人工養(yǎng)殖長江鱘后備親本血液生化指標研究

李遠蘭 張濤 馮廣朋 莊平 章龍珍

(1 中國水產(chǎn)科學研究院東海水產(chǎn)研究所,上海 200090;2 湖州師范學院生命科學學院,浙江湖州 313000)

長江鱘(Acipenserdabryanus)又名達氏鱘,隸屬于鱘形目(Acipenseriformes)、鱘科(Acipenseridae)、鱘屬(Acipenser),是我國特有的淡水鱘類。該魚主要分布于長江中上游,常棲息于河流較淺、水流較緩的灣沱處,除產(chǎn)卵外,進行不定期洄游[1]。長江鱘曾是我國重要的漁業(yè)捕撈對象,由于受到航運、過度捕撈、水體污染和水電工程建設(shè)等人類活動的干擾,長江鱘野生種群資源逐漸衰退,其商業(yè)捕撈活動于1983年被禁止,1988年長江鱘被列為國家一級保護動物[2]。為保護長江鱘,科研人員在長江鱘的種群生態(tài)[3]、人工繁殖[4]、早期發(fā)育[5]、分子遺傳[6]和營養(yǎng)需求[7]等方面進行了許多研究。

動物的血液具有物質(zhì)運輸、生理調(diào)節(jié)及生理防御等重要作用[8]。魚類的血液生化指標能反映魚體的健康狀況、營養(yǎng)水平等正常生理狀態(tài)[9],同時也能為魚類的繁殖生理及病理研究等提供重要參考依據(jù)[10]。目前國內(nèi)學者已對中華鱘[11]、史氏鱘[12]、匙吻鱘[13]和西伯利亞鱘[14]等鱘類的血液學開展了較多的研究,但有關(guān)長江鱘血液生化指標的研究鮮有報道。本研究擬通過檢測人工養(yǎng)殖長江鱘后備親本血清生化指標,掌握長江鱘血液生化指標的健康參數(shù)參考范圍,豐富長江鱘血液生化指標數(shù)據(jù)庫,為長江鱘的物種保護提供基礎(chǔ)資料。

1 材料和方法

1.1 材料

試驗魚為人工養(yǎng)殖的長江鱘后備親本,無傷無病,健康活潑。共檢查測定8尾魚,其全長為(153.13±16.50)cm,體長為(123.75±15.08)cm,體質(zhì)量為(57.56±10.34)kg。

長江鱘養(yǎng)殖在室內(nèi)圓形水泥池中進行。水泥池直徑4.5 m,高2.0 m,養(yǎng)殖水深為1.0 m。養(yǎng)殖期間,每天定時(7:00、13:00、19:00)用溫度計檢測養(yǎng)殖車間的環(huán)境室溫,用YSI綜合水質(zhì)分析儀檢測養(yǎng)殖水體的水溫、pH、溶解氧(DO)等水質(zhì)指標。11月—次年4月,使用曝氣后的自來水進行養(yǎng)殖,水溫維持在10～20 ℃;5月—10月,使用“百諾肯”養(yǎng)殖制冷恒溫機(型號BN-5A)給水體降溫,水溫保持在(25±1)℃;養(yǎng)殖水體長年不間斷曝氣并安裝斷氣報警器,溶解氧保持在5 mg/L以上。養(yǎng)殖期間,pH保持在7.8～8.2,氨氮保持在0～0.1 mg/L。每日換水,采用邊進水邊排水的換水方式,換水量約為總水量1/3。每隔7 d在長江鱘進食3 h后用聚維酮碘溶液進行消毒,用量為0.75 mL/m3。

飼養(yǎng)方法:人工養(yǎng)殖長江鱘的飼料為8號鱘魚全熟化水產(chǎn)配合飼料(寧波天邦股份有限公司),按照“定時、定點、定質(zhì)、定量”原則進行投飼管理。采用人工定點投飼的方式,于每日早上(7:00)和晚上(16:00)各投喂1次,日投飼量約為長江鱘總體質(zhì)量的3%。投飼1 h后,用吸污管吸出剩余殘飼,以減少對養(yǎng)殖水體的污染。當水質(zhì)異常或魚攝食異常時,需適當減少投飼量。

1.2 方法

1.2.1 血樣采集與血清制備

2021年4月,在長江鱘的臀鰭后方尾靜脈處使用20 mL無菌注射器勻速抽取血液,并立即分裝至10 mL潔凈離心管中,室溫下放置4 h后,使用高速冷凍離心機以3 000 r/min的速度離心10 min。離心完成后,取上清液置于2 mL離心管中,于-80 ℃超低溫冰箱中凍存,待測。

1.2.2 血液生化指標測定

泌乳素(prolactin,PRL)、皮質(zhì)醇(cortisol,CORT)、雌二醇(estradiol,E2)、睪酮(testosterone,TTE)、生長激素(growth hormone,GH)、甲狀腺素(thyroxine,T4)、促甲狀腺素(thyrotropin,TSH)采用電化學發(fā)光法測定;胰島素樣生長因子-1(insulin like growth factor-1,IGF-1)與三碘甲狀腺原氨酸(triiodothyronine,T3)采用化學發(fā)光法測定;總超氧化物歧化酶(total superoxide dismutase,SOD)、過氧化氫酶(catalase,CAT)、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-PX)、丙二醛(malondialdehyde,MDA)、溶菌酶(lysozyme,LZM)、己糖激酶(Hexokinase,HK)、磷酸果糖激酶(phosphofructokinase,PFK)、丙酮酸激酶(pyruvate kinase,PK)采用可見光法測定;鉀(K)、鈉(Na)、氯(Cl)、鈣(Ca)和鎂(Mg)離子使用電解質(zhì)分析儀進行檢測。

1.2.3 數(shù)據(jù)處理

利用變異系數(shù)[15]評價人工養(yǎng)殖條件下長江鱘各血液生化指標的變異程度。計算公式為:

變異系數(shù)=(標準差/平均值)×100%

(1)

研究數(shù)據(jù)通過EXCEL 2003軟件整理分析,結(jié)果用(平均值±標準差)表示。使用SPSS 21.0軟件進行獨立樣本t檢驗,對雌、雄組間進行差異顯著性分析,設(shè)P<0.05為差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 不同個體人工養(yǎng)殖長江鱘后備親本血液生化指標差異

人工養(yǎng)殖長江鱘后備親本血清激素的部分測定結(jié)果見表l。結(jié)果顯示,血清激素中皮質(zhì)醇(CORT)的變異系數(shù)最小,為16.90%;促甲狀腺素(TSH)的變異系數(shù)最大,為92.81%。此外,試驗檢測出3項指標的濃度范圍:睪酮(TTE)濃度的最小值小于0.03 ng/mL,最大值大于15.00 ng/mL;泌乳素(PRL)濃度均小于1.00 μIU/mL;甲狀腺素(T4)濃度的最小值為0.01 nmol/L,最大值為10.65 nmol/L。

表1 人工養(yǎng)殖長江鱘后備親本的血清激素指標值

人工養(yǎng)殖長江鱘后備親本血清抗氧化與免疫指標的測定結(jié)果見表2。結(jié)果顯示,抗氧化酶中CAT活力為(2.54±1.39)U/mL,其變異系數(shù)最大;SOD活力為(585.99±87.23)U/mL,其變異系數(shù)最小;免疫指標LZM的活力為(847.83±287.46)U/mL,其變異系數(shù)為33.91%。

表2 人工養(yǎng)殖長江鱘后備親本血清抗氧化和免疫指標值

人工養(yǎng)殖長江鱘后備親本血清離子和能量代謝酶指標的測定結(jié)果見表3。結(jié)果顯示,血清離子中Mg2+的濃度最低,為(1.76±0.66)mmol/L,其變異系數(shù)最大;Na+的濃度最高,為(136.85±14.83)mmol/L,其變異系數(shù)最小。能量代謝酶中PFK活力為(5.23±3.08)nmol/(min·mL),其變異系數(shù)最大;PK活力為(39.22±10.78)U/L,其變異系數(shù)最小。

表3 人工養(yǎng)殖長江鱘后備親本的血清離子和能量代謝酶指標值

2.2 不同性別人工養(yǎng)殖長江鱘后備親本血液生化指標差異

人工養(yǎng)殖長江鱘后備親本雌性和雄性個體各項血液生化指標的差異見表4。由結(jié)果可以看出,人工養(yǎng)殖長江鱘的血清激素、血清抗氧化指標、血清免疫力指標和血清能量代謝酶等血液生化指標的P值均為P>0.05,血清離子中,除K+的P<0.05(P=0.02)外,其他血清離子的P值均為P>0.05。

表4 人工養(yǎng)殖長江鱘血液生化指標的性別差異

3 討論

3.1 人工養(yǎng)殖長江鱘血液生化指標的特點

人工養(yǎng)殖長江鱘血液各項生化指標的參數(shù)變化范圍較大,這與鯉科[16]、鯰形目[17]和鱸形目[18]魚類相似。本研究中檢測的8尾人工養(yǎng)殖長江鱘,其全長最小值(128 cm)與最大值(180 cm)相差52 cm,體長最小值(102 cm)與最大值(146 cm)相差44 cm,體質(zhì)量最小值(43.65 kg)與最大值(72.90 kg)相差29.25 kg。人工養(yǎng)殖長江鱘不同個體間較大的生長狀況差異,可能導致各項血液生化指標值的差異較大。

魚類血液生化指標能反映魚類的生理狀況和健康狀況,正常情況下這些指標是相對穩(wěn)定的,但當魚體生長環(huán)境改變或發(fā)生病變時,一些生化指標會發(fā)生明顯改變,因此,這些血液生化指標可作為魚類毒理學和生物監(jiān)測的工具[19]。在本研究中,CORT、SOD、GSH-PX、K+、Na+與Cl-等血液生化指標變異系數(shù)均小于20%,具有一定的穩(wěn)定性,可作為血液生化參考指標用來監(jiān)測長江鱘的狀態(tài)。魚類的血液生化指標還受多種因素的影響,如水溫、季節(jié)、性別、年齡和營養(yǎng)狀況等都會影響魚類的血液生化指標值[20]。雖然GH等13項血液生化指標的變異系數(shù)較大,但在一定程度上仍可以反映長江鱘的生理狀況。本研究是以人工養(yǎng)殖的健康長江鱘后備親本作為對象,其生化指標值范圍對于評價人工養(yǎng)殖長江鱘的健康程度具有借鑒意義。

3.2 人工養(yǎng)殖長江鱘血液生化指標的性別差異

盡早鑒定長江鱘的性別對于后續(xù)開展繁育工作十分重要。然而,由于長江鱘沒有第二性征,無明顯的外部特征進行性別區(qū)分[21],因此對其進行性別鑒定較為困難。當前鱘魚的性別鑒定技術(shù),如微創(chuàng)手術(shù)、內(nèi)窺鏡和B超檢測等都需要在魚體生長到較大個體甚至性成熟后才較為有效,且進行鑒定時會對鱘魚造成不同程度的損傷[22]。張濤等[14]進行基于血液生化指標判別分析西伯利亞鱘性別及卵巢發(fā)育時期的研究發(fā)現(xiàn),西伯利亞鱘的總膽固醇、低密度脂蛋白、谷草轉(zhuǎn)氨酶、谷丙轉(zhuǎn)氨酶在雌、雄個體間有顯著差異。可見,性別會影響魚類的血液生化指標[23]。通過血液生化指標來鑒定長江鱘的性別不僅成本低,還能降低對魚體的損傷。本試驗結(jié)果顯示,雌性長江鱘血液中K+的含量顯著高于雄性個體(P<0.05),可考慮將其作為人工養(yǎng)殖長江鱘性別鑒定的依據(jù)。今后可以繼續(xù)探尋長江鱘雌、雄個體間具有顯著差異的血液生化指標,以便綜合地依靠血液生化指標來判定其性別。

3.3 人工養(yǎng)殖長江鱘與中華鱘血液生化指標的比較

在現(xiàn)存的鱘類中,長江鱘與中華鱘親緣關(guān)系最接近。在進化上,有學者認為達氏鱘可能是中華鱘的陸封種群[24]。因此,將長江鱘與中華鱘的血液生化指標進行比較具有重要的生物學意義。參考張海耿等[25]和章龍珍等[26]的研究結(jié)果,人工養(yǎng)殖長江鱘與中華鱘部分血液生化指標的比較見表5。

表5 人工養(yǎng)殖長江鱘與中華鱘血液生化指標的比較

有研究發(fā)現(xiàn),IGF-1過高會抑制魚類的生長[27]。本研究中人工養(yǎng)殖長江鱘的IGF-1為(16.79±3.86)μg/L,而張海耿等[25]測定的中華鱘的IGF-1超過100 μg/L。根據(jù)這一結(jié)果,長江鱘的生長速度可能比中華鱘快。

生物體通過代謝會產(chǎn)生活性氧(ROS),過量的ROS自由基會損害生物體的組織器官[28],但生物體內(nèi)的抗氧化系統(tǒng)可以清除生物體內(nèi)過量的ROS。SOD和CAT是抗氧化酶系統(tǒng)十分重要的功能酶[29],GSH-PX是清除ROS極其重要的非酶抗氧化物質(zhì)[30]。MDA是脂質(zhì)過氧化反應的產(chǎn)物,可間接體現(xiàn)機體的抗氧化能力[31]。LZM是生物體非常重要的免疫因子,通過破壞革蘭氏陽性菌細胞壁中的肽聚糖來瓦解細菌細胞[32]。與張海耿等[25]測量的中華鱘血液生化指標相比,本研究中人工養(yǎng)殖長江鱘血液中的SOD含量[(585.99±87.23)U/mL]遠遠大于淡水養(yǎng)殖的中華鱘[(135.64±25.62)U/mL]。長江鱘一直生活在長江里,其體溫變化較小,可能有利于促進SOD的合成,從而使長江鱘的抗氧化能力更強。此外,人工養(yǎng)殖長江鱘血液中的LZM含量也遠大于中華鱘,說明長江鱘可能具有更強的免疫力。人工養(yǎng)殖長江鱘血液中的GSH-PX、CAT、MDA活性與中華鱘基本相同。試驗表明,人工養(yǎng)殖長江鱘總體上比中華鱘具有更強的抗氧化能力和免疫力。原因可能是:中華鱘屬于海河洄游鱘類,較大幅度的水溫變化會影響其SOD的活性,當受到細菌或病毒侵襲時,中華鱘機體免疫細胞會產(chǎn)生更多的自由基物質(zhì)進行抵御,影響了免疫基因的表達量,從而減弱了中華鱘的抗病效果[33];與之相比,長江鱘的體溫變化幅度較小,促進了長江鱘免疫相關(guān)基因的表達,從而表現(xiàn)出更強的免疫力。

血清離子對于維持與調(diào)節(jié)魚類的滲透壓有著直接的作用。相比章龍珍等[26]測得的中華鱘血清離子含量,人工養(yǎng)殖長江鱘血液中K+的含量較低,Na+、Cl-、Ca2+和Mg2+含量略高,總體上,人工養(yǎng)殖長江鱘血清離子含量略高于中華鱘。通常鱘類可進行低滲調(diào)節(jié)和高滲調(diào)節(jié),當滲透調(diào)節(jié)達到平衡時,其體內(nèi)的血清離子達到新的平衡點。本研究表明,長江鱘血清離子的平衡點要高于中華鱘。由于長江鱘對鹽度的耐受能力取決于其滲透調(diào)節(jié)能力和能量代謝水平[34],而長江鱘屬于淡水性洄游魚類,與中華鱘相比,其鹽度耐受能力較弱,不需要提供比中華鱘更多的用于高滲調(diào)節(jié)的能量,因此其能量代謝可能較弱。

3.4 下一步研究計劃

我國科研人員于1983年首次攻克了長江鱘人工繁殖技術(shù),于2007年成功實現(xiàn)了全人工繁殖。中國水產(chǎn)科學研究院長江水產(chǎn)研究所也于2013—2015年連續(xù)3年進行長江鱘全人工繁殖并獲得了成功[35]。但目前長江鱘的野外繁殖尚未成功。國際自然與自然資源保護聯(lián)盟(IUCN)發(fā)布的全球瀕危物種紅色目錄的更新報告顯示,2022年7月21日,“中國淡水魚之王”白鱘被正式宣布為滅絕,中華鱘位列極危等級,長江鱘(達氏鱘)升級為野外滅絕[36],可見長江鱘野外種群已岌岌可危。為拯救保護長江鱘,我國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部組織編制并發(fā)布了《長江鱘(達氏鱘)拯救行動計劃(2018—2035年)》綱領(lǐng)性方案,積極開展長江鱘的搶救性保護工作,目前已經(jīng)取得了重大成效。然而,長江鱘的自然種群仍面臨著嚴重威脅,保護工作任重道遠。科學基礎(chǔ)研究是國家保護政策的指南針,本試驗是拯救行動研究項目中的一小部分,目前已獲取了一些基本參數(shù),對于后期開展研究積累了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。但由于長江鱘樣本數(shù)量有限,本試驗采樣條件較為單一,在以后的研究中,建議開展分季節(jié)、分時段采樣分析,爭取掌握長江鱘各血液指標的變幅及波動規(guī)律,為長江鱘的物種保護提供基礎(chǔ)資料。

4 結(jié)論

通過測定人工養(yǎng)殖長江鱘后備親體的血液生化指標,發(fā)現(xiàn)長江鱘不同個體間大部分血液生化指標變異較大,這可能與長江鱘生長狀況差異較大有關(guān)。通過對雌、雄個體的血液生化指標進行對比,發(fā)現(xiàn)不同性別個體血液中的K+含量差異顯著,其他指標則差異不顯著,因此可考慮將K+作為人工養(yǎng)殖長江鱘性別判定的依據(jù)。此外,人工養(yǎng)殖長江鱘后備親本的CORT、SOD、GSH-PX、K+、Na+與Cl-等血液生化指標變異系數(shù)<20%,可作為長江鱘狀態(tài)健康與否的參考監(jiān)測指標。