基于宏基因組的煙田土壤細菌群落結構和功能分析

申曉晴，高華軍，拓陽陽，耿召良，蔡 斌，李紅麗*，王 巖

1.鄭州大學生態與環境學院，鄭州市高新區科學大道100 號 450001

2.中國煙草總公司海南省公司海口雪茄研究所，?？谑协偵絽^紅城湖路120 號 571100

3.四川省煙草公司涼山州公司德昌分公司，四川省西昌市三岔口東路432 號 615500

煙草黑脛病和青枯病是典型的土傳病害，其直接影響煙葉的品質和產量，每年給煙葉生產造成巨大的經濟損失［1-2］。煙草根腐病危害面廣，防治難度大，常與黑脛病、青枯病混合發生，近年來全國核心煙區發病率呈上升趨勢［3］。土壤微生物是土壤生態系統的重要組成部分，在維持生態平衡、物質循環和能量流動等方面發揮著重要作用［4］。有研究表明［1-2，5］，煙草土傳病害的發生與土壤微生物群落結構密切相關，土壤微生物結構和功能多樣性降低、有益微生物減少以及有害病原菌富集均會提高病害發生率。另外，土壤微生物在碳氮平衡中也具有重要作用。自然界中的氮素進入生態系統循環，需要微生物將氮氣轉化為氨或銨鹽；以CO2為中心的碳循環中，微生物能通過光合作用和化能合成作用固定CO2［6］。碳氮代謝為植物生長發育提供物質基礎［7］，土壤酶活性是表征土壤質量及微生物代謝活性的關鍵指標［8-9］，兩者交互作用協同調控煙草的生長發育。因此，明確健康和易感病煙田土壤微生物群落結構差異，對病害防控尤為重要。邸慧慧等［10］研究發現，煙草病害土壤與非病害土壤樣本間細菌群落結構差異較大，同源性低，且發病植煙土壤中含有大量病原菌。孫美麗等［11］研究表明，感病與健康煙葉細菌代謝通路均主要為代謝、遺傳信息處理和環境信息處理3類。母少東等［12］分析了不同植煙區土壤的碳氮代謝，發現天柱地區煙葉碳氮代謝品質相關指標較威寧地區和龍崗地區協調，有利于提高煙葉品質。左梅等［13］選擇不同發病程度的煙株根際土壤進行研究，發現隨著煙株發病程度的增加，土壤脲酶、過氧化氫酶活性依次降低，磷酸酶和蔗糖酶活性無顯著差異。丁亞茹等［14］研究了不同發病率煙田根際土壤微生物群落組成，發現已發病煙田中存在較多潛在病原菌，健康煙田中蛋白酶和過氧化氫酶的活性高于易感病煙田。然而，關于不同健康狀態煙田的有益細菌群落結構及功能基因的研究還鮮見報道。為此，選取涼山彝族自治州1 塊健康煙田和2 塊易感病煙田為研究對象，利用宏基因組測序技術，比較不同健康狀態的煙田土壤細菌群落結構、功能基因、碳氮代謝及酶活性的差異性，以期為煙田土壤健康調控提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 煙田基本情況

供試煙田位于涼山彝族自治州德昌縣德州鎮鳳凰村（以下簡稱鳳凰村），北緯27°25′40′′，東經102°11′17′′，海拔1 565 m，亞熱帶高原季風氣候，年平均氣溫17.7 ℃，年均降水1 049 mm，無霜期300 d 以上。試驗地為煙草連作10年的煙田，黃壤沙土。選取健康煙田D1，易感?。ê诿劜　⑶嗫莶『透』旌习l生，發病率50%以上）煙田D2 和D3 進行試驗。每個處理面積220 m2。D1、D3前作種植油菜，D2前作種植大蒜，種植煙草品種為云煙87。

1.2 土壤樣品采集

于2020年3月，即前茬作物采收后煙苗移栽前，依照5點取樣法取耕層5～20 cm的土壤樣品1 kg，將樣品混勻并裝袋編號。每塊煙田取3個平行樣，在田間將土樣過篩（孔徑0.25 mm），去除根莖、石頭等雜質。取過篩后樣品置于50 mL 帶蓋離心管中，儲存于有冰袋的保溫箱中，帶回實驗室置于-20 ℃冰柜中保存，并及時送往上海美吉生物醫藥科技有限公司進行宏基因組測序。其余樣品部分風干用于土壤化學性質指標和酶活性分析，部分冷凍保存備用。

1.3 測定方法

1.3.1 土壤化學性質指標測定

采用電位法測定土壤pH 值［15］；采用重鉻酸鉀-油浴法測定有機質（Organic matter，OM）［15］；采用堿解擴散法測定堿解氮（Alkaline nitrogen，AN）［15］；采用乙酸胺提取-原子吸收法測定速效鉀（Available potassium，AK）［15］；采用碳酸氫鈉提取-鉬銻抗比色法測定有效磷（Available phosphorus，AP）［15］。

1.3.2 土壤酶活性測定

采用對硝基苯酚比色法［16］測定酸性磷酸酶（Acid phosphatase，ACP）活性；采用靛酚藍比色法［17］測定脲酶（Urease，URE）活性；采用3，5-二硝基水楊酸比色法［17］測定蔗糖酶（Invertase，INV）活性；采用容量法［18］測定過氧化氫酶（Catalase，CAT）活性；采用福林試劑比色法［18］測定蛋白酶（Protease，PR）活性。

1.3.3 土壤樣品DNA提取、測序

使用E.Z.N.A.?Soil DNA Kit（Omega Bio-tek）試劑盒對土壤樣品的基因組DNA進行提取，隨后利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的濃度和純度。通過Covaris M220（Gene Company Limited）將DNA片段化，篩選約400 bp 的片段，用于構建PE 文庫。通過上海美吉生物醫藥科技有限公司的PE150 策略，在Illumina HiSeq X Ten 測序平臺對每個文庫進行測序。

1.4 數據處理

參照劉臻岳等［19］的方法進行生物信息學分析。采用Microsoft Excel 2010 進行數據統計分析和制圖，采用IBM SPSS Statistics 22.0 進行方差分析，采用獨立樣本T檢驗對土壤細菌群落進行差異顯著性檢驗，采用Duncan’s 新復極差法對土壤化學性質指標、酶活性進行差異顯著性分析，采用R 語言（pheatmap package）進行相關性分析，采用上海美吉生物醫藥科技有限公司的生信云平臺進行宏基因組數據分析。

2 結果與分析

2.1 煙田土壤細菌群落層級聚類分析

健康和易感病煙田屬水平土壤細菌群落的層級聚類分析如圖1所示。健康煙田D1 與易感病煙田D2、D3 的土壤細菌群落具有明顯差異，易感病煙田D2和D3的土壤細菌群落相似。

圖1 屬水平上健康和易感病煙田土壤細菌群落的層級聚類分析Fig.1 Hierarchical cluster analysis of soil bacterial communities in healthy and susceptible tobacco fields at genus level

2.2 不同處理間土壤細菌群落組成及差異分析

健康和易感病煙田在門水平上的土壤細菌群落相對豐度如圖2所示。相對豐度大于4%的優勢菌門有放線菌門（Actinobacteria）、變形菌門（Proteobacteria）、酸桿菌門（Acidobacteria）和綠彎菌門（Chloroflexi）。其中，健康煙田D1 中放線菌門（Actinobacteria）、酸桿菌門（Acidobacteria）、綠彎菌門（Chloroflexi）的相對豐度較高，比易感病煙田D2和D3 分別高1.042 百分點和1.187 百分點、1.062 百分點和2.214 百分點、1.009 百分點和1.014 百分點。健康煙田D1中變形菌門（Proteobacteria）的相對豐度較低，比易感病煙田D2和D3分別低1.349百分點和3.342百分點。

圖2 門水平上健康和易感病煙田土壤細菌群落的相對豐度Fig.2 Relative abundance of soil bacteria communities in healthy and susceptible tobacco fields at phylum level

健康煙田D1 和易感病煙田D2、D3 在屬水平上的土壤細菌群落相對豐度如圖3所示。D1、D2、D3中土壤細菌相對豐度排名前4的菌屬分別為慢生根瘤菌屬（Bradyrhizobium）、鏈霉菌屬（Streptomyces）、羅思河小桿菌屬（Rhodanobacter）和分枝桿菌屬（Mycobacterium）。D1中固定桿菌屬（Conexibacter）的相對豐度比D2和D3分別高0.121百分點和0.323百分點。對D1 和D2、D3 土壤細菌在屬水平上有顯著性差異的物種分析（圖4）可知，具有顯著性差異的菌屬有15 個。健康煙田 D1 中慢生根瘤菌屬（Bradyrhizobium）、鏈霉菌屬（Streptomyces）、分枝桿菌屬（Mycobacterium）、纖線桿菌屬（Ktedonobacter）、鞘脂單胞菌屬（Sphingomonas）的相對豐度均極顯著高于易感病煙田D2、D3。而易感病煙田D2、D3中羅思河小桿菌屬（Rhodanobacter）的相對豐度極顯著高于健康煙田D1。

圖3 屬水平上健康和易感病煙田土壤細菌群落的相對豐度Fig.3 Relative abundance of soil bacteria communities in healthy and susceptible tobacco fields at genus level

圖4 屬水平上健康和易感病煙田的土壤細菌群落差異分析Fig.4 Differential Analysis of soil bacterial community between healthy and susceptible tobacco fields at genus level

2.3 土壤細菌相對豐度與化學性質指標及酶活性的相關性分析

由表1可知，健康煙田D1中PR活性顯著高于易感病煙田D2、D3，URE、ACP活性均低于易感病煙田D2、D3。健康煙田D1與易感病煙田D2中INV活性無顯著差異，而易感病煙田D3中INV活性顯著高于健康煙田D1。CAT活性在3塊煙田中相差不大。健康煙田D1中土壤OM、AN、AK、AP含量均顯著低于易感病煙田D2、D3。

表1 不同煙田土壤酶活性、化學性質指標的差異分析①Tab.1 Differential analysis of soil enzyme activity and chemical properties between different tobacco fields

在屬水平上，對煙田土壤細菌相對豐度與土壤化學性質、酶活性進行Spearman相關性熱圖分析，結果如圖5所示。pH 值、OM、AN、AP、AK、PR、URE、ACP是土壤細菌群落在屬水平上具有顯著影響的因子。慢生根瘤菌屬（Bradyrhizobium）、鏈霉菌屬（Streptomyces）、分枝桿菌屬（Mycobacterium）、固定桿菌屬（Conexibacter）的相對豐度與AN、AP、AK、URE呈極顯著正相關，與PR呈極顯著負相關。纖線桿菌屬（Ktedonobacter）與PR 呈極顯著正相關，與AN、AP、AK、URE 呈極顯著負相關。羅思河小桿菌屬（Rhodanobacter）和鞘脂單胞菌屬（Sphingomonas）的相對豐度與pH 值呈極顯著負相關，與OM、ACP 呈極顯著正相關。

圖5 屬水平上煙田土壤細菌群落與化學因子及酶活性間的相關性熱圖Fig.5 Correlation heatmap of soil bacterial community with chemical factors and enzyme activity at genus level in tobacco fields

2.4 煙田土壤樣品功能基因預測分析

通過Diamond將非冗余基因集序列與KEGG的基因數據庫進行比對注釋，發現3塊煙田土壤樣品中共含有6類一級功能代謝通路和46類二級功能代謝通路。由圖6a可見，KEGG一級功能代謝通路中，與代謝相關的基因豐度最高，其次為遺傳信息處理、環境信息處理、細胞過程、人類疾病和有機系統。其中，D1、D2、D3 中與代謝相關的基因豐度占各樣品總基因豐度的比例分別為72.36%、71.95%、71.81%。D2 和D3 中6 類一級功能代謝通路的基因豐度均高于D1。

圖6 KEGG一級和二級功能代謝通路Fig.6 KEGG primary and secondary functional metabolic pathways

在二級KEGG 的基因數據庫中，對46 類二級功能代謝通路中基因豐度排名前12的代謝相關功能基因進行注釋，結果如圖6b所示。D1、D2、D3 中碳水化合物代謝和全局概覽通路為主要二級功能代謝通路，其次為氨基酸代謝、能量代謝、核苷酸代謝及輔酶維生素代謝。綜合圖6a 和圖6b 可見，D1、D2、D3 中一級功能代謝通路與二級功能代謝通路的基因豐度呈現一定的規律性，即D2＞D3＞D1。

含碳有機物質是微生物的主要能源和碳源。土壤微生物碳代謝途徑多樣，主要有三羧酸循環、卡爾文循環、二羧酸-羥基丁酸循環和3-羥基丙酸雙循環［6］。利用宏基因組技術檢測到的煙田土壤碳代謝基因調控三羧酸循環、糖酵解途徑和糖異生途徑。圖7a為土壤碳代謝基因編碼的酶及其調節的代謝途徑，可見甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）、磷酸甘油酸激酶（PGK）、磷酸甘油酸變位酶（gpmB、gpml、APGM）、2，3-二磷酸甘油酸依賴性磷酸甘油酸變位酶（PGAM）、烯醇酶（ENO）、丙酮酸激酶（pyK）、丙酮酸脫氫酶（aceE、aceF、PDHA、PDHB）調節糖酵解和糖異生途徑；檸檬酸合成酶（gltA）、異檸檬酸脫氫酶（ICD）、蘋果酸脫氫酶（MDH）調節三羧酸循環（TCA）。這表明糖酵解和糖異生途徑在煙田土壤碳循環過程中較為活躍。

圖7 土壤碳循環示意圖（包含糖酵解、糖異生和三羧酸循環）和碳代謝基因豐度熱圖Fig.7 Soil carbon cycle diagram（including glycolysis，gluconeogenesis and tricarboxylic acid cycle）and carbon metabolism gene abundance heatmap

圖7b 為碳代謝基因豐度熱圖，可見二羧酸-羥基丁酸循環相關基因（atoB、coxL、ACSS）和三羧酸循環相關基因（pdhD、fdfH、sdhA、gltA、aceF、aceE、korA）豐度占比較高。這表明煙田主要固碳途徑為二羧酸-羥基丁酸循環和三羧酸循環。綜合圖7a和圖7b可見，上述酶基因豐度呈現出健康煙田D1高于易感病煙田D2、D3的規律性。

利用宏基因組技術檢測到的煙田土壤氮代謝基因，調控硝酸鹽還原、異化硝酸鹽還原、硝化、反硝化、固氮和谷氨酸合成［6］。由此，繪制鳳凰村煙田土壤氮循環示意圖，并標注出相關過程的酶基因，如圖8a所示。調控亞硝酸鹽還原（Nitrite reduction）和一氧化氮還原（Nitric-oxide reduction）的功能基因占7.90%，調控硝酸鹽還原（Nitrate reduction）的功能基因占31.70%，調控羥胺氧化（Hydroxylamine oxidation）和一氧化二氮還原（Nitrous-oxide reduction）的功能基因占3.69%，調控氨氧化（Ammonia oxidation）和固氮（N fixation）的功能基因占11.20%，調控谷氨酸合成（Glutamate synthesis）的功能基因占32.70%。煙田土壤中谷氨酰胺合成酶（glnA）、谷氨酸合成酶（gltB、gltD）、谷氨酸脫氫酶（GDH2、gdhA）、同化硝酸鹽還原酶（nasA、narG、narH、narL、nasB）、亞硝酸還原酶（nirK、nirA、nirB）、一氧化氮還原酶（norB）、氧化亞氮還原酶（nosZ）、亞硝酸鹽氧化還原酶（nxrA、nxrB）活性較高。

圖8 土壤氮循環示意圖和氮代謝基因豐度熱圖Fig.8 Soil nitrogen cycle diagram and nitrogen metabolism gene abundance heatmap

由氮代謝基因豐度熱圖（圖8b）可見，煙田土壤谷氨酸合成基因（glnA、GDH2、gdhA、gltB、gltD）、反硝化基因（narG、narH、nasA、narL、nasB、norB、nirK）、硝化基因（nxrB、nxrA）豐度較高。這表明煙田土壤氮代謝以谷氨酸合成、反硝化和硝化作用為主。在反硝化過程中，健康煙田D1土壤氮代謝基因nasA、narG、narH、narL、napA、nasB、nirK、nirS、norB、norC、nosZ的豐度均低于易感病煙田D2、D3。

3 討論

不同健康狀態的煙田中土壤微生物群落組成不同［20］。健康與易感病煙田土壤細菌群落結構有明顯差異。在鳳凰村健康和易感病煙田土壤中，放線菌門（Actinobacteria）、變形菌門（Proteobacteria）、酸桿菌門（Acidobacteria）和綠彎菌門（Chloroflexi）為優勢菌門，與黃闊等［21］和WU X 等［22］發現的優勢菌門結果一致。優勢菌屬慢生根瘤菌屬（Bradyrhizobium）、鏈 霉 菌 屬（Streptomyces）、分 枝 桿 菌 屬（Mycobacterium）為有益菌屬［23-25］，這3個優勢有益菌屬在健康煙田D1 中的相對豐度均極顯著高于易感病煙田D2、D3。慢生根瘤菌屬（Bradyrhizobium）在農田環境和作物根際中發揮較大的固氮潛能，為重要的植物根際促生菌［23-24］；鏈霉菌屬（Streptomyces）為拮抗菌，產生多種抗生素，對煙草土傳病害有一定的生防作用［25］；分枝桿菌屬（Mycobacterium）能夠拮抗多種細菌產生的病害［25］。非優勢菌屬固定桿菌屬（Conexibacter）、纖線桿菌屬（Ktedonobacter）、鞘脂單胞菌屬（Sphingomonas）為有益菌屬［26-29］，這3 個非優勢有益菌屬在健康煙田D1 中的相對豐度均高于易感病煙田D2、D3。固定桿菌屬（Conexibacter）可增強土壤微生物群落的穩定性，在土壤-植物系統的氮循環中發揮作用［26］；纖線桿菌屬（Ktedonobacter）為土壤中有益菌屬［27］；鞘脂單胞菌屬（Sphingomonas）可抵抗多種病原菌［28］，具有顯著的生物降解和生物合成能力，在維持土壤氮平衡方面起著重要作用［29］。慢生根瘤菌屬（Bradyrhizobium）和鞘脂單胞菌屬（Sphingomonas）屬于變形菌門，鏈霉菌屬（Streptomyces）、分枝桿菌屬（Mycobacterium）和固定桿菌屬（Conexibacter）屬于放線菌門。徐新雯等［30］和Trivedi等［31］等研究發現，放線菌門豐度越高，煙田土壤抗病能力越大，可能是因為大部分微生物具有較強的抗病性。健康煙田土壤環境有利于這些有益菌屬的生長，可在一定程度上抵制病原菌生長以減少土傳病害的發生。

本研究中易感病煙田D2、D3的各項土壤化學性質均高于健康煙田D1，這可能是因為易感病煙田的根系活動下降，吸收養分的能力變弱，導致易感病煙田土壤養分含量過剩，且崔永和［32］研究表明富營養化會導致煙草病害頻發。土壤酶活性是反映土壤質量和生物活性的重要指標［33-34］。本研究中易感病煙田D2、D3 的URE、ACP 活性高于健康煙田，易感病煙田D3的INV活性高于健康煙田，初步推測可能與易感病煙田中各項化學性質指標均高于健康煙田有關，但其作用機制還有待深入研究。URE 受土壤微生物數量、有機質含量影響，可反映土壤中氮素情況［35］；ACP參與土壤磷的循環，可以將有機形式的磷轉化為可被植物利用的無機磷［36］；INV 可促進土壤中有機質的分解，提升土壤肥力水平［36］。本研究中健康煙田D1 的PR 活性顯著高于易感病煙田D2、D3。PR可將土壤中蛋白質分解成氨基酸，是提高煙葉質量的一種有效方法［37］。

本研究中3 塊煙田土壤的6 類一級功能代謝通路中代謝的基因豐度最高，且占比均超過70%，說明土壤微生物的代謝旺盛，與劉坤和等［38］的研究結果一致。土壤微生物代謝是各菌屬與環境之間的物質和能量交換過程［39］。本研究中易感病煙田D2、D3的功能基因豐度占比較高，這與張仁軍等［40］的研究結果基本一致，推測其代謝相關的功能基因與煙草病害的發生密不可分，但其作用機制還有待進一步研究。

4 結論

宏基因組技術檢測分析表明，健康煙田細菌的組成、相對豐度與易感病煙田之間存在差異。健康煙田中有益菌屬的相對豐度高于易感病煙田，而易感病煙田土壤細菌群落結構失衡，有益菌減少，對病原菌的拮抗能力減弱。土壤微生物碳代謝途徑以三羧酸循環、糖酵解和糖異生途徑為主，健康煙田土壤中關鍵酶基因豐度均高于易感病煙田。土壤微生物氮代謝途徑以谷氨酸合成、硝化和反硝化過程為主，健康煙田反硝化過程中酶基因豐度低于易感病煙田。