NtCycB2和NtJAZ1共敲除對煙草腺毛密度和煙堿含量的影響

張新要，侯子航，鄭淑心，劉向陽，閆筱筱，蒲文宣，崔 紅*

1.湖南中煙工業有限責任公司技術中心，湖南省長沙市勞動中路386 號 410007

2.河南農業大學煙草學院，鄭州市鄭東新區平安大道218 號 450046

煙草葉面腺毛是葉片表皮細胞的特化結構，能夠特異地合成和分泌二萜化合物、蔗糖酯等多種生物活性物質和香氣前體物質，對煙株抗性和煙葉品質具有積極影響［1-3］。煙堿是煙草特有的次生代謝物質，影響煙葉的勁頭、吃味和香氣品質，是評價煙葉和卷煙品質的重要指標之一［4］。因此，提高煙草腺毛密度和煙堿含量是煙草品種改良的重要目標，但關于二者的聚合定向改良還未見報道。

茉莉酸（Jasmonate acid，JA）信號分子調控是提高煙堿含量的重要途徑之一［5］。JAZ（Jasmonate zim domain，JAZ）蛋白是JA 信號途徑的負調控因子，在SCFCOI1復合物作用下被26S蛋白酶體降解，釋放茉莉酸信號途徑的正向調控因子，促進茉莉酸早期應答基因的轉錄［6］。在煙草中，NtJAZ1 與NtMYC2a、NtMYC2b 以復合物形式存在；在茉莉酸信號誘導下，NtJAZ1 被降解，NtMYC2a、NtMYC2b得以釋放，并與NtPMT1a啟動子G-Box 區域結合調控其轉錄，從而促進煙堿生物合成［7-8］。鄭淑心等［9］利用基因編輯技術，創制了K326 的NtJAZ1基因純合突變株系NK-9，其煙堿生物合成關鍵基因NtMYC2a、NtMYC2b、NtPMT和NtQPT的表達水平顯著提高，烤后煙葉煙堿含量提高40%以上，但葉面腺毛密度和腺毛分泌物含量有明顯降低。鑒于腺毛及其分泌物對煙株抗性和煙葉品質的重要性，在利用NtJAZ1作為靶點進行煙堿含量改良時，如何保證葉片具有較高的腺毛密度至關重要。煙草腺毛發生受NtCycB2負向調控，敲除該基因之后煙草葉面腺毛密度顯著提高且對煙株發育無明顯影響［10-11］。為了在提高葉片煙堿含量的同時維持較高的腺毛密度和腺毛分泌物含量，以NtCycB2純合突變株系hairy K326為材料，利用CRISPR/Cas9 技術對NtJAZ1進行敲除，篩選純合突變株系并進行農藝性狀、腺毛密度、生物堿含量、烤后煙葉化學成分的比較分析，擬闡明NtCycB2、NtJAZ1共敲除對煙株生長發育、腺毛發生、腺毛分泌物和煙堿積累的影響，為進行煙堿和葉面化學成分的聚合改良奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料為煙草K326 和hairy K326，hairy K326為課題組前期創制的NtCycB2基因突變的多腺毛K326突變株系［10］。hairy K326的種子經消毒后接種于MS培養基上，在恒溫（28±1）℃、恒濕60%±2%、16 h 光/8 h 暗的條件下進行培養，無菌苗用于遺傳轉化。

1.2 試驗方法

1.2.1NtJAZ1基因敲除載體構建及遺傳轉化

根據茄科基因組網站（https://solgenomics.net/）已發表的煙草NtJAZ1基因兩個拷貝的序列（Nitab4.5_0000073g0270.1、Nitab4.5_0004234g0080.1），利用CRISPR2 在 線 軟 件（http://crispr.hzau.edu.cn/CRISPR2/）設計靶序列：5′-CCTCAAGAAGTTATT TCTACTGC-3′，合成二聚體后構建NtJAZ1基因敲除載體（pCBSG012-JAZ1），見圖1。

圖1 NtJAZ1基因敲除載體結構Fig.1 Structure of NtJAZ1 knockout vector

采用葉盤法［12］對hairy K326 進行煙草遺傳轉化。葉圓片經侵染和共培養，置于分化培養基（MS+Cef 0.500 00 g/L +Hyg 0.006 00 g/L + 6-BA 0.001 00 g/L + NAA 0.000 15 g/L）上進行分化篩選，不定芽轉入生根培養基（MS+Hyg 0.008 00 g/L+NAA 0.000 10 g/L）進行培養，獲得潮霉素抗性植株。

1.2.2 分子鑒定

提取潮霉素抗性苗DNA，利用引物1（F1:5′-CTAGGAAAGGCTAAAAAGAAACAGT-3′；R1：5′-GGATTGTGATATTGGCTGAGTT-3′）和引物2（F2:5′-CGAAATTCTTGAGTCAAATTGG-3′；R2：5′-AAC ATTTTAGAAGTTGGAGGAG-3′），分別對NtJAZ1-1、NtJAZ1-2進行PCR擴增，經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后送華大基因進行序列測定。突變單株自交收獲種子，并進行純合鑒定。

1.2.3 煙草農藝性狀調查

試驗材料于2021年3月移栽種植于湖南瀏陽隔離封閉試驗田，田間種植和管理按照烤煙栽培技術流程［13］和當地優質煙葉栽培規程進行。按標準方法在煙草初花期分別測量株高、葉片數、葉長、葉寬、莖圍、節距等農藝性狀指標［14］。

1.2.4 煙草生物堿的提取和測定

分別在煙草現蕾期、打頂后1 周和成熟期取K326、hairy K326和J-21株系中部葉片，測定生物堿含量（質量分數）。將殺青后的鮮煙葉烘干碾磨，過0.25 mm 孔徑的樣品篩。取200 mg 煙末，在堿性條件下用甲基叔丁基醚（MTBE）提取生物堿，以正十六烷為內標，參照行業標準方法［15］通過氣相色譜-氫火焰離子化檢測器（GC-FID）定量檢測生物堿含量，3次重復。

1.2.5 腺毛形態觀察及密度統計

在煙草現蕾期選取上部葉片（長度約10 cm）進行腺毛觀察。使用0.2%（質量體積分數）羅丹明B溶液染色20～30 min，用無菌水清洗后采用超景深顯微鏡（VHX-5000，日本基恩士公司）進行腺毛形態觀察和密度統計。

1.2.6 煙草葉面化學成分分析

在煙草中部葉片成熟期，選取5 株生長發育一致、健壯無病害的煙株，取第12葉位的葉片，參照李旖梅等［16］的方法進行葉面化學成分的萃取和檢測，3次重復。

1.2.7 常規化學成分測定

選取烤后B2F 等級煙葉，采用連續流動化學分析儀（AA3，德國SEAL），按照行業標準［17-19］測定水溶性總糖、還原糖、煙堿、氯、鉀含量（質量分數），3次重復。

1.2.8 中性香氣物質測定

選取B2F 等級烤后煙葉，參照趙銘欽等［20］的方法測定煙葉中性香氣成分含量。

1.2.9 數據分析

使用SPSS 17 統計分析軟件對數據進行單因素（One-way ANOVA）方差分析及差異顯著性檢驗（LSD 法，P<0.05 或P<0.01），使用SigmaPlot 14.0 數據分析繪圖軟件制圖。

2 結果與分析

2.1 NtJAZ1基因敲除和純合突變株系鑒定

以hairy K326 為材料，進行NtJAZ1基因編輯載體的遺傳轉化。經過潮霉素篩選后，共獲得了38 株陽性植株。利用特異引物對突變位點進行測序，有10 株在gRNA 區域檢測到序列突變，基因編輯效率為26.32%。其中，J-21中的NtJAZ1-1和NtJAZ1-2均發生突變，NtJAZ1-1在250～253 bp 處4 個堿基發生了替換，NtJAZ1-2序列在254～255 bp處缺失了A和G 2 個堿基（圖2A）。NtJAZ1-1和NtJAZ1-2所發生的序列突變均導致翻譯提前終止和功能缺失（圖2B）。

圖2 NtJAZ1基因敲除株系的分子鑒定Fig.2 Molecular identification of NtJAZ1 knockout lines

2.2 NtCycB2 和NtJAZ1 共敲除對煙株生長發育的影響

K326、hairy K326 和J-21 漂浮育苗，于2021年3月移栽種植于湖南瀏陽封閉試驗田中。在整個生育期中，J-21 生長發育正常，大田長勢與K326 和hairy K326無明顯區別（圖3）。煙株農藝性狀調查結果顯示，與K326 和hairy K326 相比，J-21 株系在株高、葉數、葉長和葉寬等方面雖有所變化，但均無顯著差異；與K326 相比，J-21 和hairy K326 的節距明顯減小，莖圍有所增加，見表1。

表1 煙株農藝性狀統計分析①Tab.1 Statistical analysis of agronomic characteristics of tobacco plants

圖3 田間煙株形態觀察Fig.3 Morphological observation of tobacco plants in the field

2.3 NtCycB2 和NtJAZ1 共敲除對腺毛密度和分泌物積累的影響

在現蕾期分別對K326、hairy K326 和J-21 的上部葉片進行腺毛觀察和密度統計，結果如圖4（A，B）所示。從圖4 中可以看出，J-21 株系腺毛發育完善，腺頭飽滿，羅丹明染色后呈現深紫紅色。腺毛密度統計結果依次為hairy K326＞J-21＞K326，J-21株系的腺毛密度比K326 提高113.18%，但比hairy K326有所降低。這說明NtCycB2基因敲除能夠顯著提高腺毛密度，NtJAZ1基因敲除對腺毛密度有負面影響，而NtCycB2和NtJAZ1基因共敲除能提高腺毛密度并促進腺頭發育。

圖4 腺毛形態觀察和葉面化學成分分析Fig.4 Morphological observation of trichome and analysis of leaf surface chemical components

利用GC/MS 技術對K326、hairy K326 和J-21 成熟的中部葉片進行葉面化學成分的萃取和分析，結果如圖4（C、D）所示。從圖4 中可以看出，K326、hairy K326和J-21的葉面化學成分組成一致，含量高低依次為J-21＞hairy K326＞K326，J-21的葉面化學成分總含量比K326和hairy K326分別提高156.35%和41.65%。其中，西柏烷二萜含量分別比K326 和hairy K326提高192.49%和34.46%，蔗糖酯含量分別比K326 和hairy K326 提高113.50%和65.90%，烷烴含量無明顯變化。表明NtCycB2基因和NtJAZ1基因共敲除對葉面化學成分積累有積極影響。

2.4 NtCycB2 和NtJAZ1 共敲除對葉片煙堿積累的影響

分別對現蕾期、打頂后1周和成熟期的中部葉片進行生物堿含量測定，結果如圖5所示。從圖5中可以看出，K326、hairy K326 和J-21 的生物堿均由煙堿、新煙草堿、降煙堿和假木賊堿組成。其中，煙堿含量占生物堿總量的90%以上。隨著葉片的生長發育，煙堿含量呈現上升趨勢。與K326 和hairy K326相比，J-21 的煙堿含量均極顯著提高?，F蕾期煙堿含量差距最為明顯，J-21 分別比K326 和hairy K326提高213.33%和261.54%；打頂后J-21煙堿含量提高幅度減少，分別比K326和hairy K326提高29.73%和27.43%；在成熟采收期，J-21 的煙堿含量比K326 和hairy K326 分別提高37.14%和32.28%。說明NtCycB2和NtJAZ1基因共敲除在提高腺毛密度和分泌物含量的同時，對生物堿合成也具有明顯的促進作用，而且主要發生在打頂前。

2.5 NtCycB2 和NtJAZ1 共敲除對烤后煙葉化學成分的影響

2.5.1 常規化學成分分析

對不同材料的B2F等級煙葉進行常規化學成分測定，結果如表2所示。從表2 中可以看出，與對照相比，J-21 的煙堿、總氮和鉀含量顯著提高。其中，J-21 的煙堿含量分別比K326 和hairy K326 提高39.81%和45.32%，J-21 的總氮含量分別比K326 和hairy K326 提高18.97%和13.74%，J-21 的鉀含量分別比K326 和hairy K326 提高43.70%和21.25%。總糖含量相比于K326 有所下降，比hairy K326 則有所提升，還原糖含量相比于K326 和hairy K326 均有所下降，氯含量無顯著變化?？傮w來看，各化學成分含量均處在適宜范圍內。

表2 烤后煙葉常規化學成分分析Tab.2 Results of routine chemical components in cured tobacco leaves

2.5.2 中性香氣成分分析

采用GC/MS 技術對B2F 等級煙葉進行中性香氣物質分析，結果如表3所示。從表3 中發現，J-21的中性致香物質總量增加，分別比K326 和hairy K326 提高13.79%和5.44%。其中，西柏烷類降解產物茄酮的含量增幅較高，比K326 增加217.49%，比hairy K326 增加48.45%，這與葉面化學成分檢測結果的變化趨勢相一致。另外，J-21 的類胡蘿卜素降解產物、新植二烯含量也有明顯增加。

表3 中性致香物質成分分析Tab.3 Results of neutral aroma components in cured tobacco leaves

3 討論

腺毛密度和煙堿含量與煙株抗性和煙葉品質密切相關，二者都是煙草品種改良的重要目標。NtJAZ1 通過與NtMYC2 結合抑制煙堿生物合成關鍵基因的轉錄和表達，是進行高煙堿煙草定向改良的理想靶點之一［7］。但在K326 的NtJAZ1基因敲除純合株系中，葉面腺毛密度明顯降低［9］。這說明NtJAZ1基因功能缺失在促進煙堿合成的同時，對腺毛發生具有一定的抑制作用，并對煙株抗性和煙葉品質產生不利的影響。煙草腺毛發育與煙堿合成同樣受到茉莉酸信號的誘導，這在本氏煙中已有報道，Yan X等［21］發現NbJAZ3基因在MeJA誘導本氏煙長柄腺毛發生過程中起關鍵作用。

為彌補NtJAZ1敲除對腺毛發生的不利影響，在提高煙堿含量的同時維持較高的腺毛密度，本研究中以NtCycB2基因敲除的多腺毛K326 突變品系hairy K326 為材料，進行NtJAZ1基因編輯，獲得了NtCycB2、NtJAZ1同時突變的純合株系J-21，其煙堿含量比對照提高了39.81%，這與在K326 中單敲NtJAZ1基因的結果相一致，而且兩個材料都表現出打頂前煙堿含量增幅較大，打頂后增幅降低的趨勢［9］。其原因可能是在正常情況下，打頂刺激了茉莉酸的大量合成，導致NtJAZ1被降解，促進煙堿合成加速；而在NtJAZ1功能缺失之后，煙株對打頂刺激的敏感性降低，因而導致了煙堿合成增幅明顯下降。與單敲NtJAZ1基因相比，NtCycB2、NtJAZ1雙敲株系J-21腺毛密度和分泌物含量比K326顯著提高；與NtCycB2基因敲除的hairy K326相比，J-21腺毛密度雖有所降低，但分泌物含量卻明顯提高。由此推測，NtJAZ1對腺毛的物質代謝具有一定的促進作用，腺毛形態觀察和羅丹明組織化學染色結果進一步驗證了這一推論。

NtCycB2、NtJAZ1雙敲對煙株生長發育無不良影響，而且表現出較強的田間綜合抗性，這可能與其多腺毛、高煙堿的特性有關。已有的研究證明，NtCycB2敲除導致的多腺毛煙草具有較高的耐旱［22］、耐鹽［23］、抗蟲［24］、耐鎘［25］能力。當然，NtCycB2、NtJAZ1雙敲導致煙堿含量和腺毛分泌物含量的顯著提高，這對煙葉感官品質及工業可用性的影響還有待于進一步深入研究。

4 結論

通過CRISPR/Cas9 技術創制了NtCycB2和NtJAZ1共敲除的K326 突變株系J-21。研究發現，NtCycB2和NtJAZ1共敲除在不影響煙株正常的生長發育的前提下，與K326 相比，葉面腺毛密度和腺毛分泌物含量分別提高113.18%和156.35%，烤后煙葉西柏烷類降解產物茄酮含量提高217.49%，煙堿含量提高39.81%，這表明NtCycB2和NtJAZ1在煙堿含量和腺毛密度的聚合定向改良中具有較大的應用潛力。