甲醛固定石蠟包埋組織4種DNA提取方法的比較分析

黃靜 李琪睿 李禹澤 宋海迪 劉安琪 宋振祥 趙晉遠 宣宇佳 白慧茹 霍志鑫 易新容 顧捷 王亞麗 陳麗琴

收稿日期：2023-06-06; 修回日期：2023-08-29。

基金項目：內蒙古自治區自然科學基金項目（2019MS08155）；內蒙古醫科大學大學生創新創業訓練計劃項目（202210132063）；內蒙古醫科大學大學生科技創新“英才培育”項目（YCPY2023104）。

* 通信作者：陳麗琴，教授，碩士研究生導師，從事法醫遺傳學和法醫病理學研究，E-mail： lqchenyj@163.com；

王亞麗，實驗師，主檢法醫師，從事法醫遺傳學和法醫病理學研究，E-mail： yali.shirley@foxmail.com。

摘 要：本研究以10例甲醛固定石蠟包埋組織（FFPET）作為疑難檢材，將其制成蠟膜，分別以二甲苯-Chelex100法、脫蠟液-Chelex100法、脫蠟液-Vazyme FastPure FFPE DNA Isolation試劑盒（簡稱FP試劑盒）、脫蠟液-北京天根石蠟包埋組織基因組提取試劑盒法（簡稱天根試劑盒）提取DNA，進行紫外分光光度計測定（濃度、純度）及短串聯重復序列（STR）分型檢測（23個常染色體），通過比較分析FFPET在4種不同提取方法中的提取質量、STR分型質量和檢出率，從而尋求一種高效簡便、經濟實用、方便快捷的甲醛固定石蠟包埋組織中DNA提取方法。結果表明：應用4種方法提取的石蠟包埋組織蠟膜DNA經紫外分光光度計測定后顯示，應用2種Chelex100法提取的DNA濃度高于2款試劑盒，試劑盒提取的DNA的純度優于另外2種方法，以上差異均具有統計學意義（P<0.05）；FP試劑盒提取DNA的平均濃度和純度均優于天根試劑盒，無顯著性差異（P>0.05）；STR分型普遍存在不同基因座和同一基因座不同等位基因之間的擴增不均衡，呈現前高后低狀態；STR平均檢出率為FP試劑盒>天根試劑盒>Chelex100法，2種Chelex100法STR基因座檢出率比較無顯著差異（P>0.05），但分別和另外2種方法試劑盒方法相比有顯著差異（P<0.05），FP試劑盒和天根試劑盒法相比有顯著差異（P<0.05）。因此，在涉及甲醛固定石蠟包埋組織這類疑難檢材的法醫DNA鑒定案件時，脫蠟液-Vazyme FastPure FFPE DNA Isolation試劑盒法優于其余3種提取DNA方法。

關鍵詞：甲醛固定石蠟包埋組織；法醫檢材；疑難檢材；方法比較

中圖分類號：DF795.2? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻標志碼：ADOI：10.3969/j.issn.1007-7146.2023.05.007

A Comparative Analysis of Four Different DNA Extraction Methods from Formalin-fixed Paraffin-embedded Tissue in Forensic Medicine

HUANG Jing1， LI Qirui1， LI Yuze1， SONG Haidi1， LIU Anqi1， SONG Zhenxiang2， ZHAO Jinyuan1，

XUAN Yujia1， BAI Huiru1， HUO Zhixin1， YI Xinrong1， GU Jie1， WANG Yali1*， CHEN Liqin1*

（1. Department of Forensic Medicine， Inner Mongolia Medical University， Hohhot 010030， China; 2. Department of Cardiovascular Surgery， the Affiliated Hospital of Inner Mongolia Medical University， Hohhot 010030， China）

Abstract： The study used myocardial tissues of 10 forensic FFPET patients and the samples were prepared into films. The DNA was extracted using xylene-Chelex100 method， dewaxing solution-Chelex100 method， dewaxing solution-Vazyme FastPure FFPE DNA Isolation kit （abbreviated as FP kit） and dewaxing solution-Beijing Tiangen paraffin-embedded tissue genome extraction kit （abbreviated as Tiangen kit）， and determined by ultraviolet spectrophotometer for concentration and purity， and short tandem repeats （STR） typing test （23 autosomes）. The extraction quality， STR typing quality and detection rate of FFPET in four different extraction methods were compared and analyzed to find an efficient， simple， economical， practical， and convenient method. The results showed that for the quality of extrated DNA， the concentration of DNA extracted by two Chelex100 methods were higher than the two test kits， and the purity of DNA extracted by the kits were superior to that of the other two methods. The differences were statistically significant （P<0.05）. The average concentration and purity of DNA extracted by FP kit were superior to those by Tiangen kit without significant differences （P>0.05）. For the quality of STR typing and detection rate， STR typing generally shows the imbalance of amplification between different loci and different alleles of the same locus， with the former being higher and the later lower. The average detection rate of STR was in the order of： FP kit >Tiangen kit>Chelex100 method. There were no significant difference in the detection rates of STR loci between the two Chelex100 methods （P>0.05）， whereas there were significant differences between them and the other two methods （P<0.05）. There was a significant difference between the FP kit and Tiangen kit （P<0.05）. Therefore when dealing with difficult samples such as formaldehyde-fixed paraffin-embedded tissues in forensic DNA identification cases， the dewaxing solution-Vazyme FastPure FFPE DNA Isolation kit was superior to the other three DNA extraction methods.

Key words： formalin-fixed paraffin-embedded tissue; forensic examination materials; difficult inspection materials; method comparison

（Acta Laser Biology Sinica， 2023， 32（5）： 441-449）

甲醛固定石蠟包埋組織（formalin-fixed paraffin-embedded tissue，FFPET）是法醫鑒定中重要的存檔材料，可用于個人識別、親權鑒定、分子診斷以及一些案例的回顧性分析，在醫療糾紛及詐保案等案件鑒定中有時作為唯一的生物樣本。由于受到多種化學物理因素的影響，FFPET的DNA易斷裂、DNA蛋白質交聯［1-4］造成生物檢材的高度降解，從而導致DNA提取比較困難；此外，DNA蛋白的交聯作用會抑制DNA聚合酶活性從而影響PCR擴增，同時石蠟會阻礙組織的消化和DNA的釋放，這些因素均會影響DNA的提取。1985年Goelz等［1］最先提出石蠟包埋組織提取技術，即為經典的提取方法酚——氯仿抽提法；Howe等［5］提出氯化鈉鹽析法提取石蠟包埋組織，其方法操作簡單、速度快，造價低，而且不需要接觸酚、氯仿等有毒化學品。水煮法、微波法、單純消化法早年應用較多，但各有優缺點［6］。近年來，各類石蠟提取DNA的商品化試劑盒被開發出來，應用較廣且提取效果較好的是Qiagen的QIAamp DNA FFPE Tissue試劑盒，但價格昂貴，其他的如北京天根提取試劑盒、湖南圣湘提取試劑盒等應用也較多［7］。基于FFPET的高度降解、石蠟的影響因素，且考慮到二甲苯脫蠟的高效性和其自身具有的毒性［8-9］，我們選取了4種不同的提取甲醛固定石蠟包埋組織DNA方法進行比較分析，尋求一種高效簡便、經濟實用、方便快捷的DNA提取方法。

1 材料與方法

1.1 樣本

本研究樣本為收集于4例案件的10份不同部位的甲醛固定石蠟包埋心肌組織，均為內蒙古醫科大學司法鑒定中心法醫病理鑒定室近半年存檔的標本材料，且選取的樣本非腫瘤組織、無明顯自溶，具體信息見表1。將石蠟組織制作成厚度為10 μm每張的蠟膜組織，每5張為一組。

1.2 主要試劑與儀器

無水乙醇（光華科技有限公司，廣東），二甲苯（科密歐化學試劑有限公司，天津），格林GS脫蠟液（格林標本技術開發有限公司，哈爾濱），Chelex100（Bio-RAD公司，美國），蛋白酶K（10 mg/μL）（Promega公司，美國），二硫蘇糖醇（DL-Dithiothreitol，DTT）（百奧萊博科技有限公司，北京），Vazyme FastPure FFPE DNA Isolation試劑盒（Vazyme公司，南京），北京天根石蠟包埋組織基因組提取試劑盒（天根生化科技公司，北京），Verifiler Plus Early Access試劑盒（Thermo Fisher公司，美國），Hi-Di formamide（Thermo Fisher公司，美國）。

RM2255切片機（徠卡公司，德國），H203-H型恒溫金屬浴（卡尤迪生物科技有限公司，北京），NanoDropND-2000c型紫外分光光度計（Thermo Fisher公司，美國），9700型PCR擴增儀（Thermo Fisher公司，美國），3130型遺傳分析儀（Thermo Fisher公司，美國）。

1.3 DNA提取及定量

1.3.1 DNA提取

脫蠟液-Chelex100法：向1.5 mL裝有5張10 μm厚蠟膜的EP管中加入1 mL脫蠟液溶液，37℃金屬浴10 min，13 000 r/min離心15 min，小心吸去棄掉脫蠟液；加入1 mL無水乙醇洗滌，上下顛倒3 min， 13 000 r/min離心15 min，棄去無水乙醇（重復該步驟2～3次）；室溫開蓋放置直至殘留乙醇揮發完全；加入200 μL的5% Chelex100、10 μL的20 mg/mL的蛋白酶K和10 μL的1 mol/L的DTT，56℃孵育過夜；98℃煮沸8 min，13 000 r/min離心3 min，上清液即為提取的DNA。

二甲苯-Chelex100法：向1.5 mL裝有5張10 μm厚蠟膜的EP管中加入1 mL二甲苯溶液，后續操作步驟同脫蠟液-Chelex100法。

天根試劑盒法：根據天根試劑盒說明書操作。1）將5張10 μm厚蠟膜裝于1.5 mL無菌離心管中，加入500 μL裂解液GL，再加入50 μL緩沖液GP，劇烈渦旋10 s。2）98℃孵育30 min，期間顛倒混勻3次，直至樣品完全溶解，12 000 r/min離心5 min。3）使用200 μL槍頭沿管壁小心吸取中間層的水相清液于新的離心管中。4）加入2倍體積的無水乙醇，充分混勻，靜置3 min。5）將上一步所得的混合液加入一個吸附柱CR2中，8 000 r/min室溫離心2 min，倒掉收集管中的廢液，重新將吸附柱放回收集管中。6）向吸附柱CR2中加入500 μL緩沖液GD，8 000 r/min離心1 min，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱放回收集管中。7）向吸附柱CR2中加入600 μL漂洗液PW，8 000 r/min室溫離心1 min，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱放回收集管中。8）重復第7步。9）將吸附柱CR2放回收集管中，12 000 r/min離心2 min，倒掉廢液。10）將吸附柱開蓋置于室溫放置2～5 min，以徹底晾干吸附材料中殘余的漂洗液。11）將吸附柱CR2轉入一個干凈的離心管中，向吸附膜的中間部位懸空滴加65℃預熱的30～100 μL洗脫緩沖液TE洗脫，室溫放置2～5 min，12 000 r/min離心2 min，將收集有DNA的離心管-20℃保存。

FP試劑盒法：根據FP試劑盒說明書操作。

1）加入0.6 mL Deparaffinization Solution至樣品中，劇烈渦旋5 s，短暫離心讓樣品浸泡到脫蠟液中，56℃水浴6 min，劇烈渦旋20 s。2）14 000 r/min離心2 min，棄上清。3）加入200 μL Buffer FTL和20 μL Proteinase K工作液至樣品中，渦旋混勻，56℃水浴1 h至樣品完全消化，其間需顛倒混勻數次。4）90℃水浴1 h。5）加入200 μL Buffer FL和200 μL無水乙醇至上述處理液中，渦旋混勻15 s。6）將FFPE DNA吸附柱置于收集管中，轉移混合液至吸附柱中，10 000 r/min離心60 s。7）棄濾液，將吸附柱置于收集管中，加入500 μL Buffer FW1（已加入乙醇）至吸附柱，10 000 r/min離心60 s。8）棄濾液，將吸附柱置于收集管中，加入650 μL Buffer FW2（已加入乙醇）至吸附柱，10 000 r/min離心60 s。9）棄濾液，將吸附柱置于收集管中，10 000 r/min離心空柱3 min。10）將吸附柱轉移至新的1.5 mL離心管中，開蓋3 min（揮發乙醇），加入15～50 μL Elution Buffer至吸附柱膜中央，室溫靜置1 min，10 000 r/min離心1 min。11）丟棄吸附柱，將DNA保存于-20℃。

1.3.2 DNA定量

通過紫外分光光度計進行DNA定量，測定其質量濃度和純度，其純度用OD260 nm/OD280 nm來表示。

1.4 PCR擴增和電泳分型

PCR擴增：采用10.0 μL標準反應體系，Verifiler Plus Early Access試劑盒體系組成包括5×PCR Master Mix 2.5 μL，10×Primer Set 1.0 μL，DNA模板1.0 μL，去離子水5.5 μL。采用標準品007作為陽性對照，去離子水作為陰性對照。

PCR條件：95℃預變性1 min；96℃變性10 s，62℃退火90 s，2個循環；96℃變性10 s，59℃退火90 s，27個循環；68℃終延伸5 min；4℃保溫。

電泳分型：擴增好的PCR產物變性后在3130型遺傳分析儀上進行毛細管電泳，體系為9.8 ?L甲酰胺，0.2 ?L分子量內標LIZ600，1.0 ?L的PCR產物；用Gene Mapper ID-X軟件對23個常染色體STR基因座進行分型。

1.5 統計學處理

對各組樣本DNA質量和STR基因座檢出情況應用SPSS25.0軟件進行配對t檢驗，P<0.05為有統計學差異。

2 結果與分析

2.1 提取DNA質量

應用4種DNA提取法得到的DNA質量濃度均大于10 ng/μL，其中二甲苯-Chelex100法提取的DNA平均質量濃度最高，天根試劑盒法提取的DNA平均質量濃度最低，脫蠟液-Chelex100法提取的DNA平均質量濃度高于FP試劑盒法。應用4種DNA提取法得到的DNA平均純度均大于0.60，其中2款試劑盒法由于對DNA進行純化，因此DNA平均純度大于1.40，高于2種Chelex100法提取的DNA純度。脫蠟液-Chelex100法提取的DNA平均純度最低，為0.74±0.09；FP試劑盒法提取的DNA平均純度最高，為1.83±0.08，具體信息見表2。應用2種Chelex100法提取的DNA平均質量濃度高于2款試劑盒，試劑盒提取的DNA的平均純度優于另外2種方法，以上差異均具有統計學意義（P<0.05）。FP試劑盒提取DNA平均質量濃度和純度均優于天根試劑盒，此結果無顯著性差異（P<0.05）

2.2 STR基因座分型質量和檢出率

2.2.1 STR基因座分型質量

STR分型普遍存在不同基因座和同一基因座不同等位基因之間的擴增不均衡，均符合降解檢材典型圖譜：小片段分型的峰高較高，大片段峰高較低，呈現前高后低的趨勢。圖1為經二甲苯-Chelex100提取法后得到的STR分型圖譜（8-GE-L-CE），符合降解檢材的圖譜。

2.2.2 STR基因座檢出率

10份甲醛固定石蠟包埋組織蠟膜經Verifiler Plus Early Access試劑盒檢測，STR基因座檢出率最大為100%（23/23），最小為39.13%（9/23），具體信息見圖2。其中，分型完整的圖譜包括應用脫蠟液-Chelex100提取法為1例，FP試劑盒法為4例。圖3為應用FP試劑盒提取DNA得到的STR分型完整圖譜（10-G-L-FP）。圖4為應用脫蠟液-Chelex100法提取DNA得到STR檢出率最低的樣本（8-Z-L-T）。圖5為應用天根試劑盒法提取DNA得到的STR圖譜（tg-8-L-Y）。STR基因座平均檢出率：FP試劑盒>天根試劑盒>二甲苯-Chelex100法>脫蠟液-Chelex100法。2種Chelex100法STR基因座檢出率比較無顯著差異（P>0.05），但分別和另外2種試劑盒法相比有顯著差異（P<0.05）；FP試劑盒和天根試劑盒法相比有顯著差異（P<0.05）。

2.3 耗時、成本、環保對比分析

從耗時上分析，Chelex100法提取DNA涉及到孵育過夜，用時最長；天根試劑盒用時最短，為90 min。從成本上分析，Chelex100法成本最低，FP試劑盒成本約為天根試劑盒的1.5倍以上，成本較高。從環保角度分析，脫蠟液比二甲苯脫蠟液脫蠟更環保；FP和天根試劑盒法用于脫蠟的試劑未涉及到二甲苯，此法較二甲苯脫蠟更環保。具體信息見表3。

3 討論

FFPET是法醫鑒定中重要的存檔材料，中性甲醛是福爾馬林固定液中的主要成分，能夠保持人體死后組織細胞的完整性， 固定組織的同時對 DNA分子產生不利，DNA分子呈可逆性羥甲基化，并與蛋白質交聯后形成穩固的復合物，不利于DNA的提取［10-12］；甲醛在空氣中易氧化成甲酸，甲酸對DNA有較強的降解作用；此外，石蠟組織經過多種理化因素作用后，組織細胞內的DNA脆性增加，使其在提取過程中更容易斷裂，導致DNA提取比較困難［13］。因此，探索該類型組織樣本適宜的DNA提取方法很有意義。

有研究表明，切片太薄容易將DNA片段切斷，不利于大片段DNA的提取，太厚會增加PCR反應的抑制物，不利于后續PCR擴增，切片厚度為10 μm時提取的DNA質量更高［11-13］。因此，本研究用到的石蠟切片的厚度為每張10 ?m的蠟膜組織，每5張為一組，有利于提取出質量較高的DNA。FFPET DNA提取包括脫蠟、消化和純化這3個過程。有機溶劑二甲苯對試驗者身體有危害，同時對環境有污染［15，17］，因此本研究中4種DNA提取法用到非二甲苯和二甲苯脫蠟法。通過比較發現，同樣應用Chelex100法進行提取DNA，二甲苯和非二甲苯環保型脫蠟液的脫蠟效果相當，因此，在脫蠟環節上，可使用環保脫蠟液代替二甲苯脫蠟。

Chelex100是一種金屬離子螯合劑，能與鎂、鈣等核酸反應生成必需的二價金屬陽離子螯合，從而保護DNA，并減少由降解的DNA片段形成的雜帶，從而提高PCR反應陽性率及重復率［13，15］。Chelex100法是法醫物證生物檢材DNA提取最常用的方法之一，其提取FFPET價格低廉、經濟實用、操作簡便，在同一個EP管中進行，減少了污染風險，但其提取的DNA雜質較多，因此適用于大批量檢材進行DNA粗略提取［16，19］。商品化的試劑盒提取法FFPET主要是通過應用特殊的裂解條件釋放FFPET中的DNA，在高鹽狀態下選擇性吸附于離心柱內的硅基質膜，經過一系列快速的漂洗和離心，將細胞代謝物、蛋白等雜質去除，再用低鹽的緩沖液將DNA從硅基質膜上洗脫［20-22］。2款商品化試劑盒各有優點、各有不足：在涉及FFPET檢材樣本量有限的情況下進行DNA提取時，FP試劑盒法的DNA檢出質量以及STR分型更為理想，便于進行后續的鑒定與分析；在進行快速DNA提取時，天根試劑盒耗時最短，且DNA提取質量較好，可應用于需要快速DNA提取的案件之中。

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