水飛薊賓抑制Fas/FasL信號通路對肺結核大鼠炎癥損傷及巨噬細胞凋亡的影響

王蓮珊 王家賢 鄭成芳 （海南西部中心醫院，儋州 571700）

肺結核（tuberculosis，TB）是結核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis，Mtb）感染肺部引起的炎癥損傷性疾病［1］。TB的根治方法非常有限，其較高的傳染性及致死率一直受到社會公共衛生的關注［2］。近年研究發現，肺部巨噬細胞外源性凋亡是導致Mtb感染加重及抗感染根治治療失敗的關鍵因素［3］。

細胞膜死亡受體Fas及其配體FasL（Fas/FasL）均可通過促進半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶8或3（caspase8/3）活化進而促進細胞凋亡［4］。已有研究發現，巨噬細胞可識別Mtb，并與蛋白溶酶體結合殺滅Mtb，發揮抗炎反應的過程中，Fas/FasL可通過caspase8/3途徑誘導感染的巨噬細胞凋亡，導致Mtb釋放，加重組織損傷［5］。提示抑制Fas/FasL及caspase8/3巨噬細胞凋亡途徑活化可能是治療TB的潛在策略。

水飛薊素具有抗菌、抗炎及免疫調節作用，常用于肝臟炎癥及纖維化等疾病的治療［6］。近年研究發現，水飛薊素可抑制Mtb體內及體外感染誘發的組織免疫炎癥損傷，提示水飛薊素可能是治療TB的潛在藥物［7］。水飛薊賓是水飛薊素的主要活性物質，其抗TB肺組織炎癥損傷的作用是否與抑制Fas/FasL介導的巨噬細胞凋亡有關尚未見報道。本研究通過建立大鼠TB模型對此進行驗證，以期為TB靶向藥物的研發及水飛薊賓的開發應用提供可靠資料。

1 材料與方法

1.1 材料 93只清潔級健康SD大鼠，雌雄不限，體質量200～220 g，7～8周齡，購自廣東至遠生物醫藥科技有限公司，生產許可證號：SCXK（粵）2021-0057；動物實驗符合3R原則，研究經海南西部中心醫院倫理委員會批準（ICAU-2021030428）。

水飛薊賓（貨號：YG11242，上海韻泰信息科技公司，規格20 mg）；結核分枝桿菌（Mtb）（貨號：19080312，中國藥品生物制品檢定所）；Fas過表達重組蛋白（pcDNA-Fas）及其陰性對照（pcDNA-NC）均由上海生工公司合成設計；TNF-α（貨號：R31733）、IL-6（貨號：R31744） ELISA試劑盒購自上海圻明生物科技公司；Annexin V-FITC/PI雙染細胞凋亡試劑盒（貨號：S0185XL，上海雅吉生物科技公司）；HE染色液（貨號：SY2022）、抗酸染色試劑盒（貨號：YT8837）購自北京伊塔生物科技公司；兔抗大鼠Fas、FasL、caspase8、caspase3、巨噬細胞炎癥蛋白（MIP-2）等抗體均購自美國Abcam公司；Cyto-FLEX流式細胞儀購自浙江貝克曼公司。

1.2 方法

1.2.1 模型建立及分組 取SD大鼠78只，參照文獻［8］方法制備Mtb液，并經尾靜脈注射5 mg/ml的Mtb液0.2 ml建立TB模型，造模后第2天，隨機取3只解剖，取肺組織，肉眼可見肺組織中出現白色結節或顆粒樣病灶，視為造模成功（75只），將造模成功的大鼠隨機分為模型組、水飛薊賓組、Fas過表達重組蛋白（pcDNA-Fas）組、pcDNA-Fas陰性對照（pcDNA-NC）組、水飛薊賓+pcDNA-Fas組，每組15只；另取15只大鼠，經尾靜脈注射0.2 ml生理鹽水，作為正常對照組。

各組均于造模分組后開始給藥，水飛薊賓組參照文獻［9］方法灌胃給予100 mg/kg水飛薊賓，1次/d；pcDNA-Fas組及pcDNA-NC組尾靜脈注射1 nmoL/L的pcDNA-Fas及pcDNA-NC試劑（含綠色熒光標記的GFP蛋白），200 μl/kg，每2 d給藥1次；水飛薊賓+pcDNA-Fas組給予水飛薊賓的同時給予pcDNA-Fas試劑；模型組及對照組灌胃給予10 ml/kg生理鹽水。各組連續給藥30 d，給藥期間觀察大鼠飲食、活動及死亡狀況。

1.2.2 肺泡巨噬細胞凋亡率檢測 各組大鼠麻醉后處死，切開氣管，結扎左肺，取5 ml生理鹽水灌洗右肺，得肺泡灌洗液，參照文獻［10］方法收集及純化肺泡灌洗液中的巨噬細胞，按AnnexinV-FITC/PI雙染試劑盒說明書方法孵育巨噬細胞，流式細胞儀測定肺泡巨噬細胞凋亡率。

1.2.3 抗酸染色檢測肺Mtb感染情況 取大鼠完整左肺組織，分成兩部分，一部分置于液氮中保存備用，另一部分于4%多聚甲醛中固定24 h后，制成5 μm厚石蠟切片，取部分石蠟切片，脫蠟、脫水及流水沖洗后，加苯酚復紅溶液37 ℃染色15 min，酸性乙醇脫色120 s，亞甲基藍復染30 s后，油鏡下觀察Mtb染色情況。

1.2.4 HE染色觀察肺組織病理變化 取左肺組織石蠟切片，根據HE染色液說明書方法染色后，置于光鏡下觀察拍照。

1.2.5 ELISA法檢測肺組織TNF-α、IL-6水平 取液氮中保存的肺組織，剪取0.5 g，粉碎、勻漿處理后，ELISA試劑盒檢測勻漿液中TNF-α、IL-6水平。

1.2.6 Western blot檢測肺組織蛋白表達 取液氮中保存的肺組織，冰上研磨勻漿后，提取勻漿液中的蛋白，BCA法檢測蛋白濃度，取40 μg蛋白進行電泳和電轉膜操作，封閉液封膜100 min后，濕盒中滴加1∶600的Fas、FasL、caspase8、caspase3、MIP-2一抗及1∶1 200的β-actin內參抗體孵育24 h，1∶1 600的HRP羊抗兔二抗37 ℃孵育80 min后，增強化學發光液顯影曝光，Image J軟件分析條帶相對灰度值。

1.2.7 pcDNA-Fas及pcDNA-NC靶向肺泡細胞、巨噬細胞判定 pcDNA-Fas及pcDNA-NC質粒中含綠色熒光標記的GFP蛋白，取pcDNA-Fas組及pc-DNA-NC組大鼠肺泡灌洗液中的巨噬細胞于熒光顯微鏡下觀察綠色熒光強度，液氮中保存的肺組織切成20 μm厚的冰凍切片若干，于熒光顯微鏡下觀察綠色熒光強度（以Image Pro Plus 6.0圖像系統檢測每5個視野下單位面積內綠色熒光染色的平均光密度值）。

2 結果

2.1 水飛薊賓對大鼠行為變化的影響 正常對照組大鼠無死亡，飲食及活動正常。模型組、pcDNANC組、水飛薊賓+pcDNA-Fas組大鼠各死亡2只，均出現不同程度的呼吸急促、喘息及毛發枯槁現象。水飛薊賓組無死亡，呼吸急促、喘息減輕。pcDNAFas組大鼠有4只死亡，呼吸急促及喘息現象加重。提示水飛薊賓能夠改善Mtb誘導的TB大鼠體征，過表達Fas能加重Mtb誘導的TB大鼠體征。

2.2 pcDNA-Fas及pcDNA-NC在肺組織及肺泡巨噬細胞中定向表達變化 熒光顯微鏡下觀察可見，pcDNA-Fas及pcDNA-NC組大鼠肺組織細胞及肺泡巨噬細胞表面均顯綠色熒光，且熒光強度差異無統計學意義（P＞0.05），提示pcDNA-Fas及pcDNA-NC試劑可定向分布于肺組織細胞及肺泡巨噬細胞表面。見圖1、表1。

表1 肺組織及肺泡巨噬細胞GFP綠色熒光強度比較（，mean optical density/mm2）Tab.1 Comparison of GFP green fluorescence intensity in lung tissue and alveolar macrophages （，mean optical density/mm2）

表1 肺組織及肺泡巨噬細胞GFP綠色熒光強度比較（，mean optical density/mm2）Tab.1 Comparison of GFP green fluorescence intensity in lung tissue and alveolar macrophages （，mean optical density/mm2）

Groups pcDNA-Fas pcDNA-NC n 11 13 Lung tissue 1.06±0.14 1.02±0.16 Alveolar macrophage 1.09±0.12 1.13±0.13

圖1 肺組織細胞及肺泡巨噬細胞GFP綠色熒光觀察Fig.1 GFP green fluorescence observation of lung tissue cells and alveolar macrophages

2.3 水飛薊賓及過表達Fas對大鼠肺組織炎癥因子TNF-α、IL-6水平的影響 與正常對照組相比，模型組大鼠肺組織炎癥因子TNF-α、IL-6水平升高（P＜0.05）。與模型組相比，水飛薊賓組大鼠TNF-α、IL-6水平降低（P＜0.05）；pcDNA-Fas組大鼠TNF-α、IL-6水平較模型組進一步升高（P＜0.05）。pcDNANC組TNF-α、IL-6水平與模型組相比差異無統計學意義（P＞0.05）。與水飛薊賓組相比，水飛薊賓+pcDNA-Fas組大鼠TNF-α、IL-6水平升高（P＜0.05），見表2。提示水飛薊賓可明顯改善TB模型大鼠的炎癥損傷，過表達Fas與水飛薊賓的作用正好相反，且能夠部分逆轉水飛薊賓對炎癥損傷的抑制作用。

表2 大鼠肺組織炎癥因子TNF-α、IL-6水平比較（，pg/g）Tab.2 Comparison of TNF-α， IL-6 levels in lung tissues of rats （，pg/g）

表2 大鼠肺組織炎癥因子TNF-α、IL-6水平比較（，pg/g）Tab.2 Comparison of TNF-α， IL-6 levels in lung tissues of rats （，pg/g）

Note：Compared with normal control group， 1）P＜0.05； compared with model group，2）P＜0.05；compared with Silybin group，3）P＜0.05.

IL-6 22.22±2.02 89.83±8.061）30.62±3.042）199.41±19.042）3）90.97±9.083）60.82±6.052）3）Normal control Model Silybin pcDNA-Fas pcDNA-NC Silybin+pcDNA-Fas 15 13 15 11 13 13 12.36±1.04 78.82±7.061）20.66±2.052）189.49±18.042）3）80.99±8.073）50.80±5.062）3）GroupsnTNF-α

2.4 水飛薊賓及過表達Fas對大鼠肺泡巨噬細胞凋亡率的影響 與正常對照組相比，模型組大鼠肺泡巨噬細胞凋亡率升高（P＜0.05）。與模型組相比，水飛薊賓組大鼠肺泡巨噬細胞凋亡率降低（P＜0.05）；pcDNA-Fas組大鼠肺泡巨噬細胞凋亡率較模型組進一步升高（P＜0.05）。pcDNA-NC組肺泡巨噬細胞凋亡率與模型組相比差異無統計學意義（P＞0.05）。與水飛薊賓組相比，水飛薊賓+pcDNA-Fas組大鼠肺泡巨噬細胞凋亡率升高（P＜0.05），見圖2、表3。提示水飛薊賓可降低TB模型大鼠肺泡巨噬細胞凋亡，而過表達Fas可使水飛薊賓的抗凋亡作用得以消除，至少是部分消除。

表3 各組大鼠肺泡巨噬細胞凋亡率比較（，%）Tab.3 Comparison of apoptosis rates of alveolar macrophages in each group （，%）

表3 各組大鼠肺泡巨噬細胞凋亡率比較（，%）Tab.3 Comparison of apoptosis rates of alveolar macrophages in each group （，%）

Note：Compared with normal control group， 1）P＜0.05； compared with model group，2）P＜0.05；compared with Silybin group，3）P＜0.05.

Apoptosis rate of 5.06±0.52 37.24±3.311）18.69±1.052）48.68±4.662）3）36.17±3.093）29.92±2.032）3）Groups Normal control Model Silybin pcDNA-Fas pcDNA-NC Silybin+pcDNA-Fas n 15 13 15 11 13 13

圖2 流式細胞術檢測肺泡巨噬細胞凋亡Fig.2 Apoptosis of alveolar macrophages detected by flow cytometry

2.5 水飛薊賓及過表達Fas對大鼠肺組織Mtb感染的影響 正常對照組肺組織無Mtb感染。模型組大鼠可見肺組織Mtb呈桿狀、串珠狀成團聚集，且紅染嚴重。與模型組相比，水飛薊賓組Mtb聚集減少，紅染變淺。pcDNA-Fas組大鼠Mtb團狀聚集及紅染加重。pcDNA-NC組Mtb聚集、紅染與模型組相近。水飛薊賓+pcDNA-Fas組大鼠紅染重于水飛薊賓組，見圖3。提示水飛薊賓可減輕TB大鼠肺部感染，而過表達Fas可使感染加重。

圖3 大鼠肺組織抗酸染色（×1 000）Fig.3 Acid-fast staining of rat lung tissue （×1 000）

2.6 水飛薊賓及過表達Fas對大鼠肺組織病理變化的影響 正常對照組大鼠肺組織無病理性改變。模型組、pcDNA-NC組大鼠肺組織呈干酪樣壞死纖維化，組織有充血，結核結節形成及炎癥細胞浸潤嚴重。水飛薊賓組大鼠肺組織干酪樣壞死、炎癥細胞浸潤緩解和形態改善顯著。pcDNA-Fas組大鼠肺組織干酪樣壞死纖維化、炎癥浸潤、充血最嚴重。水飛薊賓+pcDNA-Fas肺組織病變略重于水飛薊賓組，見圖4。提示水飛薊賓能明顯改善大鼠的肺部損傷，而過表達Fas可加速大鼠肺組織損傷。

圖4 大鼠肺組織HE染色（×200）Fig.4 HE staining of rat lung tissue （×200）

2.7 水飛薊賓及過表達Fas對大鼠肺組織蛋白表達的影響 與正常對照組相比，模型組大鼠肺組織Fas、FasL、caspase8、caspase3、MIP-2蛋白表達升高（P＜0.05）。與模型組相比，水飛薊賓組大鼠肺組織Fas、FasL、caspase8、caspase3、MIP-2蛋白表達降低（P＜0.05）。pcDNA-Fas組大鼠肺組織Fas、FasL、caspase8、caspase3、MIP-2蛋白表達較模型組進一步升高（P＜0.05）。pcDNA-NC組Fas、FasL、caspase8、caspase3、MIP-2蛋白表達與模型組相比差異無統計學意義（P＞0.05）。與水飛薊賓組相比，水飛薊賓+pcDNA-Fas組大鼠Fas、FasL、caspase8、caspase3、MIP-2蛋白表達升高（P＜0.05），見圖5、表4。提示水飛薊賓可抑制Fas/FasL依賴的caspase8/3信號活化，過表達Fas后水飛薊賓的抑制作用得到逆轉。

表4 各組大鼠肺組織Fas、FasL、caspase8、caspase3、MIP-2蛋白表達比較（）Tab.4 Comparison of Fas， FasL， caspase8， caspase3， MIP-2 protein expressions in lung tissues of rats in each group （）

表4 各組大鼠肺組織Fas、FasL、caspase8、caspase3、MIP-2蛋白表達比較（）Tab.4 Comparison of Fas， FasL， caspase8， caspase3， MIP-2 protein expressions in lung tissues of rats in each group （）

Note：Compared with normal control group， 1）P＜0.05； compared with model group， 2）P＜0.05； compared with Silybin group， 3）P＜0.05.

MIP-2/β-actin 1.05±0.16 2.19±0.211）1.36±0.132）2.85±0.282）3）2.12±0.203）1.81±0.182）3）Groups Normal control Model Silybin pcDNA-Fas pcDNA-NC Silybin+pcDNA-Fas n 15 13 15 11 13 13 Fas/β-actin 1.09±0.10 2.05±0.201）1.28±0.132）2.88±0.252）3）2.09±0.203）1.68±0.172）3）FasL/β-actin 1.03±0.10 2.00±0.181）1.20±0.122）2.98±0.242）3）1.98±0.193）1.69±0.152）3）caspase8/β-actin 1.09±0.10 2.17±0.201）1.43±0.142）2.83±0.202）3）2.16±0.213）1.72±0.152）3）caspase3/β-actin 1.07±0.08 2.27±0.201）1.29±0.122）2.79±0.202）3）2.23±0.233）1.87±0.182）3）

圖5 Western blot檢測各組大鼠肺組織Fas、FasL、caspase8、caspase3、MIP-2蛋白表達Fig.5 Fas， FasL， caspase8， caspase3， MIP-2 protein expressions in lung tissues of rats in each group

3 討論

我國TB發病率位居全球第二［11］。TB的主要致病菌——Mtb是傳染病中的頭號殺手，可破壞機體免疫功能，引起組織干酪樣壞死［12-13］。巨噬細胞是機體天然免疫系統中的重要效應細胞，是機體抵抗病原微生物的第一道防線，大量研究發現，Mtb侵入機體后，巨噬細胞迅速識別Mtb的抗原，并以內吞或抗原呈遞的方式啟動機體免疫，清除并抵抗Mtb進一步入侵組織細胞［14］。但近期研究發現，Mtb也可誘導巨噬細胞凋亡或形成無抗炎作用的泡沫細胞，以產生抗吞噬能力，進而促進其在機體宿主細胞內存活，并認為Mtb誘導的巨噬細胞凋亡是引起TB肺組織炎癥損傷、干酪樣壞死的重要原因［3，15］。本研究建立大鼠TB模型后發現，肺組織巨噬細胞凋亡率升高，Mtb在肺組織中成團聚集，肺組織結節形成及干酪樣壞死嚴重，炎癥細胞-白介素數目及炎癥因子TNF-α、IL-6表達升高，提示TB大鼠出現巨噬細胞凋亡、Mtb感染及肺組織炎癥損傷現象，表明造模成功。

目前臨床上主要以利福平、雷米封等藥物治療TB，但這些藥物治療療程較長，且對肝腎功能影響較大，不利于長期應用［16］。水飛薊賓對TB藥物治療引起的肝腎功能具有保護作用。石清紅等［17］發現水飛薊素中的水飛薊賓具有穩定肝細胞膜、促進肝細胞再生等作用，且能降低抗結核藥物治療期間肝損傷的發生風險。DE OLIVEIRA等［18］發現，水飛薊賓中的類黃酮羥基酚類組分可干擾、降解大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、葡萄球菌等革蘭陰性菌的細菌酶（如DNA拓撲異構酶）活性發揮抗菌作用。另外，水飛薊賓不僅對巨噬細胞向泡沫細胞轉化有抑制作用，還可抑制MIP-2表達發揮抗巨噬細胞凋亡作用［19］。近來研究發現，水飛薊賓也可抑制耐藥菌株Mtb的生存，提示水飛薊賓可能為治療結核病的潛在藥物［7］。本研究發現，給予水飛薊賓干預治療后，大鼠肺組織巨噬細胞凋亡、Mtb感染及肺組織炎癥損傷現象均得到明顯緩解，證實水飛薊賓對改善TB肺組織損傷有一定的治療作用。本研究對其促進巨噬細胞存活的分子調控途徑進行進一步探究。

Fas/FasL信號通路是介導巨噬細胞凋亡的關鍵通路。大量研究發現，Fas/FasL可介導caspase8/3信號通路或不依賴caspase的線粒體凋亡誘導因子（AIF）/核酸內切酶G（EndoG）信號通路，誘導小鼠和人巨噬細胞凋亡［20］。DU等［21］認為病原體表面的外膜蛋白（OMP）及脂多糖（LPS）中，很可能存在促進Fas/FasL及caspase8/3信號凋亡途徑活化的FasL樣蛋白成分，而使內吞作用被抑制的巨噬細胞在被病原體感染后仍會發生凋亡現象。REX等［22］發現LPS刺激巨噬細胞釋放IL-6及TNF-α的過程中，也會誘導巨噬細胞Fas表達與膜轉位，促進Fas/FasL依賴的caspase8/3信號活化，介導全身凋亡信號活化。另外，病原體感染巨噬細胞過程中，刺激巨噬細胞釋放的MIP-2也可激活Fas/FasL及caspase8/3信號凋亡途徑活化，進而介導組織細胞及巨噬細胞損傷及凋亡［23］。本研究發現，TB模型大鼠肺組織中MIP-2表達升高的同時，Fas/FasL及caspase8/3凋亡信號蛋白表達也明顯升高，上調大鼠機體Fas表達進一步促進Fas/FasL及caspase8/3凋亡信號活化的同時，大鼠肺組織炎癥損傷、Mtb感染及巨噬細胞凋亡進一步加重，提示Fas/FasL及caspase8/3凋亡信號活化可能參與Mtb感染引起的肺組織炎癥損傷、巨噬細胞凋亡過程。已有研究發現，水飛薊賓對肝組織Fas/FasL凋亡信號活化有抑制作用。本研究發現，水飛薊賓改善大鼠肺組織巨噬細胞凋亡、Mtb感染及肺組織炎癥損傷的同時，Fas/FasL及caspase8/3凋亡信號也處于抑制狀態，提示水飛薊賓可能通過抑制Fas/FasL及caspase8/3凋亡信號活化，抵抗Mtb感染引起的肺組織巨噬細胞凋亡及炎癥損傷作用。Fas過表達可部分減弱水飛薊賓的抗Mtb感染、抗肺組織巨噬細胞凋亡、抗肺組織炎癥損傷作用。

綜上所述，水飛薊賓可能通過抑制Fas/FasL凋亡信號激活，發揮抗Mtb感染、抗肺組織巨噬細胞凋亡及抗肺炎癥損傷作用，但水飛薊賓與Fas的調控作用是直接的還是間接的還需更加深入的研究。此外，Mtb外膜或巨噬細胞表面，可能都含有Fas活性成分，水飛薊賓抑制Fas/FasL信號活化作用與抑制Mtb外膜還是抑制巨噬細胞表面的Fas活性成分有關也尚不明確，有待后續研究。