李勇 沈文明 王文茜 (武漢市中醫(yī)醫(yī)院耳鼻咽喉科,武漢 430014)
慢性咽炎是耳鼻喉科常見疾病,可造成咽部干癢疼痛、有異物感、咳嗽、吞咽困難等癥狀,給患者工作生活造成很大不便[1-2]。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究認(rèn)為,活性氧(reactive oxygen species,ROS)、自由基等炎癥介質(zhì)和炎癥細(xì)胞因子引發(fā)咽部黏膜組織炎癥從而造成慢性咽炎,抗炎與抗氧化治療是改善慢性咽炎癥狀的有力手段[3-4]。Janus激酶2(Janus kinase 2,JAK2)/信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3(signal transducer and activator of transcription 3,STAT3)是機(jī)體組織重要的炎癥調(diào)控信號,抑制其信號途徑激活傳導(dǎo)可明顯減輕缺血再灌注引發(fā)的炎癥和氧化應(yīng)激,從而減輕肺損傷,治療急、慢性咽炎等炎癥相關(guān)疾病的冬青屬植物根和莖水提取物可通過下調(diào)JAK2/STAT3信號發(fā)揮抗炎作用,由此可知JAK2/STAT3能成為有前景的慢性咽炎治療靶點[5-6]。慢性咽炎在中醫(yī)學(xué)中屬“慢喉痹”,病機(jī)多為肺陰虛導(dǎo)致的虛火上炎、氣血瘀滯、咽部失養(yǎng),滋陰潤肺、清熱解毒是其治療策略[7-8]。武漢市中醫(yī)醫(yī)院自制的利咽糖漿主要由玄參、菊花、牛蒡子等組成,根據(jù)藥典中各藥功效,并遵循“藥有個性之特長,方有合群之妙用”的配伍原則配制成的糖漿制劑,具有清熱解毒、潤肺利咽之功效,推測可用于治療慢性咽炎。本文以此藥灌胃慢性咽炎大鼠,基于JAK2/STAT3信號探討其對慢性咽炎大鼠咽喉組織損傷及咽黏膜修復(fù)的影響。
1.1 材料
1.1.1 實驗動物 雄性SD大鼠,體質(zhì)量200~240 g,SPF級,購自四川海思科制藥有限公司,大鼠許可證號:SYXK(川)2018-182。大鼠遵照《中華人民共和國實驗動物管理條例》適應(yīng)性飼養(yǎng)在本院動物房中1周,具體條件:濕度55%~65%,溫度22.0~25.5 ℃,明暗各12 h交替輪換。本研究經(jīng)武漢貝賽模式生物中心實驗動物福利與倫理管理委員會批準(zhǔn),批號:BSMS動(福)第2022-03-28A號。
1.1.2 試劑與儀器 利咽糖漿為武漢市中醫(yī)醫(yī)院自制藥;RO8191(貨號:HY-W063968,純度:98.53%)購自美國MCE公司;10%氨水(貨號:CAS 1336-21-6)購自南京化學(xué)試劑股份有限公司;PE Anti-rat CD4抗體(貨號:B203412)購自BIOLEGEND(北京)生物科技有限公司;FITC Anti-rat CD8抗體(貨號:ab95527)、大鼠腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)ELISA試劑盒(貨號:ab100785)、IL-6 ELISA試劑盒(貨號:ab100772)、大鼠IL-10 ELISA試劑盒(貨號:ab214566)、兔源Anti-rat JAK抗體(貨號:ab39636)、兔源Anti-rat p-JAK抗體(貨號:ab32101)、兔源Anti-rat p-STAT3抗體(貨號:ab76315)、兔源Anti-rat STAT3抗體(貨號:ab68153)購自美國Abcam公司;兔源Anti-rat β-actin抗體(貨號:AF5003)、辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔二抗(貨號:A0208)、總抗氧化能力(total antioxidant capacity,T-AOC)檢測試劑盒(ABTS快速法)(貨號:S0121)、ROS檢測試劑盒(貨號:S0033M)、鈉鹽(bicinchoninic acid,BCA)蛋白定量試劑盒(貨號:P0012S)、丙二醛(malondialdehyde,MDA)檢測試劑盒(貨號:S0131S)、RIPA裂解液(貨號:P0013K)購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。全自動脫水機(jī)(型號:ASP200S)、石蠟輪轉(zhuǎn)切片機(jī)(型號:RM2035)、加熱石蠟包埋系統(tǒng)(型號:G1150H)、生物光學(xué)顯微鏡(型號:DM3000)均購自德國Leica公司;酶標(biāo)分析儀(型號:DNM-9606)購自北京普朗新技術(shù)有限公司;流式細(xì)胞儀(型號:CytoFLEX)購自美國貝克曼庫爾特公司;蛋白制膠、電泳與轉(zhuǎn)膜系統(tǒng)(4膠/4膜)(型號:MiniProGelTM)購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。
1.2 方法
1.2.1 慢性咽炎大鼠模型制備及分組給藥 制備慢性咽炎大鼠模型參照文獻(xiàn)[9]:將10%氨水置于噴霧器中,取SD大鼠51只,向其咽部噴2撳,每天噴3次,間隔8 h,持續(xù)21 d后,觀察大鼠一般情況,當(dāng)出現(xiàn)皮毛粗糙、暗淡,口腔分泌物及飲水量增加,有側(cè)頭蹭墊料、搔抓口唇兩側(cè)動作,額戴反光鏡觀察大鼠咽部發(fā)現(xiàn)其組織充血、腫脹,有很多分泌物附著,則判斷模型建立成功,共造模成功48只,隨機(jī)分為模型組、利咽糖漿組、RO8191組、利咽糖漿+RO8191組,每組12只,另取12只SD大鼠咽部注射等劑量生理鹽水,作為對照組。
利咽糖漿為武漢市中醫(yī)醫(yī)院自制藥:將玄參、菊花、牛蒡子、丹皮、赤芍、板藍(lán)根、麥冬、桔梗以相同比例浸泡、煎煮、過濾、濃縮后得到生藥含量為0.8 g/ml的藥液,然后加入適量蔗糖溶解混勻,得到每瓶200 ml的糖漿制劑,將JAK2/STAT3激活劑RO8191分別加入上述糖漿制劑及生理鹽水中,得到2.3 mg/ml的RO8191與利咽糖漿混合藥液、2.3 mg/ml的RO8191藥液,利咽糖漿組大鼠灌胃9 ml/kg的利咽糖漿制劑,藥物終劑量為7.2 g/kg;RO8191組大鼠灌胃9 ml/kg的RO8191藥液,RO8191終劑量為20.7 mg/kg[10];利咽糖漿+RO8191組大鼠灌胃9 ml/kg的RO8191和利咽糖漿混合藥液,RO8191和利咽糖漿終劑量分別為20.7 mg/kg、7.2 g/kg;對照組和模型組大鼠灌胃9 ml/kg的生理鹽水,各組大鼠均每天灌胃1次,持續(xù)灌胃21 d。
1.2.2 檢測大鼠一般情況及咽部表觀狀態(tài) 給藥全部完成后24 h觀察大鼠皮毛、飲水量、口腔分泌物、行為動作等一般情況,并額戴反光鏡觀察大鼠咽部,根據(jù)文獻(xiàn)[11]標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評分:大鼠咽部表面濕潤有光澤,無充血、腫脹等病理癥狀且呈淺紅色,無分泌物附著,計0分;大鼠咽部表面光澤不良,有少量急性充血且附著少量分泌物,計1分;大鼠咽部表面色澤差且顏色暗紅,有急性、輕度腫脹等病理現(xiàn)象,附著分泌物,計2分;大鼠咽部呈暗紅色和暗色,急性充血、腫脹等病理現(xiàn)象明顯并附著大量分泌物,計3分。
1.2.3 大鼠外周血中T淋巴細(xì)胞亞群檢測及標(biāo)本采集 大鼠一般情況及咽部表觀狀態(tài)檢測結(jié)束后取頸動脈血,于4 ℃下以300 g 離心15 min,將上清儲存在-80 ℃下備用;再次取頸動脈血1 ml加入適量紅細(xì)胞裂解液,冰水浴中靜置30 min,于4 ℃下以300 g 離心20 min,得到外周血T淋巴細(xì)胞,加入適量PBS混勻洗滌后再次以同樣條件離心,將細(xì)胞沉淀以PBS重懸后計數(shù),然后取約含5×106個細(xì)胞的細(xì)胞懸液以同樣條件離心,依次加入FITC Anti-rat CD8、PE Anti-rat CD4抗體、PBS后混勻,避光孵育30 min,以同樣條件離心后使用PBS洗滌細(xì)胞沉淀,加入500 μl PBS小心吹打混勻后上機(jī)檢測,通過FCSalyzer v0.9.22軟件分析流式細(xì)胞儀所得數(shù)據(jù),獲得T淋巴細(xì)胞亞群CD4+T、CD8+T,并計算CD4+T/CD8+T。
以異氟醚麻醉大鼠后處死,剪下咽部組織,取0.6 g加入蛋白裂解液,冰水浴中上下研磨,4 ℃下離心(1 000 g,20 min),采用BCA試劑盒檢測上清中總蛋白濃度,然后儲存在-80 ℃下備用。
1.2.4 大鼠咽部病理形態(tài)變化檢測 將1.2.3中剩余的大鼠咽部組織以儀器脫水后置于二甲苯中透明,以融化的石蠟包埋成塊后切片,選出無破損且厚薄均勻的切片置于二甲苯中脫蠟,水化后采用HE試劑盒進(jìn)行染色,脫水、透明、封片后光學(xué)顯微鏡下觀察大鼠咽部病理形態(tài)變化。
1.2.5 大鼠血清TNF-α、IL-6、IL-10、MDA、ROS、TAOC水平檢測 取1.2.3中凍存于-80 ℃的血清提前緩慢解凍,以各自試劑盒并遵循其說明指導(dǎo)測定其中TNF-α、IL-6、IL-10、MDA、ROS、T-AOC水平。
1.2.6 大鼠咽部組織JAK2/STAT3通路相關(guān)蛋白表達(dá)檢測 取1.2.3中凍存于-80 ℃的咽部組織蛋白樣品液提前緩慢解凍,取出18 μg蛋白,以100 ℃沸水變性5 min,以120 V電壓跑電泳70 min,以40 mA電流濕轉(zhuǎn)75 min,以3%牛血清白蛋白封閉蛋白非特異位點2 h,將目的蛋白JAK、p-JAK、STAT3、p-STAT3、β-actin自硝酸纖維膜上截下,分別以稀釋1 000倍的相對應(yīng)兔源一抗孵育9 h,洗膜后以稀釋2 000倍的辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔二抗孵育2 h,經(jīng)增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法顯色、曝光、掃描后,將圖片輸入Image Lab軟件分析,定量各蛋白灰度后算出其與內(nèi)參β-actin的比值,進(jìn)行統(tǒng)計后得出各蛋白相對表達(dá)。
1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS24.0軟件對所得實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析,計量資料采用表示,對照組與模型組間采用t檢驗進(jìn)行差異比較;模型組與給藥組間采用單因素方差分析進(jìn)行差異比較,兩兩之間采用LSD-t檢驗進(jìn)行進(jìn)一步比較,P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
2.1 利咽糖漿對大鼠一般情況及咽部表觀狀態(tài)的影響 對照組大鼠一般情況及咽部表觀狀態(tài)正常,咽部黏膜及肌層組織結(jié)構(gòu)清晰完好。與對照組相比,模型組大鼠皮毛粗糙、暗淡,口腔分泌物量及飲水量增加,有側(cè)頭蹭墊料、搔抓口唇兩側(cè)動作,咽部紅腫充血,呈現(xiàn)暗紅色,喉中鳴響呈間斷性喘鳴聲,咽部黏膜上皮組織增生,呈釘狀或乳突狀,組織有充血情況,附有較多黏液,大量炎癥細(xì)胞浸潤黏膜下層,并部分深入肌層組織,咽部組織出現(xiàn)明顯病理形態(tài)損傷,咽部表觀狀態(tài)評分顯著升高(P<0.05)。與模型組、利咽糖漿+RO8191組相比,利咽糖漿組大鼠上述一般情況及咽部表觀及病理損傷癥狀均有所改善,咽部表觀狀態(tài)評分均降低(P<0.05);RO8191組大鼠上述一般情況、咽部表觀及病理損傷癥狀均進(jìn)一步加重,咽部表觀狀態(tài)評分升高(P<0.05)。見圖1、表1。
表1 各組大鼠咽部表觀狀態(tài)評分(,n=12)Tab.1 apparent state score of pharynx of rats in each group (,n=12)

表1 各組大鼠咽部表觀狀態(tài)評分(,n=12)Tab.1 apparent state score of pharynx of rats in each group (,n=12)
Note:Compared with control group, 1)P<0.05; compared with model group, 2)P<0.05; compared with Liyan syrup+RO8191 group, 3)P<0.05.
Pharyngeal apparent state score/score 0 2.00±0.211)0.75±0.102)3)2.83±0.152)3)1.75±0.16 Groups Control Model Liyan syrup RO8191 Liyan syrup+RO8191

圖1 HE染色檢測各組大鼠咽部病理形態(tài)變化(×200)Fig.1 Pathological changes of pharynx of rats in each group were detected by HE staining (×200)
2.2 利咽糖漿對大鼠外周血T淋巴細(xì)胞亞群的影響 與對照組比較,模型組大鼠外周血CD4+T比例、CD4+T/CD8+T降低(P<0.05),CD8+T比例升高(P<0.05);與模型組、利咽糖漿+RO8191組相比,利咽糖漿組大鼠外周血CD4+T比例、CD4+T/CD8+T均升高(P<0.05),CD8+T比例均降低(P<0.05);RO8191組大鼠外周血CD4+T比例、CD4+T/CD8+T比值均降低(P<0.05),CD8+T比例均升高(P<0.05)。見圖2、表2。
表2 各組大鼠外周血T淋巴細(xì)胞亞群比例(,n=12)Tab.2 Proportion of T lymphocyte subsets in peripheral blood of rats in each group (,n=12)

表2 各組大鼠外周血T淋巴細(xì)胞亞群比例(,n=12)Tab.2 Proportion of T lymphocyte subsets in peripheral blood of rats in each group (,n=12)
Note:Compared with control group, 1)P<0.05; compared with model group,2) P<0.05; compared with Liyan syrup+RO8191 group,3)P<0.05.
CD4+T/CD8+T 2.08±0.13 1.36±0.091)1.93±0.142)3)1.09±0.052)3)1.42±0.10 Groups Control Model Liyan syrup RO8191 Liyan syrup+RO8191 CD4+T/%58.49±3.51 46.10±1.831)57.37±3.242)3)40.34±1.122)3)47.25±1.03 CD8+T/%28.14±1.35 33.82±1.421)29.76±1.142)3)36.94±0.932)3)33.15±1.06

圖2 流式細(xì)胞術(shù)檢測各組大鼠外周血T淋巴細(xì)胞亞群Fig.2 Detection of T lymphocyte subsets in peripheral blood of rats in each group by flow cytometry
2.3 利咽糖漿對大鼠血清炎癥及氧化應(yīng)激相關(guān)因子水平的影響 與對照組比較,模型組大鼠血清IL-6、TNF-α、MDA、ROS水平升高(P<0.05),IL-10、T-AOC水平降低(P<0.05);與模型組、利咽糖漿+RO8191組相比,利咽糖漿組大鼠血清IL-6、TNF-α、MDA、ROS水平均降低(P<0.05),IL-10、T-AOC水平均升高(P<0.05);RO8191組大鼠血清IL-6、TNF-α、MDA、ROS水平均升高(P<0.05),IL-10、T-AOC水平均降低(P<0.05)。見表3。
表3 各組大鼠血清IL-6、TNF-α、IL-10、MDA、ROS、T-AOC水平(,n=12)Tab.3 Serum IL-6, TNF-α, IL-10,MDA,ROS and T-AOC of rats in each group level (,n=12)

表3 各組大鼠血清IL-6、TNF-α、IL-10、MDA、ROS、T-AOC水平(,n=12)Tab.3 Serum IL-6, TNF-α, IL-10,MDA,ROS and T-AOC of rats in each group level (,n=12)
Note:Compared with control group, 1)P<0.05; compared with model group,2) P<0.05; compared with Liyan syrup+RO8191 group, 3)P<0.05.
T-AOC/(U·L-1)793.28±80.34 564.37±43.161)782.91±70.132)3)412.40±32.052)3)578.82±50.42 Groups Control Model Liyan syrup RO8191 Liyan syrup+RO8191 TNF-α/(pg·ml-1)90.12±8.47 365.72±46.181)97.84±9.022)3)504.46±52.832)3)348.95±49.05 IL-6/(pg·ml-1)15.86±3.24 86.30±15.621)21.72±5.402)3)135.93±20.352)3)81.35±10.68 IL-10/(pg·ml-1)89.53±9.43 36.75±3.171)81.92±10.122)3)12.08±2.062)3)41.20±4.05 MDA/(nmol·L-1)9.83±1.25 17.69±2.311)10.76±1.812)3)23.84±2.482)3)16.35±2.12 ROS/(U·L-1)1.03±0.14 8.24±1.321)1.57±0.482)3)13.38±2.052)3)7.51±1.27
2.4 利咽糖漿對大鼠咽部組織JAK2/STAT3通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 與對照組比較,模型組大鼠咽部組織p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3水平升高(P<0.05);與模型組、利咽糖漿+RO8191組相比,利咽糖漿組大鼠咽部組織p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3均降低(P<0.05);RO8191組大鼠咽部組織p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3均升高(P<0.05)。見圖3、表4。
表4 各組大鼠咽部組織JAK2/STAT3通路相關(guān)蛋白相對表達(dá)(,n=12)Tab.4 Relative expressions of JAK2/STAT3 pathway related proteins in pharyngeal tissue of rats in each group (,n=12)

表4 各組大鼠咽部組織JAK2/STAT3通路相關(guān)蛋白相對表達(dá)(,n=12)Tab.4 Relative expressions of JAK2/STAT3 pathway related proteins in pharyngeal tissue of rats in each group (,n=12)
Note:Compared with control group, 1)P<0.05; compared with model group,2) P<0.05; compared with Liyan syrup+RO8191 group,3)P<0.05.
p-STAT3/STAT3 0.17±0.03 0.55±0.071)0.24±0.062)3)0.87±0.112)3)0.51±0.08 Groups Control Model Liyan syrup RO8191 Liyan syrup+RO8191 p-JAK2/JAK2 0.23±0.04 0.68±0.131)0.27±0.052)3)0.97±0.122)3)0.62±0.10

圖3 免疫印跡檢測各組大鼠咽部組織JAK2/STAT3通路相關(guān)蛋白表達(dá)Fig.3 Western blot was used to detect expressions of JAK2/STAT3 pathway related proteins in pharyngeal tissues of rats in each group
慢性咽炎作為咽部的一種慢性炎癥性疾病,可造成黏膜增生、腺體膨大、血管擴(kuò)張、黏液分泌增多等病理現(xiàn)象,ROS、TNF-α、IL-6等炎癥介質(zhì)及淋巴細(xì)胞、白細(xì)胞等炎癥細(xì)胞參與調(diào)控其復(fù)雜的病理反應(yīng)過程[3,12-13]。本實驗以10%氨水刺激大鼠咽部構(gòu)建慢性咽炎模型,結(jié)果顯示氨水刺激可誘導(dǎo)炎癥介質(zhì)ROS、TNF-α、IL-6大量產(chǎn)生,降低抗炎因子IL-10水平,外周血淋巴細(xì)胞CD4+T亞群比例降低,CD8+T亞群比例升高,引發(fā)咽部炎癥及氧化應(yīng)激損傷,導(dǎo)致大鼠咽部紅腫充血,呈現(xiàn)暗紅色,喉中鳴響呈間斷性喘鳴聲,出現(xiàn)皮毛粗糙、暗淡,口腔分泌物及飲水量增加,并出現(xiàn)側(cè)頭蹭墊料、搔抓口唇兩側(cè)等癥狀,表明大鼠模型建立成功。
西醫(yī)治療慢性咽炎的首選藥為青霉素類抗生素,但由于耐藥、過敏等問題,尋求更好的治療藥物十分重要,中藥因其毒副作用小的優(yōu)點在慢性咽炎的治療中得到了很大發(fā)展。本文將玄參、菊花、牛蒡子、丹皮、赤芍、板藍(lán)根、麥冬、桔梗浸泡煎煮、過濾濃縮后,加入蔗糖溶解制成利咽糖漿,其中玄參、菊花、牛蒡子為君藥,具有清熱解毒、瀉火利咽功效,丹皮、赤芍為成藥,具有清熱涼血、消腫祛瘀功效,板藍(lán)根、麥冬為佐藥,具有降燥解毒、潤肺養(yǎng)陰功效,桔梗為使藥,可解毒排膿、宣泄肺氣,具有帶動諸藥上行的功效,上述藥物合用共奏清熱解毒、潤肺利咽之功[7-8,14-16]。本實驗以此利咽糖漿制劑干預(yù)處理慢性咽炎大鼠,可減少炎癥介質(zhì)ROS、TNF-α、IL-6產(chǎn)生,提升抗炎因子IL-10水平,調(diào)控外周血淋巴細(xì)胞亞群分化,提高CD4+T比例與CD4+T/CD8+T比值,從而減輕炎癥,增加抗氧化酶T-AOC生成,降低氧化應(yīng)激水平,減輕大鼠黏膜上皮組織增生、充血紅腫、黏液大量附著等咽部組織病理形態(tài)損傷,降低咽部表觀狀態(tài)評分,改善大鼠皮毛暗淡、口腔分泌物量及飲水量增加等一般情況,最終緩解慢性咽炎癥狀,揭示了利咽糖漿對慢性咽炎具有很好的治療作用。
研究表明抗炎治療是治療咽炎、緩解咽喉癢痛的有效策略,JAK2/STAT3信號可調(diào)控炎癥細(xì)胞分化浸潤、炎癥因子表達(dá)等炎癥反應(yīng)過程,抑制JAK2/STAT3通路激活可顯著減輕炎癥反應(yīng),減輕肺損傷,并可改善類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎癥狀,由此推測通過下調(diào)JAK2/STAT3通路抑制炎癥可能是利咽糖漿治療慢性咽炎的藥理機(jī)制[3-4,17-19]。本研究結(jié)果顯示,慢性咽炎大鼠相比于對照組大鼠,其咽部組織p-JAK2/JAK2與p-STAT3/STAT3水平顯著升高,利咽糖漿可逆轉(zhuǎn)其變化,且以JAK2激活劑RO8191干預(yù)處理慢性咽炎大鼠,可加重大鼠咽部組織炎癥損傷及咽炎癥狀,表明JAK2/STAT3信號參與調(diào)控利咽糖漿對慢性咽炎的治療過程[20];當(dāng)利咽糖漿和RO8191聯(lián)合干預(yù)處理慢性咽炎大鼠時,RO8191可減弱利咽糖漿的抗炎及抗氧化應(yīng)激功能,抵抗其對大鼠咽部組織炎癥損傷及咽炎癥狀的改善作用,最終逆轉(zhuǎn)利咽糖漿的慢性咽炎治療功效,揭示利咽糖漿可通過抑制JAK2/STAT3信號激活而起到治療慢性咽炎的作用。
綜上可知,利咽糖漿能降低JAK2與STAT3蛋白的磷酸化水平,抑制ROS及炎癥因子表達(dá)生成,減弱氧化應(yīng)激,抵抗炎癥發(fā)生及進(jìn)展,緩解慢性咽炎大鼠咽黏膜損傷,改善咽炎癥狀,抑制JAK2/STAT3信號激活是其藥理機(jī)制之一。本實驗制備了一種新的咽炎治療藥物,并證實了其療效,為急慢性咽炎的臨床治療做出了一定貢獻(xiàn)。