TREM2單克隆抗體的制備及應用檢測

馬賓 孟麟 戎卓娜 趙傳科 壽成超

（北京大學臨床腫瘤學院，北京大學腫瘤醫院暨北京市腫瘤防治研究所，生物化學與分子生物學研究室，惡性腫瘤發病機制及轉化研究教育部重點實驗室，北京100142）

髓系細胞觸發受體2（triggering receptors expressed on myeloid cells 2，TREM2）是免疫抑制受體，屬于免疫球蛋白超家族。TREM2基因位于人類染色體6p21.1上，由5個外顯子組成，編碼TREM2蛋白，包含230個氨基酸［1］。研究表明，TREM2在部分髓系細胞膜上表達，主要包括樹突狀細胞、單核細胞、巨噬細胞、破骨細胞和小膠質細胞等。其結構由以下4個區域組成：信號肽序列、細胞外Ⅴ型免疫球蛋白結構域及一個短柄序列、單次跨膜結構域、胞內的短尾區［2］。除了膜結合形式外，TREM2還能以可溶性形式釋放［3-4］。

TREM2在多種生命活動中發揮重要作用，包括細胞成熟、細胞增殖、細胞存活、吞噬和炎癥調節等［5］。這一系列不同的功能主要由TREM2和多種潛在的配體相互作用調節，這些配體包括大量的陰離子分子，如革蘭陽性和革蘭陰性細菌（淋球菌、大腸桿菌和金黃色葡萄球菌）、DNA、脂蛋白和磷脂等［6］。TREM2通過其跨膜結構域中相反的電荷殘基與其適配器DAP12、DAP10結合。當配體與膜上的TREM2結合后，這些共受體被磷酸化并招募下游的信號轉導分子，從而發揮不同的生物學效應［7］。

TREM2對于維持小膠質細胞的代謝適應性至關重要，因此以往對TREM2的研究主要集中在神經退行性疾病中。如在阿爾茨海默病中，TREM2發生突變產生變異體，導致TREM2功能喪失，因而小膠質細胞不能聚集在Aβ斑塊周圍。斑塊周圍的小膠質細胞是形成物理屏障的必要條件，可以限制斑塊的擴散，保護周圍的神經元免受斑塊神經毒性的影響［8］。近些年越來越多的研究開始關注TREM2在腫瘤相關巨噬細胞和髓系源性抑制細胞中的作用。最近的一項研究發現，與健康對照組相比，TREM2在肺癌患者和荷瘤小鼠的外周血單核細胞以及腫瘤相關巨噬細胞上表達顯著升高。腫瘤相關巨噬細胞的TREM2水平與腫瘤進展呈正相關［9］。MOLGORA等［10］2020年發表在Cell上的一篇文章證明，與野生型小鼠相比，TREM2基因缺陷型小鼠更能抵抗各種腫瘤的生長，并且抗PD-1免疫療法對前者療效更好。此外，與單獨使用PD-1抗體治療相比，TREM2抗體與PD-1抗體聯合應用可以更有效地抑制小鼠移植瘤生長。因此TREM2抗體藥物有望與其他檢查點阻斷藥物聯合應用，提高抗腫瘤免疫療法的療效。

1 材料與方法

1.1 材料 PUC-SP-TREM1、PUC-SP-TREM2質粒由上海生工生物技術有限公司全基因合成。BL21大腸桿菌感受態以及原核表達載體pGEX-4T-1由生化室保存，限制性內切酶BamHⅠ和EcoRⅠ、T4 DNA連接酶購于NEB公司。6～8周齡BALB/c小鼠購于北京維通利華實驗動物中心，小鼠SP2/0骨髓瘤細胞系由生化室保存，培養條件為RPMI1640+15%FBS。水溶性佐劑購自北京博奧龍免疫技術有限公司；TREM1真核表達蛋白（Cat#.HPLC-10511-H08H）購于義翹神州公司；TREM2真核表達蛋白（Cat#.TR2-H52H5）購于ACRO公司；TREM1抗體（Cat#.AF1278-SP）購于RD公司；TREM2抗體（Cat#.91068）購于CST公司；His tag抗體（Cat#.ab1187）購于Abcam公司。

1.2 方法

1.2.1 pGEX-4T1-TREM2重組質粒構建 選取人TREM2胞外段作為免疫原片段（編碼TREM2的第1～174位氨基酸序列）。該基因片段長度為522 bp，通過PCR擴增獲得。設計正向引物序列為：5'-CGGGATCCATGGAGCCTCTCCGGCTGCTC-3'，反向引物序列為：5'-CGGAATTCTCAGGAAGTGGGTGGGAAGGGGATTTCT-3'。引物由上海擎科生物科技有限公司合成。以PUC-SP-TREM2質粒DNA為模板進行PCR擴增；PCR產物及pGEX-4T-1質粒分別經BamHⅠ和EcoRⅠ雙酶切后，電泳、膠回收目的片段及載體片段，二者經T4 DNA連接酶在4 ℃靜置連接過夜。次日將連接產物常規轉染大腸桿菌，37 ℃培養過夜，少量提取質粒后進行測序鑒定。

1.2.2 GST-TREM2融合蛋白的誘導表達及純化將測序結果正確的重組菌稀釋到200 ml LB培養基中，37 ℃、225 r/min培養至OD600nm為0.7左右，加入0.25 mmol/L IPTG，繼續培養4 h。6 000 r/min離心10 min后棄上清，加入10 ml細菌裂解液，充分懸浮細菌沉淀。室溫靜置10 min后加入終濃度為1%TritonX-100，冰浴20 min后進行超聲裂解；裂解液4 ℃、12 000 r/min 離心15 min，取沉淀。在細菌沉淀中加入10 ml 2%去氧膽酸鈉，冰上超聲50 s，室溫振搖30 min，10 000 g離心10 min，棄上清。沉淀中加入500 μl變性液，室溫變性3 h，液體變清亮后離心棄沉淀。上清液加入9倍體積的復性液，室溫復性1 h，4 ℃復性4 h。離心后取上清用25 mmol/L Tris-HCl透析過夜，期間換液3次，次日用蔗糖包埋濃縮；10%SDS-PAGE檢測其含量和純度。

1.2.3 動物免疫 將純化的GST-TREM2融合蛋白與等體積的水溶性佐劑充分混合，小鼠雙側下肢注射融合蛋白，40 μg/只。初次免疫3周后用同樣的方法進行第2次免疫，第2次免疫后14 d采尾靜脈血，ELISA測血清抗體效價。融合前4 d選擇抗體滴度高的小鼠進行融合前加強免疫。

1.2.4 293T-TREM1、293T-TREM2穩轉細胞系的構建 將委托公司合成的PUC-SP-TREM1、PUC-SPTREM2質粒進行雙酶切，酶切位點為EcoRⅠ和BamHⅠ。將酶切回收的目的片段構建到真核表達載體pLVx上，獲得pLVx-TREM1和pLVx-TREM2重組質粒。分別用上述質粒轉染293T細胞。轉染48 h后更換為含1 μg/ml嘌呤霉素的完全培養基進行篩選培養，至上清中無死細胞后，收集細胞總蛋白進行目的蛋白檢測。

1.2.5 細胞融合與篩選 取加強免疫小鼠脾臟細胞與骨髓瘤SP2/0細胞融合，融合后第8天左右，將293T、293T-TREM1及293T-TREM2細胞以2×104個/孔鋪96孔板，克隆孔培養上清作為一抗，進行常規細胞ELISA檢測，篩選出與293T-TREM2細胞反應、與293T及293T-TREM1均不反應的克隆孔，進行3～5次亞克隆及篩選，直至獲得能穩定分泌抗TREM2抗體的單克隆雜交瘤細胞株。

1.2.6 單克隆抗體的制備與純化 BALB/c小鼠腹腔注射弗氏不完全佐劑，0.5 ml/只，次日腹腔注射雜交瘤細胞2×106個/只。約10 d后收取腹水，10 000 r/min離心5 min，取上清。用PBS等體積稀釋腹水上清，0.45 μm濾器過濾，Protein G凝膠柱進行純化；純化抗體經PBS充分透析后，用SDS-PAGE電泳鑒定抗體純度和含量。

1.2.7 ELISA 293T、293T-TREM1、293T-TREM2細胞鋪于96孔板（2×104個/孔），培養過夜，細胞融合度達到80%左右時，加入0.25%的戊二醛，室溫固定30 min，PBST洗4遍；5%脫脂牛奶室溫封閉2 h，PBST洗4遍。將稀釋的小鼠血清或單抗作為一抗，室溫反應2 h，PBST洗4遍。HPR標記的羊抗小鼠IgG作為二抗，室溫反應1 h，PBST洗4遍。加入OPD，室溫避光顯色15 min。12.5%H2SO4終止反應，檢測OD490nm讀數。

1.2.8 流式細胞術 消化細胞，PBS清洗2遍。每個體系取2×105個細胞，加2 μg/ml自制TREM2單抗室溫反應45 min，PBS洗2遍，Alexa Fluor 488標記的羊抗鼠IgG作為二抗，室溫染色30 min，PBS洗2遍，100 μl PBS重懸細胞，上機進行檢測。

1.2.9 蛋白免疫印跡 用RIPA裂解液分別裂解293T、293T-TREM1、293T-TREM2細胞收集蛋白。每泳道上樣20 μg。SDS-PAGE后，300 mA轉膜50 min。5%脫脂牛奶室溫封閉2 h后，分別用自制TREM2單抗（2 μg/ml） 4 ℃孵育過夜。次日洗滌后，加入HRP標記的羊抗鼠IgG（1∶2 000），室溫孵育50 min，ECL化學發光顯色。

1.2.10 免疫沉淀 各取2 μg自制TREM2單抗與20 μl Protein G加到1 ml PBST中，同時以2 μg小鼠IgG作為陰性對照，在搖床上室溫孵育1 h，PBST洗3遍，之后分別加入30 ng TREM1、TREM2真核蛋白和900 μl PBST，4 ℃結合過夜。次日PBST洗3次，棄上清，珠子中加入等體積的2×SDS裂解液，電泳90 min、300 mA轉膜50 min，牛奶封閉后用HRP標記的His抗體進行檢測。

1.2.11 免疫熒光實驗 預先乙醇浸泡直徑1 cm的圓形細胞爬片，晾干后在24孔板里每孔放1個爬片。293T、293T-TREM1、293T-TREM2細胞消化重懸，以相同細胞數鋪在24孔板中。細胞貼壁24 h后，預冷PBS洗2遍，2 μg/ml自制TREM2單抗室溫反應1 h，PBS洗3遍；Alexa Fluor 594標記的羊抗鼠IgG室溫避光染色30 min，PBS洗3遍，DAPI復染細胞核，90%甘油封片后用共聚焦顯微鏡進行拍照。

2 結果

2.1 TREM2胞外段融合蛋白的誘導表達和純化測序正確的重組質粒轉化大腸桿菌，經IPTG誘導表達，超聲裂解后行SDS-PAGE和考馬斯亮藍染色檢測。結果可見重組質粒轉染的細菌經誘導表達后有目的蛋白表達，主要以包涵體的形式存在于細菌沉淀中（圖1A）。包涵體經蛋白變復性純化后，進行電泳鑒定，在約42 kD處可見目的蛋白條帶，但在35 kD上下位置也有較明顯的蛋白條帶，可能系目的蛋白降解所致（圖1B）。

圖1 融合蛋白表達、純化及TREM過表達細胞系鑒定Fig.1 Expression， purification of fusion proteins and identification of cell lines overexpressing TREM

2.2 TREM過表達細胞系鑒定 將PUC57-TREM1及PUC57-TREM2質粒進行EcoRⅠ和BamHⅠ雙酶切獲得目的片段，然后將其插入真核表達載體pLVx中。酶切后電泳結果表明，質粒釋放出的載體片段和目的蛋白表達片段大小與預期相符（圖1C、D）。質粒進行Sanger測序，測序結果與目的片段序列比對結果一致（測序結果未展示）。對經pLVx-TREM1或pLVx-TREM2質粒轉染并建株的293T-TREM1和293T-TREM2總蛋白進行Western blot檢測表明，TREM1和TREM2分別在293T-TREM1和293TTREM2細胞中成功表達（圖1E）。

2.3 小鼠免疫與TREM2單抗雜交瘤株的篩選 采用293T和293T-TREM2細胞，對上述融合蛋白GSTTREM2二次免疫后小鼠的抗血清效價進行ELISA檢測。結果表明，在免疫的4只小鼠中，3只小鼠的抗血清與293T-TREM2細胞呈較強特異反應。選取抗血清效價最高的小鼠進行加強免疫及融合篩選。融合后細胞共接種16塊96孔培養板，融合率為100%。采用293T、293T-TREM1和293T-TREM2細胞對雜交瘤細胞的培養上清進行ELISA檢測，選取雜交瘤上清與293T-TREM2細胞反應值是與293T、293T-TREM1細胞反應讀值3倍以上的克隆作為初篩陽性克隆；對100個陽性克隆進行亞克隆，3～5次亞克隆及篩選后，最終構建了58個陽性克隆。用陽性克隆作為一抗進行ELISA反應，結果見圖2。

圖2 TREM2單抗雜交瘤細胞株篩選Fig.2 Screening of hybridoma cell lines of TREM2 monoclonal antibody

2.4 TREM2單抗的制備、純化 根據雜交瘤上清與293T-TREM2的結合特異性，挑選了29株雜交瘤細胞（TM1、TM2……TM29），制備小鼠腹水并用Protein G對腹水進行純化，SDS-PAGE電泳檢測抗體純度。如圖3所示，所獲得的抗體在SDS-PAGE凝膠電泳中只分別在55 kD和25 kD左右可見重、輕鏈兩條條帶，無其他雜帶，抗體純度＞95%。

圖3 TREM2單克隆抗體的純化Fig.3 Purification of TREM2 monoclonal antibodies

2.5 ELISA檢測單克隆抗體特異性及親和力 在獲得純化抗體后，通過細胞ELISA對抗體的結合特異性進行了進一步檢測，結果表明，在29株純化抗體中，除5株抗體（TM6、TM8、TM10、TM22、TM26）與293T-TREM1和293T親本細胞有一定交叉反應外，其余24株單抗均只與293T-TREM2細胞呈特異性結合反應，與293T-TREM1和293T親本細胞不反應。在此基礎上，用細胞ELISA檢測了抗體的親和力，結果可見（圖4）29株抗體與293T-TREM2細胞均具有較高的結合活性，且呈現劑量依賴性。除TM6、TM8、TM10和TM20外，其余抗體均呈現較明顯的S型結合曲線。所有抗體的EC50均為nmol，表明獲得的TREM2單抗親和力均較高（表1）。

表1 TREM2單克隆抗體的親和力Tab.1 Affinity of TREM2 monoclonal antibodies

圖4 ELISA檢測TREM2單克隆抗體的親和力Fig.4 Affinity of monoclonal antibodies reacted with TREM2 protein by ELISA

2.6 TREM2單克隆抗體在Western blot中的應用檢測 為了解獲得的抗體是否可用于TREM2的Western blot檢測及其抗體特異性，分別用293T、293T-TREM1和293T-TREM2細胞總蛋白進行電泳（上樣量均為20 μg）、轉膜后，用上述29株抗TREM2單克隆抗體作為一抗進行Western blot檢測。結果顯示，29株抗體均在293T-TREM2細胞總蛋白中檢測到特異性的TREM2條帶，而與293T、293T-TREM1細胞總蛋白無結合條帶（圖5），說明獲得的TREM2單抗具有較好的TREM2結合特異性，且均能用于Western blot檢測。

圖5 TREM2單克隆抗體Western blot應用Fig.5 Western blot application of TREM2 monoclonal antibodies

2.7 TREM2單克隆抗體在免疫沉淀中的應用檢測 為了明確自制單抗能否用于IP及抗體特異性檢測，用29株TREM2單抗分別與真核表達蛋白His-TREM1和His-TREM2進行免疫沉淀，用抗His抗體進行Western blot檢測。如圖6所示，所有單抗均與TREM2呈特異性反應，與TREM1蛋白不反應；單抗TM4、TM5、TM7、TM14、TM15、TM16、TM17、TM19的陽性信號較弱，表明其與TREM2結合能力較弱，其余單克隆抗體表現出較強的結合能力。

圖6 TREM2單克隆抗體免疫沉淀應用Fig.6 Immunoprecipitation application of TREM2 monoclonal antibodies

2.8 TREM2單克隆抗體在流式細胞術中的應用檢測 采用純化抗體對293T、293T-TREM1和293TTREM2細胞進行流式檢測表明，29株抗體均與TREM2呈特異性反應，而與293T和293T-TREM1細胞基本不反應。根據MFI的統計結果可見，除TM1、TM11和TM13的MFI值相對較低外，其余抗體的MFI值較高，說明TREM2單抗與TREM2有較強結合（圖7）。

圖7 流式檢測鑒定TREM2單抗特異性的MFI統計圖Fig.7 Flow cytometry was used to identify specific MFI of TREM2 monoclonal antibody

2.9 TREM2單克隆抗體在細胞免疫熒光中的應用檢測 根據以上檢測結果，選擇TM5、TM7、TM12、TM14、TM20、TM25共6株抗體進行免疫熒光應用檢測。結果如圖8所示，受測的六株抗體均能與293TTREM2細胞特異性結合且呈膜定位，而與293T和293T-TREM1細胞均不反應，說明該6株抗體均可用于TREM2的特異性免疫熒光檢測。

圖8 TREM2單克隆抗體的免疫熒光應用Fig.8 Immunofluorescence application of TREM2 monoclonal antibodies

3 討論

單克隆抗體制備技術是現代生命科學研究的重要手段之一，隨著分子生物學和細胞生物學的發展，單克隆抗體制備技術也不斷發展完善，傳統的小鼠雜交瘤抗體制備技術因其技術成熟、操作相對簡單及條件要求較低等優勢，仍然是目前獲得單克隆抗體的常用方法［11-12］。隨著基因工程技術的快速發展，鼠源抗體的人源化改造技術也已經非常成熟。先制備鼠源抗體，再通過基因重組獲得人源化抗體，依然是目前抗體藥物研發的常用技術途徑［13］。

腫瘤相關巨噬細胞（tumor-associated macrophage，TAM）是腫瘤微環境中的主要免疫細胞。近年研究表明，表達于TAM的TREM2作為免疫抑制性受體，在腫瘤免疫逃逸中發揮了重要作用，是腫瘤免疫治療的又一潛在重要靶點［10，14-15］。為制備獲得TREM2特異性單克隆抗體，為后續抗體藥物的研發奠定基礎，本課題組設計了蛋白和質粒DNA，作為免疫小鼠的不同策略。但在用質粒作為抗原免疫的小鼠中，通過對血清效價進行檢測，未檢測到小鼠產生的抗TREM2抗體，其原因可能是經尾靜脈注射的DNA未能在小鼠體內有效表達導致不能激發小鼠對TREM2的免疫反應。在制備抗原蛋白GST-TREM2時，因其表達在大腸桿菌的包涵體中，通過蛋白變復性純化，雖然獲得的GST-TREM2蛋白純度不高（其中包括融合蛋白的降解產物），但用293T-TREM2細胞對抗血清效價進行檢測表明，小鼠對TREM2產生了有效的免疫反應。在融合后的首輪篩選中，先用293T和293T-TREM2細胞進行初篩，選取只與293T-TREM2細胞反應的進行克隆，用293T-TREM1和293T-TREM2細胞進行復篩，對仍與293T-TREM2細胞呈特異反應的克隆，通過后續的多輪亞克隆篩選，最終建立了58個陽性克隆株。選取其中29株進行抗體制備及細胞ELISA檢測，發現其中的24株可與TREM2特異性結合；通過ELISA對抗體親和力的初步檢測表明，所獲抗體的親和力都在nmol以上，表明抗體與抗原有較強結合力。為了解所獲抗體在不同免疫學實驗中的應用及對抗體特異性進一步驗證，對抗體進行了Western blot、免疫沉淀、流式細胞術和免疫熒光等檢測，結果表明不論TREM2蛋白是否變性，它們均能與TREM2特異反應，可用于不同免疫學實驗。同時表明抗體結合的表位為TREM2的一級肽鏈序列，而非蛋白的空間結構。

綜上，本研究獲得了多株TREM2特異性單克隆抗體，它們有較強的結合活性，并可用于不同免疫學實驗。在后續研究中，本課題組將評估所獲抗體對髓系細胞尤其是巨噬細胞極化和免疫功能的激活作用，并進一步探索其發揮作用的分子機制，為TREM2抗體藥物的研發提供依據。