯(見圖1-22)。受精后43 h 30 min,胸鰭原基期出現,尾部延伸彎曲至頭部,卵黃囊和油囊變小,心跳增至178～183次/min,胚體繼續延長(見圖1-23)。

2.7 將孵期及孵化期

受精后71 h 30 min,胚體發育至將孵期。此時卵膜變薄,胚體尾部彎曲超出頭部,尾部擺動頻繁且劇烈,胚體可在膜內有力扭動,胸鰭分化呈半圓形,卵黃囊明顯縮小,此時心跳可達到217～219次/min(見圖1-24)。受精后73 h 20 min,胚體扭動劇烈,尾部不斷拍擊卵膜,仔魚通過頭部或尾部掙破卵膜,陸續孵化而出(見圖1-25)。

2.8 諸氏鯔蝦虎魚仔稚幼魚形態學觀察

剛出膜的諸氏鯔蝦虎魚全長為(1.50 ±0.01)mm,體色透明。出膜后健康仔魚游動劇烈,初孵仔魚眼睛呈黑色橢圓形,2塊圓形的耳石位于眼睛后方。在仔魚腹部,可觀察到油囊位于卵黃囊中間,在腹腔上方有黑色的鰾原基,在鰾原基的后方有一黑色細長的腎臟,腎臟與消化道末端的膀胱相連,消化道呈透明、折疊狀(見圖2-1)。剛出膜的仔魚有集群趨光的特點。孵出24 h后,仔魚全長為(1.97±0.03)mm,卵黃囊和油囊變小,體色稍有加深,尾柄處散射的黑色素增多(見圖2-2)。孵出36 h后,部分仔魚可開口攝食輪蟲,腸道中分布少量食物,腸道蠕動增加,體循環清晰可見(見圖2-3)。孵出72 h后,仔魚全長為(2.11±0.02)mm,卵黃囊和油囊消失,此時大部分仔魚可攝食輪蟲,腸道蠕動加快,消化道褶皺增加,具有排泄功能。仔魚形態纖長,尾鰭膜弧度增加,呈扇形輪廓,放射狀紋路更加明顯;游動更為活躍,可在水中平游,具有喜光、集群的特點(見圖2-4)。孵出120 h后,仔魚全長(2.28±0.04)mm,尾鰭開始分化;腸管加粗,內壁的皺褶更加發達。此時仔魚可大量攝食輪蟲,腸道中充滿食物,尾柄處放射狀色素加深,頭部鰓蓋骨已較發達,上下頜出現細小的頜齒(見圖2-5),具有較強的游動能力。孵出10 d后,仔魚全長為(3.27±0.19)mm,尾鰭逐漸分化成半圓形,可見鰭條,第1及第2背鰭開始分化;腸道褶皺增加顯著,腹部膨大,腸道內容物顯著增多,可攝食鹵蟲無節幼體。仔魚身體透明度降低,色素主要分布于腹側及身體中后段體側(見圖2-6)。

注:1.初孵仔魚;2.24 h仔魚;3.36 h仔魚;4.72 h仔魚;5.120h仔魚;6.10 d仔魚。

3 討論

諸氏鯔蝦虎魚卵為黏性卵,未受精的卵呈圓球狀,表面有一層薄膜,有黏絲包裹在膜表面。受精卵吸水后表面的黏絲分離,并形成附著絲黏附在魚巢上,卵膜隆起,并與卵球分離,形成長梭狀的卵。受精卵的一端懸浮在水中,另一端黏附在魚巢上,這與紋縞蝦虎魚(Tridentigertrigonocephalus)受精卵的形態相似[23]。

諸氏鯔蝦虎魚胚胎發育過程中,自然孵化的適宜水溫為24.6～25.6 ℃,在此溫度下,胚胎孵化率高,仔魚活力好,畸形率低。多數研究表明,胚胎發育過程受溫度的影響最為顯著[24-25],溫度過高或者過低都可能導致胚胎發育不完善。在適當的水溫范圍內,升高水溫會加快胚胎發育進程,縮短孵化時間,但此時仔魚器官發育不夠完善,適應外界環境的能力較弱,因此仔魚的畸形率偏高[26-27],魚苗的死亡率較高;而在水溫偏低的情況下,胚胎發育變得緩慢,仔魚孵化時間延長,常常導致胚胎在膜內停留太久而缺氧,胚胎的孵化率降低,死亡率顯著增高[28]。

與其他蝦虎魚相比,諸氏鯔蝦虎魚在自然產卵受精并由親魚孵化的情況下,當水溫維持在25.6 ℃左右,其孵化出膜時長約為73 h,孵出的仔魚活力好,開口攝食時間早。同為蝦虎魚科的伊夫林蝦虎魚(Gobiosomaevelynae)受精卵在水溫25 ℃時歷時168 h孵化出膜[29];粘皮鯔蝦虎魚(Mugilogobiusmyxodermus)受精卵在水溫16～18 ℃條件下歷時138 h出膜[30];紅頭蝦虎魚(Elacatinuspuncticulatus)受精卵在水溫(26±0.48)℃時需要168 h以上孵化出膜[31];胡須蝦虎魚(Sufflogobiusbibarbatus)受精卵在水溫17 ℃時需要7 d才孵化出膜[32];紋縞蝦虎魚在水溫17～25 ℃條件下歷時156.5～257.2 h孵化出膜[23]。蝦虎魚科不同物種之間,其孵化溫度及時長存在明顯差異,這可能與物種類別及生殖孵化環境的差異相關。除水溫外,胚胎發育的出膜時長也與受精卵本身的質量相關,同時可能與受精卵黏附在魚巢的位置有關[30]。同一批卵,黏附在魚巢的不同位置,其胚胎的發育是不同步的。此外,水流對胚胎發育及出膜時長也有明顯的影響。李建軍等[28]觀察發現,在魚巢邊緣位置,受水流刺激比位于中央更多,因此邊緣位置的魚卵發育更快。本研究在諸氏鯔蝦虎魚繁殖缸內放置魚巢供親魚產卵,觀察發現,位于魚巢邊緣的胚胎,其出膜時間稍早于位于魚巢中央的胚胎,推測與受到較多的水流刺激有關。除此之外,海水魚類受精卵的孵化速率與卵徑的大小可能呈正相關,卵徑越大,孵化時間越久,初孵仔魚個體也越大[33]。與其他的蝦虎魚相比,諸氏鯔蝦虎魚的受精卵較小,產卵量較多,其胚胎孵化出膜的時間也較短。

在諸氏鯔蝦虎魚胚胎發育的8個階段分期中,器官形成期累計積溫最高,發育時間最長,約占整個發育周期的75.45%。其中心臟跳動期到眼黑色素期持續18 h左右,這期間心臟的跳動頻率由22～25次/min加強到了127～130次/min,同時到達眼黑色素期,并且在出膜前眼睛發育完成,有色素沉積,同時形成眼囊、胸鰭、心臟、消化道等器官,初孵仔魚就具備了較為完善的內臟器官,能更好地適應外界環境[34]。這是蝦虎魚的普遍特性[31]。

諸氏鯔蝦虎魚胚胎在受精后73 h 20 min開始出膜,75 h左右可以全部孵化出膜。初孵仔魚平均全長為1.50 mm,孵化后生長狀態好,存活率高。孵出36 h后,部分仔魚開口攝食輪蟲,此時卵黃囊和油囊消失;孵出120 h后,仔魚可大量攝食輪蟲,其游動迅速,有趨光性和聚集性。

諸氏鯔蝦虎魚胚胎發育時間較短,總積溫低于其他蝦虎魚。初孵仔魚開口攝食早,生長狀態好,可進行人工繁育,符合實驗動物基本要求。本研究初步描述了諸氏鯔蝦虎魚胚胎和早期仔魚的發育特點及生長特性,可為后續開展諸氏鯔蝦虎魚胚胎或早期仔魚毒性試驗研究提供參考。