氨氮脅迫對翹嘴鱖幼魚抗氧化酶、消化酶活性及應激相關基因表達的影響

孫阿君 丁煒東 曹麗萍 曹哲明 邴旭文

(中國水產科學研究院淡水漁業研究中心,農業農村部淡水漁業和種質資源利用重點實驗室,無錫 214081)

氨氮是水產養殖中對魚類生長具有重要影響的一種環境因子。水體中的氨氮主要來自殘飼(餌)和魚的糞便等代謝產物[1]。大量研究表明,氨氮脅迫能使魚類產生氧化應激反應,進而導致魚體內抗氧化因子表達量和消化酶活性上調[2]。例如,甲魚(Pelodiscussinensis)[3]在受到氨氮脅迫時,其肝臟抗氧化酶會急速升高;氨氮脅迫下喂食和禁食會誘導虹鱒(Oncorhynchusmykiss)[4]肝臟、腮中的抗氧化酶及相關免疫基因產生顯著變化。鯉(CyprinuscarpioLinnaeus)[5]、團頭魴(Megalobramaamblycephala)[6]、南方鯰(SilurusmeridionalisChen)[7-8]、奧尼羅非魚(Oreochromisniloticus♀×O.aureus♂)[9]、青魚(Mylopharyngodonpiceus)[10]、大刺鰍(Mastacembeluearmatus)[11]、白斑狗魚(Esoxlucius)[12]、單環刺螠(Urechisunicinctus)[13]和黃顙魚(Pelteobagrusfulvidraco)[14]等在受到氨氮脅迫時,其鰓、肝臟、腦和腎組織中的抗氧化酶系統會被激活,以清除有害物質。由超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、谷胱甘肽(glutathione,GSH)、過氧化氫酶(catalase,CAT)和脂質過氧化物(lipid peroxide,LPO)組成的抗氧化系統在保護魚體的應激過程中起重要的作用[15],其中SOD和CAT可以清除O2-,GSH和LPO可以清除體內過量的活性氧和有害物質,保護機體免受氨氮脅迫[16]。氨氮脅迫也會誘導魚體內相關基因表達的變化。如黃顙魚幼魚在氨氮脅迫下,IL-1β、HSP90α、TNF-α和IL-8的基因表達量顯著上調[17]。

隨著高密度養殖技術的發展,氨氮已成為影響翹嘴鱖規模化養殖的主要環境因子之一。有研究表明,鱖魚對氨氮的耐受力極低[18]。長期低濃度的氨氮脅迫會影響鱖魚肝臟SOD、CAT、GSH的活力,誘導IL-1β,TNF-α等基因表達量升高[19]。目前對鱖魚幼魚在氨氮脅迫下肝臟抗氧化系統和胃消化酶活性的研究報道不多。本試驗以翹嘴鱖幼魚為研究對象,分析不同氨氮濃度脅迫下,翹嘴鱖幼魚肝臟和胃中抗氧化酶、消化酶和相關基因表達的變化情況,以期為翹嘴鱖養殖生產過程中的水質管理提供參考。

1 材料和方法

1.1 試驗用魚

試驗用翹嘴鱖幼魚來自中國水產科學研究院淡水漁業研究中心養殖基地。試驗前在室內水桶內暫養14 d,每天足食投喂餌料魚并及時清理糞便,確保水體清潔。試驗魚體質量為(15.27±0.67)g,體長為(13.42±0.53)cm。

1.2 試驗方法

試驗共設置6個分子氨脅迫濃度組(分子氨質量濃度分別為0、3.3、6.6、9.9、13.2、16.5 mg/L,相應的氨氮質量濃度為0、10、20、30、40、50 mg/L),其中氨氮質量濃度為0 mg/L的為對照組。

氨氮脅迫濃度采用相應劑量的氯化銨(NH4Cl)(國藥集團化學試劑有限公司,北京)溶解配制而成。每個試驗組投放30尾翹嘴鱖幼魚于400 L的試驗水桶內,共使用試驗魚180尾。氨氮脅迫時長為96 h。試驗期間,保持水質清新,確保溶解氧充足,每天進行氨氮濃度檢測,確保試驗中氨氮濃度符合試驗設計濃度。試驗設置3個重復。

氨氮對翹嘴鱖的半致死濃度設5個試驗組,分子氨質量濃度分別為0、3.3、6.6、13.2、26.4 mg/L(相應的氨氮質量濃度為0、10、20、40、80 mg/L)。每組設3個平行,每組采用10尾魚進行試驗,共用150尾魚。

1.3 樣品采集

試驗結束后,采用MS-222(50 mg/L)麻醉試驗魚后進行解剖取樣。主要采集翹嘴鱖的肝臟組織進行相關基因表達水平的檢測。采集的組織樣本使用RNA保護劑并保存于-80 °C冰箱,另保存1份樣本進行相關酶活性測定。

1.4 指標測定

1.4.1 總RNA提取和基因表達水平測定

每份肝臟樣品取0.1 g,按照TRIzon Reagent(康為世紀生物科技有限公司,北京)說明書進行RNA提取,使用超微量分光光度計檢測總RNA純度和濃度,將總RNA溶液稀釋至500 ng/μL。cDNA采用HIFIscript cDNA Synthesis Kit(康為世紀生物科技有限公司,北京)合成。

試驗中所用的引物見表1。引物采用Primer Blast(NCBI,USA)程序設計,基因序列來源于NCBI數據庫,其中以β-actin進行均一化處理。所用引物交由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。實時熒光定量檢測試劑盒購自康為世紀生物科技有限公司(北京),RT-PCR反應體系(共20 μL)為:10 μL 2×UltraSYBR Mixture、0.4 μL Forward Primer、0.4 μL Reverse Primer、0.8 μL Template DNA、8.4 μL ddH2O。RT-PCR反應程序設定為:95 °C預變性10 min,1個循環;95 °C變性10 s,60 °C退火30 s,72 °C延伸32 s,39個循環;最后60 °C退火30 s,1個循環。擴增完成后測定產物的熔解曲線。基因相對定量表達分析使用2-△△Ct法。

表1 RT-PCR分析所用引物序列

1.4.2 酶活性檢測

檢測指標為谷胱甘肽(GSH)、超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、脂質過氧化物(LPO)、胃蛋白酶(pepsin)、胃淀粉酶(AMS)和胃脂肪酶(LPS)。以上各酶活檢測試劑盒均購自南京建成生物研究所。檢測方法:加入0.9 g生理鹽水于0.1 g待測樣品中,在4 ℃條件下,以3 000 r/min離心10 min,取上清液制備樣品,然后根據檢測說明書進行下一步操作,使用分光光度計檢測相應的OD值(光密度)。

1.5 數據處理和統計分析

試驗數據使用SPSS 20.0軟件進行分析,用EXCEL 2010軟件作圖,先采用獨立樣本t檢驗進行統計分析,并對不同氨氮濃度脅迫組的試驗結果進行單因素方差分析。設P<0.05為差異顯著。半致死濃度(LD50)和死亡率按以下公式計算:

LD50=lg-1[X-i(∑p-0.5)]

(1)

死亡率=死亡數/總數×100%

(2)

式(1)中,X為最大死亡率組分子氨的質量濃度對數;i為相鄰分子氨質量濃度比值的對數(此處i為log1.43);∑p為各組死亡率總和。

2 結果

2.1 翹嘴鱖幼魚96 h氨氮暴露半致死濃度測定

將翹嘴鱖幼魚置于不同氨氮濃度的水體中,幼魚表現為躁動不安、四處游動,其反應時長和程度隨著氨氮質量濃度的升高而增加(見表2)。當脅迫初期過后,幼魚尾鰭不同程度地向內側彎呈弓形,在氨氮質量濃度為80 mg/L的試驗組中,幼魚尾鰭彎折與身體幾乎呈直角,幼魚游動遲緩,逐漸沉于水底。經計算,翹嘴鱖幼魚氨氮脅迫96 h的氨氮半致死質量濃度(LD50)為44.90 mg/L。

表2 不同氨氮濃度脅迫對翹嘴鱖幼魚死亡率的影響

2.2 氨氮脅迫對翹嘴鱖幼魚肝臟抗氧化酶活性的影響

由圖1可見,在96 h急性氨氮脅迫后,隨著氨氮質量濃度的提高,各試驗組翹嘴鱖幼魚肝臟的SOD、CAT、GSH活性均呈現先升高后降低的趨勢,LPO活性則呈逐漸升高的趨勢。

注:圖中上標字母不同表示不同濃度組間差異顯著(P<0.05),上標字母相同表示不同濃度組間差異不顯著(P<0.05);上標“*”表示試驗組與對照組之間差異顯著(P<0.05)。

當氨氮質量濃度為20 mg/L時,試驗組肝臟GSH含量顯著高于對照組(P<0.05),且達到最高值,為對照組的1.24倍;當氨氮質量濃度為50 mg/L時,試驗組肝臟GSH顯著低于對照組(P<0.05),且達到最低值,為對照組的0.58倍(見圖1-a)。

當氨氮質量濃度為30 mg/L時,試驗組肝臟SOD活性顯著高于對照組(P<0.05),且達到最高值,為對照組的1.32倍;當氨氮質量濃度為50 mg/L時,試驗組SOD顯著低于對照組(P<0.05),達到最低值,為對照組的0.60倍(見圖1-b)。

當氨氮質量濃度為30 mg/L時,試驗組肝臟CAT活性顯著高于對照組(P<0.05),且達到最高值,為對照組的1.69倍(見圖1-c)。

當氨氮質量濃度為50 mg/L時,試驗組肝臟LPO活力顯著高于對照組(P<0.05),達到最高值,為對照組的3.17倍(見圖1-d)。

2.3 氨氮脅迫對翹嘴鱖幼魚肝臟中應激相關基因表達的影響

隨著氨氮脅迫濃度的增加,試驗組IL-1β基因的相對表達量呈先升高后降低的變化趨勢。當氨氮質量濃度為40 mg/L時,試驗組肝臟IL-1β基因的表達量顯著高于對照組(P<0.05),達到最高值,為對照組的4.31倍(見圖2-a)。

注:圖中上標字母不同表示不同濃度組間差異顯著(P<0.05),上標字母相同表示不同濃度組組間差異不顯著(P<0.05);上標“*”表示試驗組與對照組差異顯著(P<0.05)。

隨著氨氮脅迫濃度的增加,試驗組TNF-α基因的相對表達量呈逐漸升高的變化趨勢。當氨氮質量濃度為50 mg/L時,試驗組肝臟TNF-α基因的表達量達到最高,為對照組的1.88倍(見圖2-b)。

隨著氨氮脅迫濃度的增加,試驗組肝組織中IL-8基因的相對表達量呈現降低-升高-降低的變化趨勢。當氨氮質量濃度為40 mg/L時,試驗組肝臟IL-8基因的表達量顯著高于對照組(P<0.05),達到最高值,為對照組的1.68倍(見圖2-c)。

隨著氨氮脅迫濃度的增加,試驗組肝組織中HSP90α基因相對表達量的變化趨勢為先升高后降低。當氨氮質量濃度為40 mg/L時,試驗組肝臟HSP90α基因的表達量顯著高于對照組(P<0.05),達到最高值,為對照組的3.39倍(見圖2-d)。

2.4 氨氮脅迫對翹嘴鱖幼魚胃消化酶活性的影響

由圖3可見,在96 h急性氨氮脅迫后,隨著脅迫濃度的升高,各試驗組翹嘴鱖幼魚的胃蛋白酶活性呈現先升高后降低的變化趨勢,AMS、LPS活性均呈現逐漸升高的變化趨勢。

注:圖中上標不同字母表示不同濃度組間差異顯著(P<0.05),上標有相同字母表示不同濃度組組間差異不顯著(P<0.05);上標“*”表示試驗組與對照組差異顯著(P<0.05)。

當氨氮質量濃度為40 mg/L時,試驗組幼魚的胃蛋白酶活性顯著高于對照組(P<0.05),達到最高值,為對照組的1.44倍(見圖3-a)。

當氨氮質量濃度為40 mg/L時,試驗組幼魚的胃AMS活性顯著高于對照組(P<0.05),達到最高值,為對照組的1.36倍(見圖3-b)。

當氨氮質量濃度為50 mg/L時,試驗組幼魚的胃LPS活性顯著高于對照組(P<0.05),達到最高值,為對照組的1.81倍(見圖3-c)。

3 討論

3.1 不同濃度氨氮脅迫對翹嘴鱖幼魚肝臟抗氧化酶活性的影響

魚類體內的抗氧化系統由抗氧化酶(如SOD、CAT等)與抗氧化物質(如GSH等)構成,在代謝分解活性氧自由基(reactive oxygen species,ROS)和抗氧化應激過程中起著至關重要的作用[20]。張紅梅等[21]研究發現,在不同氨氮脅迫條件下,黃河鯉魚(CyprinuscarpiohaematopterusTemmink et Schlegel)血清中的SOD、CAT和GSH酶活力隨著氨氮濃度的升高呈現先升高后降低的變化趨勢。在低濃度分子氨條件下,南方鯰(SilurusmeridionalisChen)[8]具有相對較高的SOD活力,而在高濃度分子氨條件下,SOD的活力反而下降。洪美玲等[22]在中華絨螯蟹(Eriocheirsinensis)的氨氮脅迫研究中也發現,高濃度的氨氮脅迫能夠抑制機體的抗氧化能力,導致中華絨螯蟹體內ROS濃度持續累積,應激反應進一步加劇。當墨魚(Sepiapharaonis)[23]受到不同濃度的氨氮脅迫時,其體內SOD、CAT的表達量也隨著脅迫濃度的升高而呈先升后降的趨勢。在本研究中,翹嘴鱖幼魚肝臟的SOD、CAT和GSH含量呈現低濃度脅迫時升高、高濃度脅迫時降低的變化趨勢。這與已有的研究結果相一致。說明在低濃度氨氮脅迫下,魚類體內ROS升高誘發氧化應激反應,抗氧化酶活性上升以清除ROS。隨著氨氮濃度的不斷升高,抗氧化系統清理ROS的能力下降,機體組織、細胞嚴重損傷,酶活力下降,從而導致魚類氨中毒[24]。ROS濃度的上升將加劇機體的脂質過氧化反應水平,脂質過氧化物LPO將不斷累積。李永[25]在斑節對蝦(Penaeusmonodon)的氨氮脅迫研究中發現,對蝦體內的LPO含量隨著氨氮脅迫濃度的增加而升高。三角帆蚌(Hyriopsiscumingii)[26]在受到氨氮脅迫初期時,其LPO含量沒有發生顯著性變化,但是隨著暴露時間的增加,其肝胰腺和鰓組織中的LPO含量顯著升高。在本研究中,低濃度(質量濃度10 mg/L)氨氮脅迫條件下,翹嘴鱖幼魚體內的LPO含量沒有顯著變化,這說明在低濃度的氨氮脅迫下,機體的抗氧化系統能夠及時清除過多的ROS[27]。但隨著氨氮質量濃度的提高,試驗組幼魚肝臟LPO含量持續升高,說明隨著幼魚體內ROS的不斷累積,氨的促氧化作用超過了機體的抗氧化作用,因而其體內發生脂質過氧化,LPO活性也不斷升高[28]。由此可見,低濃度氨氮脅迫能夠誘導激活機體的抗氧化系統并及時清理ROS,而高濃度氨氮脅迫能夠對機體造成氧化損傷,導致魚類的抗氧化能力下降,影響生理代謝活動甚至導致其應激死亡[29]。

3.2 不同濃度氨氮脅迫對翹嘴鱖幼魚肝臟應激相關基因表達的影響

氨氮脅迫能夠導致魚類產生炎癥反應,從而導致相關基因表達量的改變[30]。Cheng等[31]在對暗紋東方鲀(Takifuguobscurus)的72 h急性氨氮脅迫研究中發現,隨著氨氮濃度的升高,應激相關基因TNF-α的表達量顯著上調,IL-6、IL-12基因的表達量呈先升高后降低的變化趨勢。黃顙魚(Pelteobagrusfulvidraco)[17]在氨氮脅迫下,TNF-α、IL-1和IL-8基因的表達量顯著增加,暗紋東方鲀[31]肝臟TNF-α、IL-6 mRNA的表達量在氨氮脅迫下也會顯著升高。本研究中,在低濃度氨氮脅迫下,翹嘴鱖幼魚肝臟TNF-α、IL-1、IL-8基因的相對表達量變化較小,表明幼魚機體的反應較小;隨著氨氮濃度的增加,幼魚應激相關基因表達量顯著上調。這可能是因為氨氮濃度的持續升高導致機體氧化應激程度增強,ROS的大量累積加劇了機體氧化損傷的程度,誘導相關基因持續上調。在本研究中,翹嘴鱖幼魚IL-1、IL-8基因的表達量在氨氮質量濃度為50 mg/L時呈現下降趨勢,這可能與在高濃度脅迫條件下幼魚機體受到較強的氧化損傷,其免疫功能下降有關,而TNF-α基因表達量的持續上升,可能是在機體反應加劇的情況下出現的代償性表達。周鑫等[32]在對草魚(Ctenopharyngodonidella)的急性氨氮脅迫研究中發現,隨著氨氮濃度的增加,草魚肝組織中HSP90基因的表達模式為先上升后下降,并在氨氮質量濃度為104 mg/L時達到最高值。暗紋東方鲀[31]在受到氨氮脅迫時,其HSP基因mRNA表達量會顯著上升,在虹鱒[33]幼魚受氨氮脅迫時,檢測其HSP基因表達量也可獲得類似的結果。在本研究中,當氨氮質量濃度為0～40 mg/L時,試驗組幼魚肝臟HSP90α基因的表達量隨著氨氮濃度的升高而增加,這說明氨氮脅迫能夠誘導機體上調HSP90α基因的表達量以修復變性蛋白,當氨氮質量濃度為50 mg/L時,試驗組HSP90α基因的表達量急劇下降,這可能與高濃度氨氮濃度下,機體的氧化損傷持續增加,機體自我修復功能部分喪失有關[34]。

3.3 不同濃度氨氮脅迫對翹嘴鱖幼魚胃囊消化酶活性的影響

氨氮脅迫對魚類的影響是多方面的,在高濃度持續性的氨氮脅迫條件下,魚類消化系統受到影響,導致能量供應沖突,進而機體生理代謝紊亂,甚至會導致死亡。許星鴻等[35]發現,日本蟳(Charybdisjaponica)的消化酶含量及同工酶表達量受到亞硝態氮脅迫的顯著影響,在低濃度脅迫下表現為持續上升,在高濃度脅迫下表現為先升高后降低的變化趨勢。譚春明等[36]研究發現,東風螺(Babyloniaareolata)在受到氨氮急性脅迫時,其胃蛋白酶活力隨著時間的推移呈“誘導-抑制”的變化趨勢。劉亞娟等[37]進行了尖吻鱸(Latescalcarifer)稚魚急性氨氮脅迫試驗,結果表明,尖吻鱸稚魚為了補充機體能力的消耗,其消化酶活性會呈現不同程度的升高。在本研究中,隨著氨氮濃度的不斷升高,試驗組翹嘴鱖幼魚胃囊AMS、LPS、胃蛋白酶的活性呈現升高的變化趨勢。徐武杰等[38]認為,這是一種生物體在有毒物質作用下產生的毒性興奮效應,環境中氨氮濃度的變化激活了機體的抗氧化系統,誘導因子、細胞修復因子等多種細胞基因的表達,提高了生物體的能量需求,進而誘導消化酶活性升高[39]。

4 小結

鱖魚高密度養殖面臨的問題之一是水體中氨氮含量的升高使得鱖魚常常處于氨氮的應激之下。本研究通過開展不同濃度氨氮脅迫下的翹嘴鱖幼魚試驗,結果表明,不同濃度的急性氨氮脅迫會使幼魚肝臟的抗氧化酶SOD、CAT、GSH呈先升高后下降的變化趨勢,LPO呈逐漸升高的變化趨勢;其免疫相關基因IL-1β、HSP90α和IL-8的表達量總體呈先升高后降低的變化趨勢,TNF-α表達量呈逐漸升高的變化趨勢;其胃消化酶中的胃蛋白酶呈先升高后降低的變化趨勢,AMS和LPS呈逐漸升高的變化趨勢。研究表明,在氨氮脅迫條件下,翹嘴鱖幼魚會通過誘導抗氧化酶活性升高、應激相關基因表達上調以應對氧化應激損傷,同時誘導提高胃消化酶的活性,為機體提供能量。