一種白蠟樹真菌病害的分離與鑒定

覃瑩菲，張 鑫，陳 岳，李成剛，譚新球

（1.湖南大學研究生院隆平分院，湖南 長沙 410125；2.湖南省農業科學院植物保護研究所，湖南 長沙 410125）

白蠟樹（Fraxinus chinensisRoxb）為木犀科梣屬大型落葉喬木[1]，在我國共有27 種。白蠟樹高15～20 m，樹皮呈灰褐色，頂生的小葉與側生的小葉等大或稍大，羽狀復葉長15～25 cm，葉柄長4～6 cm。白蠟樹耐旱，萌發能力強，生長迅速，樹形優美，材理通直，還有較強的耐鹽性，常種植于鹽堿地以改良環境，具有較好的綠化及生態價值[2]。白蠟樹在我國種植歷史悠久、分布甚廣，其植株生長迅速，枝條柔韌可供編制各種用具，樹皮還具有較高的藥用價值[3]，相關產業具有一定規模。

近年來，白蠟樹病蟲害問題日益嚴重，在樹苗期和成熟期對白蠟樹造成嚴重危害，阻礙白蠟樹生長發育及相關產業發展。研究報道，由立枯絲核菌引起的立枯病是白蠟樹苗期的主要病害，主要危害地下根部和莖基部，導致白蠟樹出現不規則褐色凹陷的病斑，嚴重時會導致幼苗死亡[4]。白蠟褐斑病主要危害葉片，病斑為灰褐色，表面分布深褐色霉點，會造成葉片脫落或變形，嚴重時會使植株死亡[5]。流膠病也會影響白蠟樹的生長，其發生與氣候、栽培管理水平、土壤土質等有相關性，真菌侵染或者病蟲侵入都會導致流膠病，具體癥狀為白蠟枝干流出黃色膠狀物質，最終導致樹體衰弱、枯竭[6]。白蠟枯梢病由白蠟鞘孢菌所致，病部出現潰瘍或壞死，且木質部褪綠明顯，當病斑擴展環繞枝條，就會產生枯梢[7]。按昆蟲類別劃分，為害白蠟樹的常見害蟲有蟬蛾目瘦蛾科害蟲，鱗翅目、膜翅目、半翅目、鞘翅目等害蟲。白蠟樹從春天長葉到秋冬落葉，均受害蟲侵擾[8]。白蠟窄吉丁初孵幼蟲會從白蠟樹韌皮部啃食至木質部，導致樹皮開裂、脫落[9]。白蠟梢距甲成蟲啃食樹苗葉柄，使得葉片萎縮，幼苗不能正常生長[10]。總之，多種病蟲害導致白蠟樹生長發育緩慢，外觀受損嚴重甚至死亡，不利于環境美化和經濟效益提高。因此，鑒定白蠟樹病蟲害的對白蠟樹的生長及相關產業發展具有重要意義。

鏈格孢屬（Alternariaspp.）真菌寄主廣泛，可為害糧食作物、蔬菜、花卉、數木等多種經濟作物，導致嚴重的經濟損失，鏈格孢菌（Alternaria alternata）廣泛分布在糧食、飼料、土壤和腐爛有機物質中，部分致病的鏈格孢菌對其寄主植物具有致病毒素，從而侵染寄主植物[11]。如柑橘鏈格孢褐斑病主要危害橘、柚、橙等，引起落葉落果和枯梢，帶病斑果實難以銷售[12]。鏈格孢侵染枸杞后，會產生典型黑霉病癥狀，病斑周圍呈水漬狀，中部產生白色菌絲，果實漸漸軟化、變黑，失去經濟價值[13]。羅光明等[14]通過轉錄組技術研究了梔子接種鏈格孢菌后在基因轉錄上的差異，分析了關鍵通路和關鍵基因，有助于探明鏈格孢菌與植物的互作機制。文中探明對白蠟樹葉片的致病菌進行了形態學鑒定和分子生物學鑒定，以期為白蠟樹病害防治提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試菌種 供菌種鑒定的白蠟樹病葉實體于2022 年7 月28 日采摘于懷化市芷江縣楊家坪鎮。

1.1.2 培養基 PDA 培養基：200 g 馬鈴薯切成小塊，沸水煮30～40 min，取紗布過濾，冷卻至室溫，加入葡萄糖20 g，加ddH2O 定容至1 L，分裝至200 mL 錐形瓶（配置固體培養基每瓶加入瓊脂3 g），121℃，滅菌20 min，冷卻后放置4℃備用。

1.1.3 主要試劑 T5 Direct PCR Kit 購買自Tsingke Biotechnology 生物有限公司。引物采用真菌通用引物ITS1、ITS4，由Tsingke Biotechnology 生物有限公司合成，引物序列為ITS1：5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3';ITS4：5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌種分離 內生菌的分離參考袁珊珊等[15]方法進行了細微的調整。將采集的病葉在超凈臺內用1% NaClO 浸泡1 min，隨后轉入75% 乙醇中浸泡1 min，用手術刀片輕輕切割病斑，用接種針小心取出中間病葉，最終獲得2 mm×2 mm 含有病菌的病葉，小心接種在PDA 平板培養皿中，每個培養皿接種一個菌塊，重復5 次，放置于28℃恒溫培養箱中培養，每日觀察菌株生長情況2 次。該菌株編號Z3727-10。

1.2.2 菌絲DNA 提取及檢測 當菌絲生長至直徑為3 cm 時，取邊緣菌絲，在超凈臺切割成1 mm×1 mm菌絲塊接種至PDA 液體培養基中，28℃，200 r/min培養，每天觀察菌絲生長情況，待菌絲長至合適大小，用濾膜過濾培養基，保留菌絲球，利用CTAB 法進行基因組DNA 提取，將提取的DNA 置于-20℃冰箱保存備用，取2 μL 提取的DNA 經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，使用Syngene G:BOX 凝膠成像系統進行拍照。

1.2.3 PCR 擴增及其序列鑒定 以提取的基因組DNA 為模板，應用真菌通用引物ITS1和ITS4進行PCR 擴增，PCR 擴增體系為2×T5 Direct PCR Mix 12.5 μL，上游引物1 μL，下游引物1 μL，DNA 樣品0.5μL，加ddH2O 定容至25 μL；PCR 擴增程序為98℃預變性3 min；98℃變性10 s，55℃退火10 s，72℃延伸30 s，共計30 個循環；最后72℃延伸5 min， 4℃保持。PCR 結束后取10 μL PCR 產物進行瓊脂糖凝膠電泳，并將產物送至北京擎科生物科技股份有限公司進行測序。測序結果登錄NCBI 進行Blast 比對鑒定。

2 結果與分析

2.1 菌種形態特征

采集的葉片病斑如圖1 所示，病斑呈黑色，圓形，表面光滑，病斑中心扁平。菌種分離生長形態如圖2 所示，分離的菌絲在生長速度上并無明顯差異，菌絲長勢和菌絲濃密程度差異不大，菌絲光滑，有光澤，正面呈白色向四周蔓延生長，背面有前期黃色物質析出，后期呈現黑色，菌絲分布茂密，菌落呈半透明狀，無水滴析出。

圖1 白蠟樹病葉

圖2 白蠟樹病葉分離的病菌菌絲形態

2.2 菌絲DNA 提取及PCR 擴增

利用CTAB 法提取Z3727-10 菌絲總DNA 進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果顯示，DNA 條帶清晰明亮，無拖尾現象，檢測結果表明DNA 提取效果良好，基因組DNA 完整，可以用作后續PCR 試驗。以DNA 為模板，利用真菌鑒定通用引物進行PCR擴增并對結果進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果（圖3）顯示目的產物條帶大小與預期結果相同。

圖3 ITS-PCR 凝膠電泳檢測

2.3 序列比對

對PCR 產物進行測序，結果顯示，PCR 產物長度為585 bp，且為單峰，表明菌種分離純化成功，無其他雜菌污染，獲得單一菌種。將目的基因序列在NCBI 中進行比對，結果（圖4）表明，與待鑒定菌種相似性最高的菌株為Alternaria alternata，query cover 為100%，per.ident 為100%，最終確定病原菌為Alternaria alternata（黑斑病菌）。并對菌種鑒定結果進行系統進化分析，結果如圖5 所示，從圖5中可以看出，Z3727-10 屬于鏈格孢屬（Alternala）。

圖4 序列比對結果

圖5 菌種系統進化發育樹

3 討 論

鑒定白蠟樹病害的病源菌有助于采取有效措施防治白蠟樹病害，對白蠟樹的生長發育及相關產業的發展具有重要意義。將病原菌進行分離后培養，觀察菌絲形態，測定生長速率難以準確判定病原菌種類，目前多采用ITS等分子鑒定手段對菌種進行鑒定，國際核酸庫信息資源不斷豐富，將ITS序列與GenBank 數據庫進行Blast 比對，序列相似性≥99%，即可以鑒定為相同種[16]，通過對白蠟樹病害菌種的形態觀察及基因庫比對，最終確定病原菌為Alternaria alternata（黑斑病菌）。

黑斑病菌對多種植物如棗樹、蘋果梨、金刺梨等均可造成危害。研究報道，黑斑病入侵棗樹后，一般在果實白熟期開始顯現癥狀，且病斑多在果實頂端或果實臍部，對果實口感造成影響，嚴重時造成果實腐爛，減產40%[17]。黑斑病菌經果皮入侵，但在果實采摘時無性狀，貯藏時發病率可高達37%[18]。研究表明，80%多菌靈可濕性粉劑、75%百菌清可濕性粉劑、70% 甲基硫菌靈可濕性粉劑可在室內有效抑制黑斑病菌[19]。因此，鑒定白蠟樹病菌，并及時采取有效防治措施，對保護白蠟樹與減少經濟損失具有重要意義。