高分辨率基因組對家禽現代育種的挑戰

郭其新，胡亦舟，白 皓，常國斌

（揚州大學動物科學與技術學院，江蘇揚州 225009）

在過去的幾十年里，動物基因組學領域已經從一門尋求首次了解生命之樹基因組序列的學科轉變為一個致力解釋組裝全球所有生物的基因組序列，同時從一個只要求全力解決動物線性基因組的方法發展為從多維度解決基因組序列間的空間關系。第一個動物基因組序列于25 年前發表[1]。97Mb 的秀麗隱桿線蟲基因組組裝開創了動物基因組生物學的新時代，可以在基因組規模上研究遺傳模式和過程，并于2004 年完成人類第一個基因組組裝。隨著越來越多樣化的物種基因組組裝不斷積累，我們對基因組如何變化和塑造地球生物多樣性的了解也越來越豐富[2]。基因組質量的重大轉變是由兩個關鍵事件推動的。首先，高通量（一次對幾十萬到幾百萬條核酸分子進行序列測定）、短讀長（每條read 的長度在35～700bp）測序的發明提供了一種經濟手段，為任何可以獲得足夠DNA 的物種生成數百萬個讀長，這些約100bp 的短讀段可以組裝成有用的（盡管是碎片化的）基因組組件[3]。其次，長讀長測序的興起使得在同樣花費的基礎上增加讀長成為可能，這些讀長通常比短讀長長幾個數量級，從而產生更加連續的基因組組裝。截至2021 年6月，已對3278 種動物的核基因組進行了測序，并在美國國家生物技術信息中心（NCBI）Gen-Bank 數據庫中公開了組裝結果[4,5]。家禽作為全球重要的肉類和蛋類來源，對家禽基因組進行測序可能有益于家禽生產實踐、家禽健康和福利，也有利于我們了解動物不同表型的遺傳基礎，同時進一步加速了家禽育種目標的實現。除了這些更具應用性的研究領域之外，基因組測序還讓我們了解了這些物種和相關物種的進化途徑。近年來，隨著高分辨率基因組的組裝，從多維度解析家禽表型的遺傳基礎成為可能，但同樣對家禽的現代育種技術提出了新的挑戰。

1 測序技術的革命性發展促使基因組質量提高

1.1 線性基因組

DNA 測序是一個快速發展的領域，技術和平臺正在以驚人的速度更新。Sanger 和哈佛大學科學家Allan Maxam 和Walter Gilbert 獨立推出了自己的DNA 測序方法，徹底改變并促進了基因組學發展[6]。其主要采用DNA 復制原理。Sanger 測序反應體系中包括目標DNA 片段、脫氧三磷酸核苷酸（dNTP）、雙脫氧三磷酸核苷酸（ddNTP）、測序引物及DNA 聚合酶等。測序反應的核心就是其使用的ddNTP：由于缺少3'-OH基團，不具有與另一個dNTP 連接形成磷酸二酯鍵的能力，這些ddNTP 可用來中止DNA 鏈的延伸。此外，這些ddNTP 上連接有放射性同位素或熒光標記基團，因此可以被自動化的儀器或凝膠成像系統所檢測到。此后，該測序手段用于人類的第一個基因組序列以及人類健康關鍵模型（如大鼠和小鼠）的高質量基因組草圖[7,8]，同時也完成小鼠基因組計劃近交實驗室C57BL/J6 品系測序。然而，該測序方法仍然是一個昂貴的工作（每兆堿基序列約1000 美元）。新的短讀長測序技術（SRS）和平臺不斷發展，包括ABI SOLiD[9]、Roche 454[10]和Illumina[11]。這些技術在成本、樣本輸入、讀取長度和錯誤率方面都有其優缺點。隨后，Illumina 利用雙端測序方法完成了狗[12]、馬[13]、牛[14]、獼猴[15]、負鼠[16]和雞[17]等物種基因組序列組裝。雖然這些基因組極大促進了這些物種的發展，但這些物種的基因組中存在大量的空白序列無法組裝，這主要是由于測序讀長較短和連續性較低導致。認識到長讀長和連續性對基因組草圖的重要性。基因組組裝的新技術[18]（如Dovetail 的鄰近連接）和長讀長測序技術（long-read sequencing，LRS），如PacBio 的單分子實時（single molecule real time sequencing，SMRT）[19]、Chromium 10x[20]、Oxford Nanopore技術[21]和Bionano 基因組作圖技術[22]的發展。為了進一步獲得高質量的基因組，通過分別組合SRS 和LRS 以及組裝工具生成不同的組裝策略對當時黃金標準基因組的改進，如人類構建的GRCh38 使用Bionano 等光學繪圖儀來確認組裝和細化單倍型[23]；此外，高覆蓋度虎皮鸚鵡（Melopsittacus undulatus）基因組是使用多種測序技術生成的[24]，包括SRS（Roche 454 和Illumina）和LRS（PacBio）及類似的de novo 山羊（Capra hircus）參考基因組是結合PacBio、Illumina 和Bionano 方法生成了迄今為止最連續的哺乳動物基因組之一，但依然缺乏類似于著絲粒等復雜區域的序列信息。為了填補基因組中缺乏的著絲粒等位置的序列，科學家們設計了一種基于轉座酶結合BAC 文庫的方案，使用納米孔測序（MinION 測序技術）產生BAC 文庫DNA 的高讀數覆蓋。如在轉座酶中用單個切割位點線性化圓形BAC 并添加測序接頭，從而實現整個插入片段的完整、端到端序列覆蓋，這使得完整測序著絲粒序列成為可能。在此基礎上，科學家們近年來完成了人[25-27]、雞[28]以及魚[29]等動植物的完整端粒到端粒的完整基因組（T2T）。

1.2 泛基因組

隨著大規模基因組研究的發展，人們發現單一參考基因組模式無法代表物種水平的遺傳多樣性。畜禽往往具有復雜的起源和遷徙路線，這表明當前參考基因組中可能遺漏了一些種群特異性序列。相反，泛基因組是一個物種所有DNA 序列的集合，包含所有個體共享的序列（核心基因組），并且還能顯示每個個體獨有的序列信息（可變基因組）。人類、植物和家畜泛基因組研究進展表明，通過泛基因組研究可以探索缺失的遺傳成分和大結構變異（SV）的識別。許多個體特異性序列已被證明與生物適應性、表型和重要的經濟性狀相關。泛基因組可以在分析單個參考基因組的基礎上補充缺失的遺傳信息，挖掘隱藏的遺傳變異，展示物種水平上真正的遺傳多樣性[30-32]。此外，許多研究表明，以泛基因組為參考，可以顯著提高讀段映射率、轉錄組比對效率以及一些罕見和大變異的檢出率[32-34]。此外，泛基因組研究的一個重要組成部分是檢查新發現的基因的生物學功能。泛基因組可以識別通常屬于非核心基因組的非參考序列，并且可能對生物體的適應性產生重要影響[35]。因此，分析它們在個體中的分布以及所包含基因的功能可以更好地了解物種對極端環境的適應。構建真核生物的全基因組必須考慮基因組內的所有DNA 序列，才能真正發揮全基因組的參考對象作用。由于測序技術、成本和基因組復雜性等限制，真核全基因組研究起步晚于原核全基因組。直到2009 年，基于人類基因組計劃[36]和多個參考基因組組裝完成[37-39]，泛基因組才被應用于人類基因組學研究。動植物泛基因組研究從2013 年才逐步開展。最近有兩個關于雞泛基因組的研究，第一個是使用迭代作圖和組裝方法構建的，使用了664 個個體的WGS 數據和參考基因組構建的泛基因組，基于該泛基因組鑒定了參考基因組(GRCg6a)中不存在的約66.5Mb 編碼4063 個高可信度基因序列，通過鑒定了大量的存在/ 不存在變異（PAV）變異，基于PAV 的全基因組關聯研究發現了許多與生長、胴體成分、肉質或生理性狀相關的候選突變。其中，IGF2BP1 啟動子區域的缺失影響雞體大小[40]；另外一個是通過組裝世界范圍內20 個代表物種的基因組構建的一個雞的泛基因組，該泛基因組主要利用20 個高測序深度從頭組裝的基因組構建了來自世界范圍內的雞泛基因組，并鑒定了GRCg6a 中未發現的1,335 個蛋白質編碼基因和3011 個長非編碼RNA[41]。這些研究挖掘了一些新的遺傳變異，為解析表型提供了新的思路，在一定程度上為家禽育種提供了一些新的見解。

1.3 3D 基因組

3D 基因組是指基因組在空間和時間上的折疊方式，這是一個在生物學領域備受關注的問題。通過開發一系列前所未有的高分辨率方法，如染色質構象捕獲、高分辨率光學和電子顯微鏡等技術，我們對基因組架構和功能有了全新的認識。眾所周知，人類DNA 長2m，這種DNA 如何經歷巨大的壓縮以適應細胞核的微小空間（直徑約20μm）一直是細胞生物學的主要謎團之一。核小體的重復單元（146bp 的DNA 包裹在組蛋白核心八聚體周圍）組織成10nm 的 “串珠”[42]。然而，需要進一步壓縮以使DNA 適合細胞核。長期存在的模型假設染色質以分層方式折疊成更高階的結構，其中包括通過連接組蛋白H1 將10nm 纖維折疊成30nm 纖維，然后折疊成更大的結構[43,44]。組蛋白除了壓縮DNA 之外，還可以通過對其尾部進行翻譯后修飾來主動控制基因表達，從而共同生成表觀遺傳 “組蛋白密碼”[45]。特定的組蛋白 “標記” 與基因組的活躍區域和沉默區域相關，因此被認為會產生不同水平的染色質壓縮和高階結構。也就是說，基因組的一部分似乎包含未修飾的組蛋白[46,47]，并且抑制性組蛋白標記有時也可以在活性啟動子中找到[48]，強調需要更好的工具來可視化和繪制組蛋白標記、基因組之間的精確關系、結構和功能。常染色質、異染色質和細胞核中個體染色體區域的假說的重提[49,50]以及熒光原位雜交（FISH）的新型成像技術的發展使得染色體區域假說最終得到驗證。隨著新的成像和基因組技術的出現，推動了核結構研究[51-53]。同時，FISH 方法證明了染色體區域和區域邊緣染色體混合的存在，也表明富含活性基因的染色體區域主要位于核內部，而富含非活性基因的染色體區域主要位于核外圍[54-63]。在此基礎上，綜合全基因組測序（Whole Genome Sequencing，WGS）、RNA-seq、Hi-C 等技術，解析北京鴨的三維基因組空間構象[64]以及利用Hi-C 技術對水稻染色質的三維結構進行了全基因組解析[65,66]。3D基因組揭示了基因組在超分辨率和活細胞成像下的組織結構，為我們提供了基因組功能的新視角，發現一些以前沒有發現的基因組空間結構層次的變異。同時，這種高分辨率成像也挑戰了我們對基因組的傳統理解，推動了科學界對基因組認識的深化，也為育種技術提出了新的挑戰。

2 家禽現代育種發展現狀

2.1 基因組選擇在現代育種中的應用現狀

育種是指人類驅動的培育和增強動物物種的過程，其中涉及干預其生物進化。在過去的一個世紀里，育種方法不斷從傳統方法向現代方法發展以滿足人類的需求。動物馴化始于大約幾千年前，標志著動物育種的開始。在這個階段，人們通過目視評估野生動物的表型性狀，并根據需要對其進行馴化。1865 年，孟德爾遺傳定律的發現標志著動物育種傳統時代的開始，當時主要的育種技術是雜交育種等。這一時期的動物育種研究主要集中在雜交和統計分析上，且耗時較長。傳統育種技術無法精確操縱和選擇特定基因從而導致選育效果較差。分子生物學的快速進步促進了分子標記輔助育種的發展，它利用分子標記來反映個體或群體之間的變異或多態性。利用這些標記來識別雜交后代中的目標基因，可以最大限度地減少育種過程中的人類和環境干擾，并加速整個育種進程。標記輔助育種可以同時檢測多個或連鎖基因。但這項技術需要大量的高質量DNA，且價格昂貴。2001 年，Meuwissen 等[67]引入了基因組選擇（GS）。使用訓練群體的基因型和表型數據構建基因組預測模型，然后利用已知的基因型和表型數據預測候選個體的基因組估計育種值（GEBV）。GS 技術同時評估多個全基因組標記在由基因分型和表型個體組成的訓練群體中的作用，從而顯著提高選擇效率。因此，基于GS 的育種仍然是一項具有很大發展潛力的開創性技術。近年來，在牛等動物中開展了一系列開展基因組選擇的報道，如肉牛[68]、奶牛[69]、豬[70]和雞等[71]。對于肉雞，同樣也使用不同模型（如PBLUP、GBLUP 和ssGBLUP）的預測準確性和遺傳參數進行了估計[72-75]。

2.2 基因組編輯技術在育種中的現狀

過去幾十年內，隨著基因組編輯技術的發展，使其能對基因組進行精確編輯。基因組編輯技術在家禽業及整個畜牧生產中的應用在過去十年中得到了改善[76]。3 種常用的基因組編輯技術用于家禽生產，如鋅指核酸酶（ZFN）、轉錄激活因子樣效應核酸酶（TALEN）以及成簇規則間隔短回文重復序列（CRISPR）相關蛋白 9（CRISPR/Cas9）是最常見且最先進的基因組編輯技術，其中，CRISPR/Cas9 技術在雞和鵪鶉中的應用取得了實質性進展，例如，最近的一個研究通過對雞的ANP32 蛋白家族的ANP32A 基因中的N129I 和D130N 氨基酸基因編輯，消除了甲型流感病毒(IAV)的感染和傳播[77]；此外，通過對雞DF-1 細胞的NHE1 基因的關鍵氨基酸殘基進行編輯，使得該細胞獲得對ALV-J 感染的獲得性抗性[78]；與此同時，日本鵪鶉MSTN 中的非移碼突變導致體重和肌肉質量顯著增加。使用CRISPR/Cas9 通過基因突變破壞或去除MSTN 會抑制其抗生肌功能，從而導致MSTN 敲除雞的肌肉質量增加[79]。CRISPR 技術并非旨在取代傳統育種系統，而是為育種者提供更多可供選擇的遺傳變異，因為使用傳統育種獲得遺傳增益在向特定種群內引入遺傳變異方面存在局限性，使用CRISPR/Cas9 系統引入遺傳變異可用于改善家禽的性能，在一定程度上加速了育種的進程，實現更高的遺傳進展。

3 家禽高分辨率基因組下現代育種的優勢和挑戰

3.1 家禽高分辨率基因組為現代育種帶來的優勢

基因組測序計劃完成開啟了遺傳育種研究的新紀元，但占基因組98%的非編碼區域功能研究很少，調控元件注釋也尚不清晰，這嚴重制約了經濟性狀分子機理解析及基因組育種技術創新。隨著高分辨率基因組組裝以及泛基因組組裝，可以很大程度上促進從多水平（基因組、表觀修飾、轉錄、翻譯和蛋白等）解析性狀發生的分子調控機制和致因基因/ 變異。最近有研究發現，通過結合數量表觀遺傳學和群體表觀遺傳學等表觀信息開展基因組選擇發現表觀遺傳變異能夠解釋65%的表型變異。此外，基于鑒定SNPs 是否位于表觀功能基因組區域進行分類，將表觀基因組信息引入GFBLUP（genomic feature best linear unbiased prediction）模型，其預測準確性相比傳統GBLUP 有所提高。此外，隨著新的成像和基因組測序以及組裝技術的出現，基因組正以前所未有的細節水平可視化，同時結合基因組選擇，可以最大程度提高育種值估計準確性。此外通過結合高分辨率基因組和泛基因組，可以為精確的設計育種提供更精確的位點調控信息，為基于基因組編輯技術構建的設計育種提供幫助。

3.2 家禽高分辨率基因組下現代育種面臨的挑戰

隨著越來越多物種的高分辨率基因組的組裝，在一定程度上為現代育種提供了一定的幫助。但是也為現代育種技術提出了新的挑戰，主要分為以下幾個方面：①多組學水平復雜性狀的解析。雖然目前的高分辨率基因組已經可以解釋大多數性狀的調控發生機制以及致因突變，但是目前用于基因組選擇的組學數據均是在組織水平進行。隨著單細胞和空間表觀組測序發展，從單細胞時空水平解析表型的發生調控機制和致因突變成為新的方法，但是這也導致從多尺度解析表型發生機制更為復雜，如何在多組學水平解析表型發生的致因突變是目前現代育種中面臨的新一輪挑戰；②新算法的開發。在現代高分辨率基因組下，多個尺度（基因組、表觀調控水平、轉錄水平、翻譯水平和蛋白水平）調控表型形成的變異信息被鑒定，導致需要更強大的算力要求，因此需要開發一些在不損害準確性的情況下的壓縮算法，減少算力的消耗，降低計算的時間。此外，隨著越來越多變異信息的加入，目前的算法可能不太適用于多尺度的計算，為了引入更多的基因組信息，為每個水平變異設置權重（基于其對表型發生的貢獻率）可以更高水平的提高現代育種的準確率。

4 總結與展望

綜上所述，高分辨率基因組在家禽育種中的研究和應用尚處于起步和發展階段，還有許多挑戰和領域中有待探索和解決的問題，但是已有的研究方法和初步成果為現代家禽育種提出了廣闊的發展前景。同時隨著家禽高分辨率基因組的不斷完善，家禽重要經濟性狀的基因組候選區域和致因變異為開展家禽現代設計育種提供了重要的支持。