miR-146a調(diào)控TLR4/NF-κB通路對腦出血模型大鼠的保護(hù)作用及機(jī)制研究

吳俊波 楊杰 肖鋒 李金亮

（1.萍鄉(xiāng)市第二人民醫(yī)院，萍鄉(xiāng) 337000； 2.萍鄉(xiāng)市第三人民醫(yī)院，萍鄉(xiāng) 337099）

腦出血多見于中老年人，其病因復(fù)雜，可由高血壓、情緒起伏大等因素引起［1-2］。腦出血病情發(fā)展迅速，血管破裂后，出血灶血液壓迫周圍腦組織，并發(fā)腦水腫、腦移位、腦疝等，治療不及時會造成半身不遂、身體麻痹、癡呆等后遺癥［3-5］。目前腦出血后炎癥損傷是臨床研究熱點。腦出血發(fā)生后，病灶附近小膠質(zhì)細(xì)胞被激活，引發(fā)炎癥反應(yīng)，TLR4作為模式識別受體在小膠質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)，參與機(jī)體免疫及炎癥反應(yīng)，TLR4被激活后促進(jìn)炎癥因子過表達(dá)［6］。NF-κB位于TLR4下游，被激活后加重炎癥反應(yīng)，不利于改善腦出血后繼發(fā)性損傷［7］。研究表明，大鼠腦缺血再灌注后伴有腦組織TLR4、NF-κB陽性表達(dá)增加［8］。目前研究指出，miRNAs可減輕腦缺血動物模型炎癥反應(yīng)，減少神經(jīng)元細(xì)胞凋亡［9］。研究還指出，miR-146a通過調(diào)控其相關(guān)靶基因發(fā)揮抗炎作用，通過抑制靶基因水平緩解炎癥反應(yīng)［10］。本研究旨在探索miR-146a對腦出血模型大鼠神經(jīng)功能及炎癥因子的影響并研究其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 清潔級成年SD雄性大鼠，12周齡，體質(zhì)量220～250 g，于鼠籠中飼料喂養(yǎng)，飲水自由，光照充足，室溫20～25 ℃，相對濕度45%～55%（倫理批號：ACU20-396）。

1.2 方法

1.2.1 實驗分組及腦出血模型大鼠構(gòu)建 選取40只大鼠，隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、過表達(dá)miR-146a腺病毒注射組（腺病毒組）及陰性病毒注射組（陰性病毒組），每組10只。腹腔注射10%水合氯醛麻醉大鼠，右側(cè)股動脈采血，將大鼠俯臥位固定，切開皮膚，暴露前囟，微量注射器于前囟前0.2 mm、右側(cè)中線旁開3.0 mm、冠狀縫前0.2 mm鉆孔，孔直徑3.0 mm；翻轉(zhuǎn)分離尾動脈，微量進(jìn)樣器穿刺抽血50 μl，50 μl自體血于5 min內(nèi)勻速注射，留針15 min緩慢退出，無菌骨臘封閉顱骨小孔。假手術(shù)組步驟相同，注射等量生理鹽水。過表達(dá)miR-146a腺病毒注射組取3×1013U/ml病毒滴度腺病毒50 μl，與自體血一次性注射至基底節(jié)部位。

1.2.2 大鼠神經(jīng)功能評分 Garcia評分包括體態(tài)對稱性、自主運動狀況、前肢伸展運動能力、網(wǎng)屏實驗、本體感覺、兩側(cè)的觸須反應(yīng)、兩側(cè)身體的觸覺反應(yīng)等［11］，總分3～18分，分?jǐn)?shù)越低，神經(jīng)功能越差。

1.2.3 大鼠血腫周圍病理組織改變 0.35 ml/100 g 1%水合氯醛麻醉后處死大鼠，解剖大鼠血腫周圍（2.0～3.0 mm）腦組織于4%多聚甲醛固定48 h，脫鈣，石蠟包埋，制成切片，厚度5 μm，脫蠟，梯度乙醇水洗后復(fù)染，沖洗，0.5%鹽酸乙醇分化3 s，沖洗，復(fù)染，95%乙醇脫水2 min，重復(fù)，二甲苯透明5 min，重復(fù)，中性樹膠封片。

1.2.4 大鼠炎癥因子表達(dá) 取大鼠腦組織，添加RIPA裂解液（1 ml/100 mg）勻漿，1 000 r/min離心20 min，留上清，ELISA檢測IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α表達(dá)，操作步驟嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行。

1.2.5 大鼠腦組織TLR4、NF-κB蛋白表達(dá) 取留存大鼠腦組織，添加RIPA裂解液（1 ml/100 mg）勻漿，收集腦組織總蛋白，BCA試劑盒檢測蛋白濃度，取30 μl處理后的蛋白樣品，SDS-PAGE電泳，PVDF轉(zhuǎn)膜，以GAPDH為內(nèi)參。配制5%脫脂奶粉封閉液，添加TLR4、NF-κB一抗4 ℃孵育過夜，室溫孵育二抗2 h，ECL顯色，計算和分析蛋白相對灰度值。

1.2.6 大鼠腦組織TLR4、NF-κB mRNA表達(dá) 取5.0 mm3大鼠腦組織研磨，添加Trizol（50 mg/ml）裂解細(xì)胞，提取總RNA，加入Trizol與樣品（3∶1），混勻，靜置5 min，加入200 μl氯仿，靜置，離心，取上層RNA，加入異丙醇，靜置，離心，留沉淀，加入75%無水乙醇離心，棄上清，室溫干燥RNA 10 min，加DEPC水溶解RNA，測定RNA濃度及純度。取1 μg總RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，得到cDNA進(jìn)行實時熒光定量PCR，以GAPDH為內(nèi)參，2-ΔΔCt計算目的基因表達(dá)。引物序列見表1。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS21.0軟件分析數(shù)據(jù)，計量資料以記錄，組間比較采用單因素方差分析及LSD-t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠神經(jīng)功能評分比較 與假手術(shù)組相比，模型組、腺病毒組、陰性病毒組大鼠神經(jīng)功能評分降低（P＜0.05）；與模型組相比，腺病毒組大鼠神經(jīng)功能評分升高（P＜0.05），陰性病毒組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05，表2）。

表2 神經(jīng)功能評分（，n=10）Tab.2 Neurological function scores （，n=10）

表2 神經(jīng)功能評分（，n=10）Tab.2 Neurological function scores （，n=10）

Note：1）P＜0.05 vs control group； 2）P＜0.05 vs model group.

Neurological function score/score 16.10±1.20 6.80±0.631）12.50±1.582）6.60±0.70 177.677 0.000 Groups Control Model Adenovirus Negative virus F P

2.2 各組大鼠血腫周圍病理組織改變 假手術(shù)組大鼠腦組織細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)完整，排列整齊，無水腫及炎癥細(xì)胞浸潤；模型組大鼠腦組織細(xì)胞形態(tài)異常，間隙增大，部分神經(jīng)細(xì)胞壞死，出現(xiàn)水腫及炎癥細(xì)胞浸潤；腺病毒組大鼠腦組織水腫范圍變小、程度減輕，炎癥細(xì)胞浸潤減輕，細(xì)胞周圍間隙變小；陰性病毒組腫脹程度仍較明顯，可見明顯炎癥浸潤（圖1）。

圖1 血腫周圍病理組織改變Fig.1 Pathological changes around hematoma

2.3 各組大鼠炎癥因子表達(dá) 與假手術(shù)組相比，模型組大鼠炎癥因子水平均升高（P＜0.05）；與模型組相比，腺病毒組大鼠炎癥因子水平均下降（P＜0.05，表3）。

表3 各組大鼠IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α表達(dá)（，n=10，pg/ml）Tab.3 Expressions of IL-1β， IL-6， IL-8 and TNF-α of rats in each group （，n=10，pg/ml）

表3 各組大鼠IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α表達(dá)（，n=10，pg/ml）Tab.3 Expressions of IL-1β， IL-6， IL-8 and TNF-α of rats in each group （，n=10，pg/ml）

Note：1）P＜0.05 vs control group； 2）P＜0.05 vs model group.

TNF-α 4.58±0.20 9.26±0.981）5.47±0.282）8.81±0.87 120.943 0.000 Groups Control Model Adenovirus Negative virus F P IL-1β 3.82±0.25 14.69±1.551）4.91±0.332）13.88±1.41 289.817 0.000 IL-6 2.96±0.23 9.44±1.401）3.55±0.382）8.96±1.22 129.884 0.000 IL-8 1.06±0.05 2.63±0.151）1.33±0.062）2.43±0.10 632.311 0.000

2.4 各組大鼠腦組織TLR4、NF-κB蛋白表達(dá) 與假手術(shù)組相比，模型組大鼠TLR4、NF-κB蛋白表達(dá)均增加（P＜0.05）；與模型組相比，腺病毒組大鼠TLR4、NF-κB蛋白表達(dá)均下降（P＜0.05），陰性病毒組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05，圖2、表4）。

圖2 各組大鼠腦組織TLR4、NF-κB蛋白表達(dá)Fig.2 Expressions of TLR4 and NF-κB proteins in brain tissues of rats in each group

表4 各組大鼠腦組織TLR4、NF-κB蛋白表達(dá)（，n=10）Tab.4 Expressions of TLR4 and NF-κB proteins of rat brain tissues in each group （，n=10）

表4 各組大鼠腦組織TLR4、NF-κB蛋白表達(dá)（，n=10）Tab.4 Expressions of TLR4 and NF-κB proteins of rat brain tissues in each group （，n=10）

Note：1）P＜0.05 vs control group； 2）P＜0.05 vs model group.

NF-κB 0.48±0.17 1.03±0.341）0.53±0.202）0.99±0.30 12.611 0.000 Groups Control Model Adenovirus Negative virus F P TLR4 0.21±0.09 0.69±0.181）0.23±0.102）0.58±0.15 33.593 0.000

2.5 大鼠腦組織TLR4、NF-κB mRNA表達(dá) 與假手術(shù)組相比，模型組大鼠TLR4、NF-κB mRNA表達(dá)均增加（P＜0.05）；與模型組相比，腺病毒組大鼠TLR4、NF-κB mRNA表達(dá)均下降（P＜0.05），陰性病毒組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05，表5）。

表5 大鼠腦組織TLR4、NF-κB mRNA表達(dá)（，n=10）Tab.5 mRNA expressions of TLR4 and NF-κB in rat brain tissues （，n=10）

表5 大鼠腦組織TLR4、NF-κB mRNA表達(dá)（，n=10）Tab.5 mRNA expressions of TLR4 and NF-κB in rat brain tissues （，n=10）

Note：1）P＜0.05 vs control group； 2）P＜0.05 vs model group.

NF-κB 1.06±0.11 1.88±0.361）1.08±0.142）1.85±0.30 33.508 0.000 Groups Control Model Adenovirus Negative virus F P TLR4 1.15±0.10 2.24±0.481）1.23±0.142）2.01±0.45 26.246 0.000

3 討論

腦出血患者顱內(nèi)血腫部分易壓迫周圍完好腦組織，給腦細(xì)胞帶來嚴(yán)重?fù)p害，患者可能出現(xiàn)半身不遂、身體麻痹、癡呆等后遺癥，具有較高的致殘率和病死率，給患者及其家庭帶來較大負(fù)擔(dān)［12］。研究指出，腦出血患者紅細(xì)胞裂解、炎癥反應(yīng)增加，一定程度增加腦水腫發(fā)生風(fēng)險，給患者造成更嚴(yán)重?fù)p害，從而引起患者預(yù)后不良［13］。腦出血患者血腫部分炎癥反應(yīng)是預(yù)后的重要影響因素，也是現(xiàn)階段臨床研究熱點。腦出血炎癥反應(yīng)與信號通路、基因表達(dá)、炎癥因子水平等相關(guān)，作用機(jī)制復(fù)雜。研究表明，NF-κB信號通路參與腦出血患者腦組織炎癥反應(yīng)發(fā)生發(fā)展，NF-κB可與相對應(yīng)靶基因相結(jié)合，調(diào)控其表達(dá)，在對應(yīng)mRNA作用下，調(diào)控Th1、Th2相關(guān)炎癥因子水平，影響炎癥反應(yīng)進(jìn)程［14］。miRNAs也與腦出血發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，其中，過表達(dá)miR-146a可降低腦出血后炎癥介質(zhì)水平，如IL-6、IL-8等，減輕腦出血后炎癥反應(yīng)，減少細(xì)胞死亡，保護(hù)神經(jīng)［15］。本研究旨在探索miR-146a對腦出血模型大鼠神經(jīng)功能及炎癥因子的影響并研究其作用機(jī)制。

miR-146a在機(jī)體病毒入侵、免疫紊亂、炎癥反應(yīng)中具有重要作用。miR-146a調(diào)控對應(yīng)靶基因影響相關(guān)因子表達(dá)，活化IRAK1及TNF受體相關(guān)因子TRAF6，使NF-κB移位入核，促進(jìn)炎癥因子激活，呈過表達(dá)［16］。近年越來越多的研究發(fā)現(xiàn)miR-146a在炎癥反應(yīng)、免疫應(yīng)答、神經(jīng)系統(tǒng)、癌癥、腦出血等中異常表達(dá)，成為臨床研究重點［17］。TLR4/NF-κB通路參與腦出血后炎癥損傷進(jìn)程，其中NF-κB是通路關(guān)鍵靶點，腦出血患者出現(xiàn)NF-κB活化，促進(jìn)炎癥因子過表達(dá)，加重炎癥反應(yīng)，另外，炎癥因子又能激活NF-κB，使炎癥嚴(yán)重程度進(jìn)一步加重，損害腦組織［18］。TLR4也與機(jī)體炎癥反應(yīng)密切相關(guān)，與對應(yīng)配體結(jié)合將信號轉(zhuǎn)導(dǎo)至Toll樣受體/白介素-1受體同源域，激活NF-κB，促進(jìn)炎癥因子過表達(dá)，放大炎癥效應(yīng)，長此以往，惡性循環(huán)，加重腦出血引發(fā)的繼發(fā)性炎癥損傷［19］。由此猜測抑制TLR4/NF-κB信號通路活化可能減輕腦出血患者炎癥反應(yīng)，改善預(yù)后，延長生存時間。

通過Garcia評分研究miR-146a對腦出血模型大鼠神經(jīng)功能的影響，發(fā)現(xiàn)腦出血大鼠神經(jīng)功能嚴(yán)重受損，而過表達(dá)miR-146a腺病毒組大鼠Garcia評分較模型組出現(xiàn)明顯回升，證實miR-146a過表達(dá)干預(yù)可改善腦出血后大鼠神經(jīng)功能損傷。本研究還發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠細(xì)胞形態(tài)異常，間隙增加，出現(xiàn)水腫及炎癥細(xì)胞浸潤，過表達(dá)miR-146a腺病毒注射組大鼠腦組織水腫、炎癥細(xì)胞浸潤減輕，細(xì)胞間隙變小，證實miR-146a可改善腦出血模型大鼠炎癥反應(yīng)。張浩等［20］研究指出，TLR4基因敲除小鼠體內(nèi)炎癥因子水平顯著下降，組織損傷也相對減輕。本研究還發(fā)現(xiàn)，腦出血模型大鼠均存在不同程度TLR4、NF-κB蛋白、基因及炎癥因子表達(dá)增加，過表達(dá)miR-146a腺病毒干預(yù)后，大鼠TLR4、NF-κB蛋白、基因及炎癥因子水平均有所回落，提示miR-146a對TLR4/NF-κB通路及相關(guān)炎癥因子具有調(diào)控作用。

綜上，miR-146a可減輕腦出血模型大鼠神經(jīng)功能及炎癥損傷，可能通過抑制腦出血模型大鼠腦組織TLR4/NF-κB信號通路激活，降低炎癥因子水平，但鑒于miR-146a靶點較多，本研究僅從蛋白、基因水平證實miR-146a抑制TLR4/NF-κB信號通路減輕神經(jīng)功能損傷及炎癥反應(yīng)，還需深入研究。