納米抗體在自身免疫性疾病中的應用

敖正宏 王玥 梅雅賢 羅文新

（廈門大學公共衛生學院，國家傳染病診斷試劑與疫苗工程技術研究中心，廈門 361102）

自身免疫性疾病是由于機體免疫功能障礙，免疫耐受喪失，導致機體免疫系統識別自身抗原而產生的炎癥性疾病［1-3］。近年來，自身免疫性疾病的發病率逐漸上升，流行病學研究表明該類疾病已經影響了全球5%～8%的人口［4-6］。自身免疫性疾病可以發生在任何年齡，女性發病率高于男性，且受到環境、遺傳等因素的影響［7-10］。目前，這一異質性疾病已成為僅次于癌癥和心血管疾病的公共衛生負擔［11］。已知的自身免疫性疾病約有80種，包括類風濕關節炎、系統性紅斑狼瘡、多發性硬化等［5-6，11］。

自身免疫性疾病的發病機制目前仍不十分清楚。通常認為其發病受到遺傳和環境因素的影響，還與自身抗原的出現、免疫調節紊亂和基因表達異常相關［5］。目前，自身免疫性疾病的治療藥物主要有非甾體類抗炎藥、腫瘤壞死因子（TNF-α）抑制劑等，然而這些藥物會帶來嚴重的副作用，高達40%的患者對抗腫瘤壞死因子治療無反應［12-13］。研究發現，自身免疫性疾病的發病還與細胞因子有關，在自身免疫性疾病中，多種細胞因子及其在免疫細胞上的受體組成了高度復雜的網絡，從而驅動炎癥反應，靶向這些疾病相關分子的許多治療性抗體已被開發用于治療自身免疫性疾病［14］。常見的細胞因子靶點有IL-17、IL-23、粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子（GM-CSF）、TNF-α、、IL-6等。

1 納米抗體

1980～1995年，研究人員發現駱駝科動物和部分軟骨魚類體內存在天然缺失輕鏈的重鏈抗體，分別命名為重鏈抗體（heavy chain of antibodies，HCAbs）和Ig新抗原受體（immunoglobulin new antigen receptors，IgNARs），其抗原結合部位分別為HCAb的重鏈可變區（variable domain of heavy chain anytibodies，VHHs）和Ig-NARs的重鏈可變區（Ig-NARs heavy new antigen receptors，V-NARs），它們可以在體外單獨而穩定地存在，VHHs也被稱為納米抗體［15-17］。然而，由于駱駝類物種通常更容易獲取和處理，免疫后產生HCAb反應更強，并產生與人類具有較高同源性的免疫球蛋白，VHHs作為生物藥物比VNARs更有吸引力［18］。

納米抗體結合了單克隆抗體與小分子藥物的優勢，使其成為開發新治療藥物十分有潛力的方向［19］。納米抗體相比于傳統單克隆抗體，在治療自身免疫性疾病中具備許多優勢：第一，納米抗體的相對分子質量非常小，為12～15 kD，約為傳統單克隆抗體的1/10［19-20］。這有利于其穿透實體組織，透過血腦屏障，治療發病于中樞神經系統的自身免疫性疾病［21］。第二，納米抗體易于改造和連接。一種自身免疫性疾病的發病通常與多種細胞因子有關，納米抗體可以用甘氨酸-絲氨酸連接物連接，以獲得具有多種特異性的分子，同時靶向多種細胞因子及其受體［22-23］。納米抗體的組合具有協同阻滯作用，并不影響其阻斷功能，還可以增強親和力和特異性［24-25］。第三，避免毒性作用。納米抗體的半衰期通常較短，需要高劑量和頻繁給藥，但是目前已經找出了幾種解決方法，包括添加聚乙二醇、與人血清白蛋白結合或與傳統抗體的Fc段融合［25-26］。與人血清白蛋白結合產生了一個額外的優勢，即復合物將針對白蛋白積累的區域，主要是炎癥區域［27］。然而，對于某些特定應用而言，納米抗體快速腎臟清除和缺少Fc的效應功能可以避免毒性作用［25-26］。第四，易于開發和穩定生產。由于治療自身免疫性疾病的生物制劑通常靶向正常人體免疫細胞、生長因子、趨化因子等，最直接的藥物開發途徑為篩選全人源抗體。相比于傳統抗體，納米抗體沒有輕鏈，其制備適用噬菌體展示技術，避免了輕重鏈錯配的問題，降低了生產的難度與成本［20，28］。源于駝類動物的納米抗體與人同源性高達80%，使其在人體內表現低的免疫原性，且更易于人源化［21，29］。與傳統抗體相比，由于缺乏n-鏈寡糖的Fc段，納米抗體可以在微生物中表達，顯著節省了成本、人工和時間［30］。此外，納米抗體還具備溶解性好、親和力高、穩定性好、可以結合傳統抗體不易到達表位等優點［16，26，30-34］。

從駱駝科動物的外周血細胞中分離序列并將納米抗體克隆到噬菌體載體上，建立噬菌體文庫，并借助噬菌體展示技術可篩選出親和力高、特異性強的納米抗體［35］。天然庫、合成庫、免疫庫都可以用來獲取納米抗體，篩選特異性納米抗體的常見手段包括噬菌體展示、酵母展示、核糖體展示、深度測序等［36］。

2 納米抗體在自身免疫性疾病中的應用

近年來，靶向多種細胞因子，通過不同通路抑制免疫系統與自身抗原之間的致病性相互作用的新型生物制劑正在逐漸開發［11］。全球有多個研究機構開發了多種形式的納米抗體，可用于治療自身免疫性疾病（表1）。

表1 納米抗體在自身免疫性疾病中的應用Tab.1 Application of nanobody in autoimmune diseases

2.1 獲得性血栓性血小板減少性紫癜 血栓性血小板減少性紫癜是一種罕見的急性、危及生命的血栓性微血管病，以微血管病性溶血性貧血、消耗性血小板減少癥和器官損傷為特征［37］。先天性血栓性血小板減少性紫癜是ADAMTS13（血管性血友病因子VWF的切割蛋白酶）純合子或復合雜合子突變的結果，而獲得性血栓性血小板減少性紫癜是ADAMTS13嚴重缺乏引起的一種自身免疫性疾病［38］。獲得性血栓性血小板減少性紫癜通常發生在成年期，其患病率為10例/百萬，發病率為每年1～2例/百萬［39-40］。獲得性血栓性血小板減少性紫癜的免疫治療包括抑制抗ADAMTS13自身抗體產生，以及抑制VWF和血小板之間的相互作用［38］。

Caplacizumab（ALX-0081）是首個被批準上市的納米抗體藥物，用于治療獲得性血栓性血小板減少性紫癜［19］。它是一株靶向VWF的A1結構域的雙價納米抗體（圖1），在缺乏ADAMTS13蛋白酶的情況下，未切割的超大型VWF多聚體積累并誘導血小板過度結合和激活，導致播散性微血栓形成［40］。Caplacizumab與血小板計數反應時間減少有關，可抑制血小板和VWF多聚物之間的相互作用，減少血小板聚集和微血管血栓形成，降低了疾病的病死率和復發率［39］。Caplacizumab耐受性好，安全性高，最常見的副作用是輕微出血，通常很容易控制，大多數相關出血無需干預就可以解決［38］。在Caplacizumab臨床試驗中沒有死亡或難治性獲得性血栓性血小板減少性紫癜復發，相比之下，被批準用于治療獲得性血栓性血小板減少性紫癜的抗CD20的嵌合單抗藥物Rituximab可能會導致輸注反應和乙肝病毒再活化［37］。

圖1 用于治療自身免疫性疾病的納米抗體示意圖Fig.1 Schematic diagram of nanobodies for treatment of autoimmune diseases

2.2 銀屑病 銀屑病是一種常見的慢性炎癥性皮膚病，影響著全球2.5%的人口，并給患者帶來巨大的心理負擔［41］。銀屑病具有多種表型，癥狀包括瘙癢、灼燒感和疼痛［42］。在過去的十年中，已經開發出了針對銀屑病的高效靶向療法，即針對IL-17和IL-23的療法［43］。

M1095（ALX-0761）是一株三價雙特異性納米抗體（圖1），相對分子質量為40 kD，包括1個IL-17F特異性的N端部分，1個IL-17A和IL-17F結合的C端部分，以及1個與人血清白蛋白結合的中心構建塊，以延長血漿半衰期［41，44］。IL-17與許多人類炎癥和自身免疫性疾病的病理有關，如銀屑病、類風濕關節炎和多發性硬化。雖然IL-17A是IL-17家族最具特征的成員，但其最接近的親屬IL-17F具有相似的生物活性，甚至可能在體內發揮非冗余作用，兩者都以同質二聚體和異質二聚體的形式存在。因此，同時靶向IL-17A和IL-17F可以更有效地阻斷炎癥反應。在一項隨機、雙盲、安慰劑對照的1期臨床試驗中：多重上升劑量皮下注射M1095治療中重度銀屑病，結果顯示多次皮下注射M1095對治療銀屑病具有良好的安全性和劑量依賴性［45］。目前，該藥物處于2期臨床試驗階段［41］。

2.3 類風濕關節炎 類風濕關節炎是一種嚴重的慢性自身免疫性疾病，影響世界1%的人口［46］。其發病受到環境因素、自身行為因素等多種因素的共同影響［47］。類風濕關節炎不僅影響關節，還會影響內臟器官，甚至造成永久性殘疾。非甾體類抗炎藥、皮質類固醇和甲氨蝶呤可用于類風濕關節炎的治療，但會帶來嚴重的副作用［48-49］。

Vobarilizumab（ALX-0061）是一株用于治療類風濕關節炎的雙特異性納米抗體（圖1），相對分子質量為25.7 kD，包含2個人源化和序列優化的可變結構域：抗IL-6R結構域和抗人血清白蛋白結構域。Vobarilizumab單價相互作用消除了IL-6R的交聯，抗IL-6受體結構域阻斷IL-6與受體的結合，抗人血清白蛋白結構域顯著延長了其在血清中的半衰期［50］。多效性細胞因子IL-6在包括類風濕關節炎在內的多種疾病的發病機制中發揮重要作用［51］。IL-6可通過其可溶性受體（sIL-6R）或膜結合型受體（mIL-6R）誘導多種生物活性，與IL-6通路抑制相關的有害藥理學與mIL-6R抑制有關。因此，與同等形式的IL-6R抑制相比，優先抑制sIL-6R可以提供更好的治療效果和更低的副作用［52］。體外實驗表明，Vobarilizumab優先與可溶性受體sIL-6R結合，而重組人源化抗IL-6R的單克隆抗體Tocilizumab表現出對mIL-6R的優先活性［53］。ALX-0061優先抑制sIL-6R轉信號通路可以提供比Tocilizumab更好的治療效果和更低的副作用［52］。兩者雖然在2期臨床試驗中均顯示出相似的療效，但使用Vobarilizumab導致的不良事件更少。在一項為期24周的全球雙盲2期試驗中，研究人員對甲氨蝶呤穩定背景下活動性類風濕性關節炎患者的療效和安全性進行了評估，結果顯示在活動期類風濕關節炎患者中，Vobarilizumab單藥治療對疾病活動度有積極影響［54］。由于Vobarilizumab降低了疾病活動評分并導致了持久緩解的效果，同時最大程度地減少了副作用，研究結果支持將Vobarilizumab推進到3期臨床試驗。

Ozoralizumab是Ablynx開發的一株人源化三價雙特異性納米抗體（圖1），被開發用于治療類風濕關節炎，其相對分子質量為38 kD。包含3個結構域：2個抗TNF-α結構域和1個抗人血清白蛋白結構域。TNF-α是一種多效細胞因子，在調節免疫反應的炎癥級聯反應中起核心作用，在細胞和體液免疫的許多方面具有強大的作用［46，55］。在患者的滑膜液和滑膜中已經觀察到TNF-α水平的升高。TNF-α由于影響滑膜內的各種細胞，如巨噬細胞、滑膜細胞等，可引起局部炎癥和翳形成，導致軟骨侵蝕和骨破壞［46］。Ozoralizumab對人類TNF-α顯示出很高的親和力，在細胞基礎實驗中與etanercept在摩爾基礎上顯示了同等的效力，優于Adalimumab和Infliximab。藥代動力學分析顯示，Ozoralizumab在非人靈長類動物體內半衰期較長。Ozoralizumab已完成了1/2期臨床試驗，試驗中既滿足了主要終點，也滿足了次要終點，且沒有任何嚴重不良事件的報告［56］。2019年10月15日大正制藥公司在日本啟動了該藥物針對類風濕關節炎的擴展3期試驗。

2.4 系統性紅斑狼瘡 系統性紅斑狼瘡是一種復雜的自身免疫性疾病，主要癥狀為皮疹、陽光敏感和關節疼痛，高發于育齡婦女［57］。由于早診早治，患者生存率有顯著提高，但是系統性紅斑狼瘡患者的標準化病死率仍然比一般人群高4.6倍［58］。近幾十年來，系統性紅斑狼瘡的治療已經從使用羥氯喹、糖皮質激素和常規免疫抑制藥物轉變為生物制劑，Belimumab是迄今為止唯一一個被批準用于治療系統性紅斑狼瘡的生物制劑［57］。

鑒于IL-6在人類系統性紅斑狼瘡血腦屏障中的B細胞亢進和免疫病理中的重要作用，Vobarilizumab也被試驗用于治療系統性紅斑狼瘡［11］。Vobarilizumab阻斷IL-6R可抑制IL-6級聯反應和功能，體外實驗已證明它的高親和力［51］。在評估ALX-0061對系統性紅斑狼瘡患者的安全性和有效性的2期臨床試驗結果表明，該藥物具有強大的療效和穩定的安全性。

ATN-192是Ozoralizumab聚乙二醇化制成的藥物，特異性靶向TNF-α（圖1）［11］。TNF-α是活動性系統性紅斑狼瘡患者血清中高水平的促炎細胞因子，同時是一種凋亡誘導物，對T細胞、B細胞和樹突狀細胞的發育有重要作用，與疾病活動度和某些臨床表現有關。總之，TNF-α主要通過其促炎活性發揮有害的組織損傷作用，抑制TNF-α可以抑制系統性紅斑狼瘡的進一步活動［59］。ATN-192的一項針對健康志愿者的1期臨床試驗已成功完成，目前正在2期臨床試驗中。

2.5 過敏性哮喘 免疫球蛋白E（IgE）是人類血清中含量最低的抗體亞型。然而，它能引起強烈的過敏反應。IgE與其在肥大細胞和嗜堿性粒細胞上的高親和力受體FcεRⅠ相互作用是誘導過敏反應的必要條件［60-61］。Omalizumab（一種抗IgE的單克隆抗體）可以競爭性抑制IgE的循環，治療過敏性哮喘［62］。然而，IgE-FcεRⅠ復合物的解離非常緩慢，這種相互作用不受Omalizumab的影響。ALX-0962是一株雙特異性的納米抗體（圖1），包含2個結構域：抗IgE結構域和抗人血清白蛋白結構域。研究表明ALX-0962具有雙重作用：中和可溶性IgE，并在體外置換形成的IgE-FcεRⅠ復合物，與Omalizumab相比，可以更快地起效，改善哮喘的早期臨床癥狀。推測ALX-0962與破壞性IgE抑制劑類似，可能比傳統的抗IgE分子表現出更快的作用，從而增強治療效益［63］。該藥物目前處于臨床試驗階段［64］。

2.6 多發性硬化 多發性硬化是發病于中樞神經系統的炎癥性自身免疫性疾病，是年輕人最常見的神經疾病和致殘原因，其特征為炎癥、脫髓鞘斑塊和神經退行性病變［65-66］。趨化性細胞因子也稱為趨化因子，在炎癥免疫細胞進入中樞神經系統的過程中起著至關重要的作用。臨床和實驗證據表明，趨化因子CXCL10及其受體CXCR3與多發性硬化發病機制有關［65］。血腦屏障是生物制劑進入大腦的天然屏障，降低了藥物在中樞神經系統中的有效濃度［67］。而納米抗體因其體積小、高溶解性和穩定性以及有效的組織穿透性能，成為了治療中樞神經系統疾病有潛力的藥物［67-68］。3Nb12是一株靶向CXCL10的納米抗體，可以有效地阻止CXCL10通過CXCR3傳遞信號，從而抑制細胞趨化性，是治療多發性硬化候選藥物［65］。

2.7 其他自身免疫性疾病 此外，雖然自身免疫性疾病包括許多種類和不同的表型、臨床表現，但是它們通常具有一些相似的疾病特征，包括產生自身抗體、細胞因子失調、調節性T細胞失衡等［11，69］。因此目前研究人員不斷探索開發新的藥物，旨在同時治療多種自身免疫性疾病，抑制或減少這些自身免疫性疾病常見和共有的病理特征。

IL-23是一種中樞促炎細胞因子，其可通過IL-17和IL-22兩臂的正反饋調節作用產生無限炎癥循環，在慢性炎癥和自身免疫性炎癥疾病的發生發展中發揮重要作用［70］。研究人員將多價的靶向IL-23的納米抗體連接組裝在抗人血清白蛋白的納米抗體兩側，發現與單價納米抗體相比，多價的IL-23納米抗體在體外和體內均具有更高的人類IL-23中和能力，這種藥物是進一步開發治療克羅恩病、類風濕關節炎和銀屑病極好的候選結構藥物［71］。

趨化因子和趨化因子受體在免疫系統穩態中發揮關鍵作用，控制白細胞和其他造血細胞的激活、分化、遷移和生存。由于趨化因子受體系統在白細胞遷移中的作用，其是一個重要的炎癥介質。趨化因子或趨化因子受體長時間或不受控制的表達促進了白細胞異常滲入炎癥組織，這可能會導致炎癥、自身免疫性疾病或腫瘤生長、生存和轉移。研究發現靶向CXCR4和ACKR3的納米抗體有潛力治療哮喘、多發性硬化等多種自身免疫性疾病［72］。

3 結論與展望

納米抗體具有相對分子質量小、易于改造、可避免毒性作用等優點，是非常有前途的自身免疫性疾病的候選治療分子，易于開發和穩定生產的特點進一步增加了其作為治療藥物的前景。目前，人們已經對大量納米抗體進行了抗體工程改造，提高了它們的靶標特異性，改進的納米抗體廣泛用于多種疾病的治療和診斷［73］。

自身免疫性疾病中多種細胞因子及其在免疫細胞上的受體共同驅動炎癥反應，其致病機制十分復雜。然而，不同的自身免疫性疾病仍存在一些相同的疾病特征，這提示我們可以針對相關靶點來治療這些疾病共有的疾病特征，例如靶向IL-6R的納米抗體可能可以同時治療類風濕關節炎和系統性紅斑狼瘡；多價的納米抗體可以增強親和力和特異性，例如多價的靶向IL-23納米抗體具有更高的IL-23中和能力，有潛力治療多種自身免疫性疾病。

與此同時，納米抗體易于改造，通過抗體工程技術連接可以獲得具有多種特異性的分子。可以開發同時針對一個或多個促炎細胞因子或細胞因子受體的納米抗體，例如IL-17A和IL-17F，通過多種通路抑制免疫系統與自身抗原之間的致病性相互作用。結合納米抗體雙功能融合蛋白中額外的靶向特定器官或細胞因子的片段或模塊，不僅可以延長抗體在體內的半衰期，還可以選擇性地抑制致病的細胞因子，而不影響正常功能［74］。

綜上所述，開發靶向一個促炎細胞因子或細胞因子受體的多價納米抗體或同時靶向多個促炎細胞因子或細胞因子受體的多特異性納米抗體是開發治療自身免疫性疾病的藥物最有潛力的方向之一。