導(dǎo)航模板注射鋰基生物玻璃水凝膠修復(fù)股骨頭壞死的效應(yīng)研究

馬橋橋,吳澤睿,查國(guó)春,郭開(kāi)今,蔣守海,張傳開(kāi)*

(1.徐州仁慈醫(yī)院關(guān)節(jié)外科,江蘇 徐州 221000;2.徐州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院關(guān)節(jié)外科,江蘇 徐州 221000)

股骨頭壞死(osteonecrosis of the femoral head,ONFH)是一種涉及骨細(xì)胞壞死的骨關(guān)節(jié)疾病,表現(xiàn)為骨細(xì)胞和骨髓成分進(jìn)行性死亡,引起股骨頭塌陷,最終發(fā)展為髖關(guān)節(jié)炎,導(dǎo)致髖關(guān)節(jié)疼痛和功能喪失,嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量[1-2]。據(jù)統(tǒng)計(jì),中國(guó)至少有超800萬(wàn)人罹患股骨頭壞死,而全球范圍內(nèi)股骨頭壞死患者每年增加3～5萬(wàn),且多數(shù)為中青年患者[3]。由于修復(fù)壞死骨難度大、高致殘率以及一些患者需長(zhǎng)期使用激素,股骨頭壞死一直受到廣泛關(guān)注[4]。對(duì)于發(fā)展為骨塌陷或是骨關(guān)節(jié)炎的股骨頭壞死患者,可能需要實(shí)施全髖關(guān)節(jié)置換術(shù)(total hip arthroplasty,THA),但中青年患者更希望避免或是推遲這種手術(shù)。因此,早期治療股骨頭壞死十分必要[5]。

基于生物材料的工具在骨重建方面具有廣闊的應(yīng)用前景。然而,目前只有少數(shù)生物材料是專門(mén)為激素引起股骨頭壞死設(shè)計(jì)。據(jù)報(bào)道,聚醚醚酮或鈦棒等材料在改性后表現(xiàn)出良好的骨再生性能[6-7]。然而,有效物質(zhì)用完后,其原有的生物惰性就會(huì)暴露出來(lái)。例如,鈦棒產(chǎn)生的磨屑會(huì)導(dǎo)致骨溶解。因此,理想的生物材料在修復(fù)壞死骨細(xì)胞后也應(yīng)該能夠順利降解。介孔生物玻璃納米顆粒(mesoporous bioglass nanoparticles,MBN)因其獨(dú)特的工藝、更大的比表面積、更高的載藥量和更好的釋放性能,多年來(lái)一直是人們關(guān)注的焦點(diǎn)[8]。因此,它適合作為藥物輸送載體或生物注射材料。通過(guò)調(diào)整比例和添加元素,可以制備出不同性能的MBN,以達(dá)到不同的效果[9]。然而,MBN是一種剛性修復(fù)材料,無(wú)法協(xié)調(diào)骨再生。此外,由于其物理特性,它不能固定和聚集在缺陷中。因此,對(duì)MBN進(jìn)行修飾和性能優(yōu)化,可能會(huì)更有利于股骨頭壞死區(qū)的骨修復(fù)。

近年來(lái),治療性離子鋅、鈣、鎂、鋰等金屬離子被作為生物材料的組成部分受到人們的關(guān)注,因?yàn)樗鼈儗?duì)成骨有積極作用。眾所周知,鋰(Li)是人類(lèi)營(yíng)養(yǎng)中一種重要的微量營(yíng)養(yǎng)素,是治療雙相情感障礙的一線藥物。先前的研究表明,氯化鋰(LiCl)促進(jìn)成骨,加速骨折愈合時(shí)間。Huang等[10]將LiCl應(yīng)用于骨質(zhì)疏松模型,證明LiCl有利于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖,并通過(guò)調(diào)節(jié)自噬促進(jìn)成骨。Peng等[11]發(fā)現(xiàn),適當(dāng)添加鋰可以增強(qiáng)細(xì)胞附著并刺激成骨。Geng等[12-13]的研究已經(jīng)證明,LiCl可能通過(guò)抑制破骨細(xì)胞分化和促進(jìn)成骨來(lái)促進(jìn)界面骨整合,以及具有調(diào)節(jié)納米鈦顆粒刺激的巨噬細(xì)胞極化和促進(jìn)成骨方面的作用。然而,到目前為止,關(guān)于鋰對(duì)血管生成分化潛能的影響以及具體機(jī)制,人們還知之甚少。此外,金屬離子與MBN結(jié)合的方式、結(jié)合濃度的選擇以及釋放金屬離子的穩(wěn)定性還有待進(jìn)一步探索,因?yàn)榈蜐舛葻o(wú)效,而高濃度可能引起中毒。

利用3D打印技術(shù)制作股骨頭壞死病灶區(qū)導(dǎo)航模板,可以精確定位骨壞死區(qū)域,有效清除壞死病灶[14]。甲基丙烯酰化明膠(gelatin methacryloyl,GelMA)是一種半天然合成水凝膠,具有成熟的合成技術(shù)[15],其高度的生物相容性和豐富的孔隙使細(xì)胞和血管能夠更自由地附著和發(fā)育[16-17]。甲基丙烯酰的接枝使得GelMA能夠光固化并具有可塑性和緩釋能力[18-19]。在本研究中,筆者制備了一種可注射鋰基生物玻璃水凝膠(GelMA and Li-mesoporous bioglass,GM/M-Li),并利用3D打印導(dǎo)航模板精確注入GM/M-Li填充壞死病灶區(qū),為促進(jìn)股骨頭壞死的骨修復(fù),提供了一種新的策略,現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 時(shí)間及設(shè)計(jì) 2019年9月至2022年3月,前瞻性隨機(jī)對(duì)照研究。

1.2 材料與準(zhǔn)備

1.2.1 鋰基介孔生物玻璃(Li-mesoporous bioglass,M-Li)的合成 根據(jù)文獻(xiàn)合成了MBN[20],按照說(shuō)明合成M-Li[21]。以十六烷基三甲基溴化銨為模板劑,在60 ℃下將7.092 g三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽粉末溶于250 mL去離子水中,然后將1.5 g十六烷基三甲基溴化銨與溶液混合。當(dāng)溶液攪拌至澄清后,向溶液中滴加10.8 mL正硅酸乙酯、0.9 mL磷酸三乙酯、2.45 g四水合硝酸鈣[Ca(NO3)2·4H2O]和0.125 g LiCl,溫和攪拌約30 min。之后將溶液猛烈攪拌16 h,直到它變成乳白色。收集沉淀物,用無(wú)水乙醇和去離子水輪流洗滌3次,離心后沉淀在60 ℃烘箱中干燥24 h,最后將固體研碎并在650 ℃空氣中煅燒3 h,設(shè)置溫度每分鐘上升2 ℃。結(jié)束后將得到的M-Li粉末收集在試管中備用。

1.2.2 水凝膠的制備 以苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰膦酸鋰(LAP)為光引發(fā)劑。簡(jiǎn)單地說(shuō),在5 mg LAP中加入20 mL磷酸鹽緩沖液,在50 ℃下攪拌,直至透明,遠(yuǎn)離光線。然后,在50 ℃下,將50 mg凍干的GelMA加入1 mL LAP溶液中,持續(xù)攪拌,與溶液合成預(yù)聚體。待溶液完全溶解后,在紫外光(EFL-ls-1600-405,蘇州,中國(guó))照射5～10 s。在預(yù)聚物溶液中加入3%(w/v終值)的MBN或M-Li粉末,混合均勻,然后在紫外光下曝光5～10 s,得到生物水凝膠(GM/M)和GM/M-Li。

1.2.3 M-Li的表征 為了分析M-Li樣品的形貌,分別進(jìn)行掃描電鏡(scanning electron microscope,SEM)、透射電鏡(transmission electron microscope,TEM)觀察M-Li,此外,采用小角X射線衍射(small angle X-ray diffraction,SA-XRD)對(duì)Cu源進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析。

1.2.4 GelMA、GM/M和GM/M-Li水凝膠的表征 為了觀察GelMA、GM/M和GM/M-Li水凝膠的微觀結(jié)構(gòu)形態(tài),在12.5 kV電壓下制備樣品并進(jìn)行SEM分析。利用傅里葉紅外光譜(學(xué)研會(huì)科研平臺(tái),鄭州,中國(guó))發(fā)現(xiàn)GelMA、GM/M和GM/M-Li水凝膠中的鍵變化(對(duì)樣品和背景進(jìn)行32次掃描,4 cm-1分辨率,波長(zhǎng)范圍為400～4 000 cm-1)。

1.2.5 測(cè)試壓縮模量及穩(wěn)定性 將水凝膠制成直徑為9 mm、厚度為3 mm的圓盤(pán),用機(jī)械試驗(yàn)機(jī)(上海恒儀精密儀器有限公司,中國(guó))以1 mm/min的下降速率進(jìn)行測(cè)量。在37 ℃下,用流變應(yīng)力6 000流變儀(Thermo Scientific)對(duì)水凝膠進(jìn)行流變學(xué)測(cè)試,以分析水凝膠的穩(wěn)定性。

1.2.6 離子釋放試驗(yàn) 將水凝膠制成直徑9 mm、厚度3 mm的圓盤(pán)。然后將模擬體液(士諾達(dá)生物科技有限公司,安徽,中國(guó))在37 ℃下,勻速搖床上浸泡7、14、21和35 d。最后在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)收集上清液,通過(guò)BioTek(侖昌碩生物科技有限公司,中國(guó))檢測(cè)。

1.2.7 細(xì)胞培養(yǎng)物制備 RAW 264.7細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)。從兔體內(nèi)分離骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在α-MEM中培養(yǎng),均加入10%胎牛血清和1%青霉素/鏈霉素,在37 ℃、5% CO2下的氣氛中培養(yǎng)。在細(xì)胞培養(yǎng)工作之前,納米顆粒在紫外燈下乙醇中消毒一夜,然后用消毒過(guò)的磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline,PBS)洗滌。

1.2.8 細(xì)胞活力和增殖評(píng)價(jià) 采用Live/Dead染色法(Invitrogen公司,美國(guó))檢測(cè)各組水凝膠的細(xì)胞活力。簡(jiǎn)單地說(shuō),用不同組的水凝膠提取物將骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(1.0×104個(gè)細(xì)胞/孔)接種在爬行細(xì)胞上。培養(yǎng)1 d后,去除培養(yǎng)基,用活/死染色試劑盒避光染色,然后用熒光顯微鏡(蔡司,德國(guó))觀察樣品。

1.2.9 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn) 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)(cell counting kit-8,CCK-8)試劑(新賽美生物科技有限公司,蘇州,中國(guó))用于本研究。將骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(5×103個(gè)/孔)接種于96孔板(100 μL/孔)。第1、3和5天,更換為100 μL新鮮培養(yǎng)基(含10% CCK-8溶液),在37 ℃、5% CO2下孵育。2 h后,平板用酶標(biāo)儀(Biotek,USA)在450 nm光密度下進(jìn)行驗(yàn)證。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)胞形態(tài)及免疫熒光染色 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(每孔2×104個(gè)細(xì)胞)接種在水凝膠盒上,在37 ℃、5% CO2下孵育3 d。到達(dá)時(shí)間點(diǎn)時(shí),樣品在4%多聚甲醛(paraformaldehyde,PFA)的冰上固定1 h。之后去除固定物并洗滌,然后用不同濃度的乙醇溶液(30%、50%、70%、80%、90%、95%和100%)脫水,每個(gè)15 min。隨后用CO2臨界點(diǎn)干燥儀干燥約2 h,噴金45 s。最后通過(guò)SEM采集圖像。

1.3.2 羅丹明染色 將骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(1×104個(gè)/孔)接種于24孔板中不同組的水凝膠提取物中。孵育12 h和48 h后,溫和洗滌樣品,隨后在冰上加4% PFA 30 min。然后去除固定物,加入0.1% Triton X-100(Sigma-Aldrich,USA)10 min。PBS洗滌3次后,將羅丹明(翌圣科技有限公司,上海,中國(guó))按1︰500的比例溶于PBS中,溫和添加到孔中。37 ℃孵育1 h后,用4’,6-二脒基-2-苯基吲哚(4,6-diamidino-2-phenylindole,DAPI)對(duì)細(xì)胞核進(jìn)行染色,樣品用熒光顯微鏡采集(蔡司,德國(guó))。

1.3.3 堿性磷酸酶活性 用堿性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)測(cè)定試劑盒(碧云天生物技術(shù),上海,中國(guó))測(cè)定成骨能力。將不同組的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(1×104個(gè)細(xì)胞/孔)接種在24孔板上。7 d后,在4% PFA中洗滌3次并固定后,加入ALP染色液(300 μL/孔),避光至少30 min。最后在光學(xué)顯微鏡下觀察陽(yáng)性細(xì)胞。

1.3.4 成骨礦化分析 磷酸鈣是評(píng)價(jià)成骨特性的關(guān)鍵因素。因此,本研究使用茜素紅S(alizarin red S,ARS)染色試劑盒(塞葉,廣州,中國(guó))進(jìn)行驗(yàn)證。將不同組的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(1×104個(gè)/孔)以水凝膠的方式接種在24孔板上。培養(yǎng)21 d后,分別洗3次,4% PFA固定30 min,每孔加入ARS染色液,室溫下保證細(xì)胞完全覆蓋約1 h。然后,細(xì)胞被清洗幾次以充分去除染料。用光學(xué)顯微鏡觀察得到鈣結(jié)節(jié)。為了定量ARS染色,每孔加入5%過(guò)氯酸,在吸光度(optical density,OD)490 nm處測(cè)量。

1.3.5 血管生成評(píng)價(jià) 為了觀察水凝膠的血管生成能力,使用生長(zhǎng)因子降低的基質(zhì)凝膠(100 μL/孔,康寧,美國(guó))。播種細(xì)胞前,每孔加入60 μL基質(zhì),37 ℃孵育30 min成膠。然后用水凝膠提取液將人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein,HUVECs)(3.5×104個(gè)/孔)接種到每孔中。在37 ℃、5% CO2下孵育后,用光學(xué)顯微鏡在0、3和6 h觀察并采集,結(jié)果通過(guò)Image J進(jìn)行分析。

1.3.6 遷移實(shí)驗(yàn) 將GelMA、GM/M或GM/M-Li水凝膠提取物置于下腔,而將200 μL HUVECs懸液(2.5×105個(gè)/mL)置于上腔,在37 ℃、5% CO2下孵育。培養(yǎng)16 h后,取出小室,用棉簽小心去除膜上部,在4% PFA中固定20 min。然后用0.1%的結(jié)晶紫溶液(索萊寶,北京,中國(guó))對(duì)細(xì)胞染色并在顯微鏡下觀察。用Image J對(duì)結(jié)果進(jìn)行量化。

1.3.7 劃痕實(shí)驗(yàn) 劃痕實(shí)驗(yàn)是評(píng)價(jià)血管生成的一種方法。簡(jiǎn)而言之,將HUVECs(4×105個(gè)/孔)接種到6孔板中,在37 ℃、5% CO2下孵育。當(dāng)細(xì)胞90%融合后,用200 μL移液管尖端在細(xì)胞層形成劃痕。用無(wú)菌PBS沖洗3次以清除細(xì)胞碎片,用含GelMA、GM/M或GM/M-Li水凝膠提取物的0.5%血清替換培養(yǎng)基。在0、12和24 h,使用倒置顯微鏡捕捉圖像。用Image J計(jì)算相應(yīng)的數(shù)據(jù)(即遷移區(qū)域)。

1.3.8 體外抗炎評(píng)價(jià) 體外采用RAW 264.7細(xì)胞觀察Li+對(duì)炎癥反應(yīng)的影響。簡(jiǎn)單地說(shuō),將1×104的RAW 264.7細(xì)胞接種到24孔板中,在37 ℃、5% CO2下孵育。培養(yǎng)12 h后,用100 ng mL-1的脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)和25%葡萄糖(高糖)誘導(dǎo)細(xì)胞再培養(yǎng)12 h。然后,細(xì)胞固定0.5 h,然后用0.1% Triton X-100(Sigma-Aldrich,美國(guó))固定10 min。然后,一抗一氧化氮合酶(M1標(biāo)記物)和Arg1(M2標(biāo)記物)用F4/80與細(xì)胞孵育,在4 ℃保存過(guò)夜。第2天,用PBS沖洗3次后,避光加入二抗。孵育1 h后,充分洗滌細(xì)胞后加入DAPI。熒光顯微鏡拍攝圖片。

1.3.9 實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)定量分析 向6孔板細(xì)胞中加入1 mL Trizol,裂解5 min。(1)裝入1.5 mL EP管,加入200 μL氯仿,充分搖勻,冰上靜置10 min;(2)12 000轉(zhuǎn)/min,4 ℃離心15 min;(3)小心吸取透明上清液,轉(zhuǎn)移至新EP管,加入等量異丙醇,輕輕混勻,冰上靜置10 min;(4)12 000轉(zhuǎn)/min,4 ℃離心15 min;(5)棄上清,擦凈內(nèi)壁液體,配置75%乙醇-焦碳酸二乙酯水,沖洗核糖核酸(ribonucleic acid,RNA)沉淀,12 000轉(zhuǎn)/min,4 ℃離心15 min;(6)棄上清,加入20 μL焦碳酸二乙酯(diethyl pyrocarbonate,DEPC)吹勻,測(cè)RNA濃度;(7)將樣品測(cè)得的RNA濃度按1 μg總量進(jìn)行配平,加入100 μL DEPC水逆轉(zhuǎn)錄,獲得互補(bǔ)mRNA的脫氧核糖核酸分子(complementary DNA,cDNA)。將所獲得的cDNA按照,2 μL cDNA、5 μL SYBR qPCR master mix、1 μL Primer 1+Primer 2、2 μL雙氧水配置擴(kuò)增體系后上機(jī)。

1.3.10 GelMA、GM/M和GM/M-Li水凝膠條件培養(yǎng)基的制備 收集水凝膠條件培養(yǎng)基進(jìn)一步誘導(dǎo)骨生成和血管生成。簡(jiǎn)單地說(shuō),RAW264.7細(xì)胞(每孔4×105個(gè)細(xì)胞)在含有10%胎牛血清的6孔板上,在培養(yǎng)基中,在37 ℃、5% CO2下培養(yǎng)。孵育12 h后,用100 ng/mL的LPS誘導(dǎo)培養(yǎng)基12 h。最后,分別收集不同組的上清液,在無(wú)菌環(huán)境下過(guò)濾,去除凝膠和細(xì)胞碎片。濾液保存在-80 ℃,用于培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞和HUVECs。

1.3.11 動(dòng)物模型 動(dòng)物方案經(jīng)醫(yī)院動(dòng)物倫理委員會(huì)(倫理號(hào)202103A481)批準(zhǔn)。所有動(dòng)物均養(yǎng)在單獨(dú)的籠子里,溫度25 ℃,濕度55%。為建立股骨頭壞死兔模型,參照文獻(xiàn)造模方法[22-23],為降低造模死亡率,對(duì)造模方式進(jìn)行改良。使用LPS聯(lián)合用甲波尼龍琥珀酸鈉(MP,輝瑞制藥,500 mg)。首先,前3天每天1次于動(dòng)物臀中肌肌注(50 mg/kg)。第4天行兔耳緣靜脈注射LPS,20 μg/kg劑量。造模時(shí)間6～8周。通過(guò)病理組織學(xué)及Micro-CT檢測(cè)空骨陷窩率、骨細(xì)胞凋亡率、股骨頭囊性變等指標(biāo)評(píng)價(jià)股骨頭壞死情況。

1.3.12 3D打印導(dǎo)航模板的制作及水凝膠的注射 對(duì)成功造模股骨頭壞死的兔模型進(jìn)行股骨頭及股骨近端micro-CT掃描并3D打印,根據(jù)3D打印模型及病灶區(qū)域,制作病灶區(qū)導(dǎo)航模板(見(jiàn)圖1);在導(dǎo)航模板的定位下精確清除股骨頭壞死的病灶區(qū),完成病灶清理后,向內(nèi)分別注入GelMA、GM/M和GM/M-Li水凝膠填充缺損,并用骨蠟覆蓋骨皮質(zhì)缺損窗。同時(shí)采用正常大白兔作為正常對(duì)照,股骨頭壞死模型未手術(shù)組作為陽(yáng)性對(duì)照,各實(shí)驗(yàn)組左側(cè)股骨頭為自身對(duì)照。

1.3.13 水凝膠作用評(píng)價(jià) 水凝膠植入8周后,處死動(dòng)物行組織學(xué)、骨計(jì)量學(xué)、分子生物學(xué)等途徑進(jìn)行分析。采用micro-CT對(duì)兔股骨頭微觀結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析,獲得的2D和3D圖像評(píng)價(jià)新骨形成。組織學(xué)采用蘇木素伊紅(hematoxylin eosin,HE)染色及免疫熒光染色分析骨壞死程度、骨小梁結(jié)構(gòu)、成骨細(xì)胞、脂肪情況;動(dòng)物處死前第14天和第7天使用鈣黃綠素肌注進(jìn)行骨熒光標(biāo)記。

1.3.14 組織學(xué)染色 術(shù)后2、4和8周,取股骨(每組6根右側(cè)股骨頭),在10%福爾馬林中固定至少48 h進(jìn)行組織學(xué)分析,然后用10%乙二胺四乙酸脫鈣1個(gè)月。然后,將骨切割后嵌入特定位置,并切成6 μm厚的切片。常規(guī)HE和Masson染色觀察標(biāo)本在光學(xué)顯微鏡下的形態(tài)學(xué)變化。

2 結(jié) 果

2.1 MBN和水凝膠的表征 將MBN溶于GelMA溶液制備了GM/M和GM/M-Li水凝膠,并在405 nm波長(zhǎng)的紫外光照射下進(jìn)行光交聯(lián)(見(jiàn)圖2a)。通過(guò)SEM觀察到GelMA、GM/M和GM/M-Li水凝膠的多孔海綿狀結(jié)構(gòu)沒(méi)有太大差異,說(shuō)明這類(lèi)合成方法可能不會(huì)對(duì)結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響。利用TEM發(fā)現(xiàn),合成的生物玻璃呈現(xiàn)了均勻地球形結(jié)構(gòu),且尺寸均<100 nm,可以證明其為納米顆粒(見(jiàn)圖2b)。

a 水凝膠光交聯(lián)前后的方案 b 3種水凝膠SEM圖像和M-Li的TEM納米顆粒形貌

黏度和可塑性對(duì)于植入和修復(fù)至關(guān)重要,例如幫助組織連接和細(xì)胞附著。另外,可注射性是原位用藥的一種重要又簡(jiǎn)便的方法,因此通過(guò)直接觀察和流變性試驗(yàn)對(duì)水凝膠進(jìn)行了評(píng)估(見(jiàn)圖2c)。可見(jiàn),水凝膠性能穩(wěn)定,但GM/M-Li水凝膠具有較高的儲(chǔ)能模量,證明其具有更好的可塑性。此外,這種水凝膠可以畫(huà)出想要的形狀,比如心形或“ABC”?？傮w而言,這些特點(diǎn)有利于將手術(shù)創(chuàng)傷降至最低,這意味著患者將更快地康復(fù)。

采用傅里葉變換紅外光譜(fourier transform infrared spectroscopy,FTIR)檢測(cè)GelMA、GM/M和GM/MLi水凝膠中鍵是否發(fā)生改變。1 080、1 240和1 630 cm-1處的峰分別代表Si-O-Si鍵、P-O鍵和C=O鍵(見(jiàn)圖2d)。有趣的是,FTIR顯示GelMA、GM/M和GM/M-li之間沒(méi)有明顯的變化。然后用SA-XRD測(cè)定了納米顆粒的孔徑。MBN和M-Li納米顆粒均在2 ℃(0.361)處出現(xiàn)峰值,對(duì)應(yīng)孔徑為24 nm(見(jiàn)圖2e)。

水凝膠的溶脹度、含水率和直徑具有關(guān)鍵的參考意義,反映了水凝膠的穩(wěn)定性,決定了是否會(huì)對(duì)局部組織的修復(fù)形成干擾。與GelMA和GM/M相比,GM/M-Li水凝膠的重量和直徑能在較短時(shí)間內(nèi)達(dá)到平衡,證明了其良好的穩(wěn)定性(見(jiàn)圖2f～2k)。

2.2 離子釋放實(shí)驗(yàn)和礦化實(shí)驗(yàn) GM/M-Li水凝膠中Si4+和Li+離子成功釋放,有利于骨修復(fù)(見(jiàn)圖2l～2m)。如上所述,隨著離子釋放,表面形成羥基磷灰石層(hydroxyapatite,HA),增強(qiáng)了細(xì)胞、組織和骨骼之間的連接,這些因素對(duì)骨骼重建至關(guān)重要。為此,對(duì)M-Li和GM/M-Li水凝膠的礦化潛力做了相關(guān)研究。第7天用SEM-X射線能譜觀察M-Li和GM/M-Li水凝膠,發(fā)現(xiàn)M-Li表面完全被有序的沉積物覆蓋(見(jiàn)圖3),GM/M-Li水凝膠表面呈花椰菜狀團(tuán)聚分布(見(jiàn)圖4),證明M-Li和GM/M-Li水凝膠有效促進(jìn)了礦化。

圖3 M-Li表面完全被有序的沉積物覆蓋

2.3 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn) 用CCK-8法研究了細(xì)胞在水凝膠上的增殖情況。結(jié)果表明,GM/M和GM/M-Li5水凝膠具有最佳的生物相容性以促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)(見(jiàn)圖5)。因此,在隨后的所有實(shí)驗(yàn)中,選擇了5% LiCl來(lái)制備GM/M-Li水凝膠。

圖5 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在不同濃度鋰的水凝膠下的細(xì)胞增殖結(jié)果

2.4 細(xì)胞骨架染色 將骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞種在GelMA、GM/M和GM/M-Li水凝膠上,在12 h和48 h分別對(duì)細(xì)胞進(jìn)行骨架染色,結(jié)果發(fā)現(xiàn),12 h的細(xì)胞形態(tài)在各組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;但在培養(yǎng)48 h后,GM/M-Li水凝膠在細(xì)胞數(shù)量和鋪展面積都優(yōu)于其他組(見(jiàn)圖6)。

圖6 不同材料骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞骨架phalloidin(紅色)和DAPI(藍(lán)色)染色(×50 μm)

2.5 活/死染色 將骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)在不同材料上,3 d后對(duì)其進(jìn)行活/死染色。結(jié)果顯示,在培養(yǎng)3 d后,3種材料均未見(jiàn)明顯死細(xì)胞,表明這些材料對(duì)細(xì)胞均無(wú)明顯毒性作用(見(jiàn)圖7)。

圖7 水凝膠提取物中培養(yǎng)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的活細(xì)胞(綠色)和死細(xì)胞(紅色箭頭)(×200 μm)

2.6 掃描電鏡下細(xì)胞形態(tài) 將骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞種在水凝膠表面,利用SEM檢測(cè)。結(jié)果清晰地展示了三組水凝膠在同一尺寸下,GM/M-Li水凝膠上的細(xì)胞鋪展地更大,偽足更多,而其他兩組細(xì)胞皺縮,鋪展不佳,這與圖6結(jié)果相吻合,證明GM/M-Li水凝膠具有更好的生物相容性,有利于體內(nèi)組織和細(xì)胞生長(zhǎng)(見(jiàn)圖8)。

2.7 水凝膠成骨能力評(píng)價(jià)

2.7.1 成骨相關(guān)染色評(píng)價(jià) 水凝膠能否在原位缺損處誘導(dǎo)成骨至關(guān)重要。因此,研究了這些水凝膠的潛在成骨能力。首先,在不同水凝膠表面培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞,以檢測(cè)作為早期成骨分化標(biāo)志的ALP活性。可以看到,在第7天的ALP染色,GelMA和GM/M-Li水凝膠中ALP表達(dá)均明顯上調(diào),且GM/M-Li水凝膠表達(dá)水平明顯更高。筆者也檢測(cè)了ALP活力,表明了GM/M-Li水凝膠的ALP活力更高。此外,在誘導(dǎo)了21 d骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞后,進(jìn)行了ARS染色,也觀察到了類(lèi)似的結(jié)果(見(jiàn)圖9a～9c)。GelMA和GM/M水凝膠中鈣結(jié)節(jié)小而少,而GM/M-Li水凝膠鈣結(jié)節(jié)明顯增多,表明其顯著的成骨能力。

a 培養(yǎng)7 d的ALP染色和21 d的ARS染色(×200 μm) b ALP活性的定量評(píng)價(jià) c OD值(490 nm)下ARS的定量

利用了免疫熒光染色對(duì)誘導(dǎo)3 d后的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子(Runt-related transcription factor 2,Runx2)和骨鈣素(osteocalcin,OCN)染色來(lái)評(píng)價(jià)成骨能力。前者位于成骨分化早期指標(biāo),表達(dá)在細(xì)胞核內(nèi);后者位于質(zhì)膜上,在骨代謝調(diào)節(jié)中起重要作用。GM/M-Li水凝膠顯著上調(diào)Runx2和OCN的表達(dá),優(yōu)于GelMA和GM/M水凝膠(見(jiàn)圖9d),證明GM/M-Li水凝膠中的Li+進(jìn)一步促進(jìn)了骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化。

2.7.2 成骨相關(guān)蛋白和基因表達(dá) 利用蛋白印記(western blotting,WB)和反轉(zhuǎn)錄酶-聚合酶鏈鎖反應(yīng)(reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)技術(shù),驗(yàn)證OCN、Runx2和Osterix成骨相關(guān)蛋白和基因來(lái)揭示其成骨能力。結(jié)果表明,與GelMA和GM/M組相比,GM/M-Li組OCN、Runx2和Osterix的蛋白表達(dá)明顯上調(diào),表明GM/M-Li水凝膠的成骨能力最優(yōu)(見(jiàn)圖10)。同樣,PCR的結(jié)果得到了類(lèi)似結(jié)論(見(jiàn)圖11)。綜上所述,GM/M-Li水凝膠具有良好的體外促成骨能力。

圖10 OCN、Osterix和Runx2蛋白的WB

2.8 成血管能力評(píng)價(jià) 利用劃痕實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)體外成血管能力。半定量分析顯示,GM/M-Li水凝膠在12 h和24 h的遷移速度較快。隨后進(jìn)行血管形成實(shí)驗(yàn),發(fā)現(xiàn)6 h后,GM/M-Li水凝膠顯著促進(jìn)HUVEC管狀、結(jié)節(jié)和分支的形成,這與GelMA和GM/M組形成鮮明對(duì)比,表明水凝膠釋放的Li+具有優(yōu)異的血管生成能力。在Transwell實(shí)驗(yàn)中,GM/M-Li水凝膠組有更多的細(xì)胞轉(zhuǎn)移到膜另一側(cè),而其他組幾乎沒(méi)有細(xì)胞(見(jiàn)圖12a～12f)。同時(shí),研究血管生成相關(guān)蛋白血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor,VEGF),驗(yàn)證GM/M-Li水凝膠突出的血管生成生物活性(見(jiàn)圖12g～12h)。結(jié)果表明,GM/M-Li水凝膠釋放的Li+有積極的促血管再生的作用。

a 傷口愈合(×200 μm) b 血管形成(×100 μm) c 遷移試驗(yàn)(×100 μm)

2.9 水凝膠成脂抑脂能力評(píng)價(jià) 使用3T3-L1前體脂肪細(xì)胞評(píng)價(jià)脂肪生成和抑制能力。通過(guò)油紅O染色發(fā)現(xiàn),GM/M-Li水凝膠顯著抑制了3T3-L1前體脂肪細(xì)胞的成脂分化,脂滴數(shù)量相較于其他兩組數(shù)量明顯減少,表明Li+有良好的抑制脂肪生成的能力(見(jiàn)圖13)。

圖13 不同水凝膠對(duì)3T3-L1細(xì)胞抑制脂肪生成能力評(píng)價(jià)(×100 μm)

2.10 水凝膠植入對(duì)體內(nèi)骨重建影響的評(píng)價(jià)

2.10.1 兔股骨頭HE染色 GM/M-Li水凝膠在體內(nèi)是否具有令人滿意的效果還有待進(jìn)一步研究。因此,對(duì)不同組的水凝膠在體內(nèi)的應(yīng)用進(jìn)行了評(píng)價(jià)。對(duì)兔股骨頭組織行HE染色,發(fā)現(xiàn)模型組相較于對(duì)照組,骨小梁結(jié)構(gòu)丟失,脂滴增加。在GM/M-Li水凝膠的干預(yù)后顯著減少了股骨頭脂滴、核固縮(見(jiàn)圖14)。

圖14 股骨頭壞死對(duì)照組、模型組及治療組的HE染色(×100 μm)

2.10.2 兔股骨頭免疫組織熒光染色 通過(guò)組織免疫熒光染色對(duì)股骨頭壞死的成骨成血管進(jìn)行研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn),GM/M-Li水凝膠有效促進(jìn)了Runx2成骨指標(biāo)和成骨表達(dá)。對(duì)骨組織進(jìn)行鈣黃綠素/茜素紅熒光雙標(biāo),發(fā)現(xiàn)GM/M和GM/M-Li水凝膠均有明顯成骨表現(xiàn),證明GM/M和GM/M-Li水凝膠均有良好促成骨能力。另外,GM/M-Li水凝膠在Li+的作用下,成血管指標(biāo)CD31的表達(dá)上升,表明其有效促進(jìn)血管新生,而這有助于股骨頭壞死的骨重建(見(jiàn)圖15)。綜上所述,認(rèn)為GM/M-Li水凝膠在成骨、成血管方面有良好表現(xiàn)。

圖15 股骨頭壞死對(duì)照組及治療組組織熒光染色(×50 nm)

3 討 論

股骨頭壞死是一種機(jī)制復(fù)雜的疾病,表現(xiàn)為進(jìn)行性的骨細(xì)胞壞死和修復(fù),最終可能導(dǎo)致髖關(guān)節(jié)炎和股骨頭塌陷。由于股骨頭壞死的骨修復(fù)能力下降,血管再生能力差,往往壞死速度大于修復(fù)速度[24]。

股骨頭壞死常見(jiàn)原因之一是糖皮質(zhì)激素導(dǎo)致,盡管糖皮質(zhì)激素(glucocorticoids,GCs)誘導(dǎo)的股骨頭壞死的確切機(jī)制仍不明確,但研究人員發(fā)現(xiàn),脂質(zhì)代謝紊亂學(xué)說(shuō)及相關(guān)信號(hào)通路的激活抑制是GCs介導(dǎo)股骨頭壞死的主要發(fā)病機(jī)制之一[1,22]。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞具有自我更新和分化能力,在正常骨代謝中起著重要作用[25]。研究人員在兔子模型中使用了大量GCs后,發(fā)現(xiàn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的活性降低,趨向于分化為成脂細(xì)胞而非成骨細(xì)胞,導(dǎo)致脂質(zhì)累積在細(xì)胞內(nèi)。同時(shí)在GCs的作用下,體內(nèi)血清總膽固醇、甘油三酯水平升高,導(dǎo)致脂肪分布異常,最終造成骨內(nèi)壓的升高,壓迫股骨頭微循環(huán)而減少其血供,導(dǎo)致股骨頭壞死[26]。同理,酗酒會(huì)導(dǎo)致肝細(xì)胞損傷和甘油三酯合成增多,肝細(xì)胞線粒體受損,引起脂質(zhì)代謝紊亂,血液中的游離脂質(zhì)增加,最后脂滴的堆積促進(jìn)了股骨頭微循環(huán)發(fā)生脂肪栓塞,最終引起股骨頭壞死[27]。Wnt/β-catenin經(jīng)典通路是決定成骨與成脂平衡的分子開(kāi)關(guān)。當(dāng)Wnt信號(hào)存在時(shí),Wnt信號(hào)和卷曲蛋白結(jié)合,激活經(jīng)典Wnt信號(hào)通路,通過(guò)抑制糖原合成酶激酶3β(glycogen synthase kinase 3β,GSK-3β)活性抑制了β-catenin磷酸化,使其在胞質(zhì)內(nèi)大量聚集,繼而入核表達(dá),誘導(dǎo)成骨分化[28]。研究發(fā)現(xiàn),GCs可能作用于Wnt信號(hào)通路,激活GSK-3β,抑制β-catenin的活化和入核表達(dá),最終減少成骨分化[29]。因此,促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化為成骨細(xì)胞、恢復(fù)股骨頭血供,在預(yù)防股骨頭壞死中顯得尤為必要。

骨骼是堅(jiān)固和可再生的器官。單純的骨折或缺陷可以由身體自己修復(fù),但股骨頭壞死由于其微環(huán)境失衡,修復(fù)能力有限[30]。因此,本研究研究了加速骨重建的水凝膠生物材料。生物材料應(yīng)該具有良好的生物相容性。理想的生物材料放置在體內(nèi)意味著“內(nèi)”與“外”的兼容、互惠互利,而不是引發(fā)致命的排斥反應(yīng)。Pluharova等[31]曾報(bào)道,在酰胺基團(tuán)和鈣離子之間存在離子-偶極相互作用。因此,筆者利用這種作用結(jié)合了MBA和GelMA。MBN具有海綿狀結(jié)構(gòu),為細(xì)胞交互提供了空間,便于新陳代謝、信號(hào)傳遞和營(yíng)養(yǎng)運(yùn)輸。同時(shí),穩(wěn)定的HA層對(duì)骨形成是必不可少的,因?yàn)樗C明了MBN與微環(huán)境的聯(lián)系。本研究發(fā)現(xiàn),盡管GelMA和GM/M水凝膠無(wú)明顯的毒性,但基于此特性在GM/M-Li水凝膠上的生長(zhǎng)表現(xiàn)更佳。

眾所周知,骨骼是一種高度血管化的器官。在許多情況下,由于缺乏血管化,會(huì)導(dǎo)致骨再生失敗。文獻(xiàn)表明,成骨-血管偶聯(lián)對(duì)完整的骨再生很重要[32-33]。本研究驗(yàn)證了GM/M-Li水凝膠在體外成骨和血管生成中的作用,發(fā)現(xiàn)GM/M-Li水凝膠的表現(xiàn)令人滿意。然而,在股骨頭壞死情況下,血管再生和成骨能力會(huì)大打折扣。因此,股骨頭壞死下的骨重建是一項(xiàng)具有挑戰(zhàn)性的工作。

股骨頭壞死時(shí),成骨-成脂能力平衡破壞,前體脂肪細(xì)胞多向成脂分化而非成骨分化,導(dǎo)致骨組織減少發(fā)生塌陷。因此,筆者在體外模擬了GM/M-Li水凝膠抑制3T3-L1前體脂肪細(xì)胞分化為脂肪細(xì)胞能力的實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),成脂細(xì)胞數(shù)量相對(duì)GelMA和GM/M水凝膠有所減少,證明了GM/M-Li水凝膠釋放的Li+有一定抑脂作用。然而,體外與體內(nèi)環(huán)境完全不同。因此,為了進(jìn)一步研究,本研究建立了股骨頭壞死的兔模型,利用3D打印導(dǎo)航模板技術(shù)清理死骨后注射水凝膠進(jìn)行治療。通過(guò)對(duì)兔股骨頭組織HE染色、免疫組化染色發(fā)現(xiàn),GM/M-Li水凝膠有效促進(jìn)了成骨與成血管。既往研究已經(jīng)使用含有重組骨形態(tài)發(fā)生蛋白2、鍶或銅介孔生物玻璃達(dá)到促成骨目的[20-21,34-36];然而,在股骨頭壞死環(huán)境下,基礎(chǔ)炎癥水平的升高、脂肪代謝紊亂等因素可能會(huì)限制生物材料的成骨和血管生成能力。因此,為骨再生創(chuàng)造合適的微環(huán)境是必要的。本研究用鋰修飾了介孔生物玻璃。與已報(bào)道的改性介孔生物玻璃相比,GM/M-Li水凝膠除了具有成骨的雙重作用,還有助于股骨頭壞死的骨修復(fù)。

在過(guò)去的幾十年里,研究人員建立了許多動(dòng)物模型,包括小鼠、大鼠、兔子、狗和豬。每種動(dòng)物模型都有自己的優(yōu)點(diǎn)和局限性,根據(jù)其獨(dú)特的特點(diǎn),設(shè)計(jì)了基于不同動(dòng)物模型的各種研究。兔子模型是最常用的動(dòng)物模型之一,兔子在組織學(xué)、形態(tài)學(xué)、血流動(dòng)力學(xué)等方面與人有相似之處[37],大/小鼠股骨頭較小,不利于導(dǎo)航模板水凝膠注入,因此本研究選擇了大白兔作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型。

盡管GM/M-Li水凝膠的骨組織仍未完全修復(fù),未能獲得最佳數(shù)據(jù),但這些結(jié)果仍表明GM/M-Li水凝膠具有促進(jìn)骨再生和新生血管生成,同時(shí)調(diào)節(jié)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化,降低激素性股骨頭壞死的破壞程度。在未來(lái),筆者還將改進(jìn)不同濃度鋰離子以及其他促骨生成金屬與水凝膠結(jié)合療效。同時(shí)繼續(xù)研究水凝膠與干細(xì)胞、生長(zhǎng)因子、慢病毒等相互之間的結(jié)合作用以及精確度和控釋問(wèn)題,進(jìn)一步研究探索長(zhǎng)期骨重建中組織的功能修復(fù)和再生能力。