冷藏凡納濱對蝦肌肉軟化的生化特性及生物標記物

徐德峰，廖威龍，李彩虹，廖建萌，李 欣

（1.廣東海洋大學食品科技學院，廣東 湛江 524088；2.廣東醫(yī)科大學海洋醫(yī)藥研究院，廣東 湛江 524023；3.湛江市食品藥品研究所，廣東 湛江 524000；4.桂林理工大學化學與生物學院，廣西 桂林 541000）

作為全球海洋養(yǎng)殖業(yè)重要支柱，凡納濱對蝦（Litopenaeus vannamei，俗稱南美白對蝦）不僅在全球?qū)ξr總產(chǎn)量中占據(jù)主導地位（約占80%），而且其在食品安全和營養(yǎng)供給方面的作用日益凸顯。據(jù)2023年中國漁業(yè)統(tǒng)計年鑒數(shù)據(jù)，凡納濱對蝦海水養(yǎng)殖產(chǎn)量達到134.28萬t，淡水養(yǎng)殖達到75.83萬t[1]，已成為我國優(yōu)質(zhì)食物蛋白質(zhì)的重要來源[2]。雖然凡納濱對蝦市場需求日益增長，但肌肉軟化問題一直是影響其商品價值的主要因素。對蝦肌肉組織柔嫩，在冷藏過程中極易發(fā)生以肌肉軟化為代表的質(zhì)構品質(zhì)劣變，4 ℃冷藏條件下貨架期僅為72 h，嚴重影響其感官品質(zhì)和商品價值[3-5]。針對這一問題，本研究致力于探明冷藏對蝦肌肉軟化背后的生化機制及其生物標記物，深化品質(zhì)劣變的理論認知，為鮮活對蝦質(zhì)量保真提供理論指導。

肌肉軟化是一系列復雜生化事件的結果，肌纖維是維持肌肉硬度等質(zhì)構品質(zhì)的主要物質(zhì)基礎，而內(nèi)源酶誘導的肌纖維降解是肉品質(zhì)構劣化的關鍵生物學過程。研究發(fā)現(xiàn)，畜禽動物死后初期，細胞有氧呼吸停止而無氧呼吸增強，糖原消耗使乳酸累積，細胞內(nèi)質(zhì)子梯度增大，形成的跨膜質(zhì)子梯度可間接激活Na+或Ca2+交換蛋白，促進胞外Ca2+內(nèi)流，并誘導肌漿內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Ca2+瞬間大量釋放；與此同時，ATP水平、Ca2+-ATP酶、輕鏈蛋白激酶、磷酸酶、蛋白激酶活性也發(fā)生相應變化，上述生化因子相互作用直接影響到肌肉軟化進程。但比較后發(fā)現(xiàn)，豬、牛、雞等動物在貯藏期間的pH 值、Ca2+濃度、ATP 水平、代謝酶活性等生化因子的變化規(guī)律并不一致，這可能是因為不同動物肌肉品質(zhì)劣化進程取決于無氧代謝啟動后生物標記物的演替速度，相互間具有物種特異性[6-8]。Xu 等[9]發(fā)現(xiàn)對蝦在冷藏期間揮發(fā)性鹽基氮TVB-N 含量快速增加，肌纖維間隙增大，肌肉內(nèi)膜破裂，肌肉快速軟化；Peng 等[10]強調(diào)內(nèi)源性酶在對蝦死后加速肌肉軟化過程中的潛在作用。Bouskila等[11]發(fā)現(xiàn)葡萄糖-6-磷酸異構酶（G6PI）參與糖酵解或糖異生途徑，可催化葡萄糖-6-磷酸和果糖-6-磷酸的相互轉(zhuǎn)化產(chǎn)生能量使肌肉收縮。以上研究均指明肌肉軟化與生化代謝之間的密切關聯(lián)。然而，目前關于對蝦冷藏期間肌肉軟化與生化代謝因子間相關性的研究尚未見報道。

本研究通過監(jiān)測凡納濱對蝦冷藏期間肌肉生化因子水平和磷酸化調(diào)控酶活性，分析其與質(zhì)構指標的相關性，探明肌肉軟化相關的生化關系，進而識別生物標記物，以期為對蝦冷藏期間質(zhì)構劣化的早期預警與靶向監(jiān)控提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 主要藥品試劑

蒽酮（分析純AR），上?；瘜W試劑公司；苯甲磺酰氟（PMSF，AR），碧云天生物技術有限公司；ATP含量測定試劑盒、超微量Ca2+-ATP 酶試劑盒、酸性及堿性磷酸酶(ACP、AKP)測定試劑盒，南京建成生物工程研究所有限公司；BCA 蛋白濃度測定試劑盒，飛凈生物科技有限公司。

1.2 主要儀器設備

PHS-3E型雷磁pH儀，上海儀電科學儀器股份有限公司；TMS-PRO質(zhì)構儀，美國FTC公司；Varioskan全自動酶標儀，塞默飛世爾科技中國有限公司。

1.3 原料

鮮活凡納濱對蝦，體質(zhì)量（12.26±1.52）g，體長（8.25 ± 1.43）cm，購于廣東省湛江市麻章區(qū)東南水產(chǎn)品市場，充氧后2 h 內(nèi)保活運輸至廣東海洋大學食品科技學院水產(chǎn)品?；盍魍▽嶒炇疫M行預處理。選取無表面損傷且存活狀況良好的個體，自來水清洗后加冰塊使其猝死，用自來水洗凈體表，每6尾作為一組，裝入聚乙烯塑料保鮮袋，4 ℃冷藏120 h，每12 h取出一組測定相關指標。

1.4 方法

1.4.1 質(zhì)構分析（TPA）參照王偉等[12]法測定質(zhì)構指標。將對蝦去頭、剝殼，放到測試臺中間，選取第二腹節(jié)進行質(zhì)地多面分析。選用直徑為50 mm 的P50 平底柱形探頭，測前速度2.00 mm/s，測試速度1.00 mm/s，測后速度1.00 mm/s，壓縮程度50%。測定硬度、彈性、內(nèi)聚力、咀嚼性、剪切力等參數(shù)。

1.4.2 肌原纖維蛋白提取 參照Lametsch 等[13]法稍修改。選取多尾蝦的第二腹節(jié)，切碎，稱100 mg 碎肉于組織勻漿管中，加入緩沖液（1 mL裂解緩沖液，10 μL PMSF，10 μL蛋白酶抑制劑和10 μL磷酸酶抑制劑）混合，在4 ℃、3 000 r/min 條件下勻漿2 min，冰上裂解30 min，在4 ℃、4 000 r/min 條件下離心5 min，收集上清液保存于-80 ℃的冰箱中待用。使用BCA試劑盒測定蛋白濃度。

1.4.3 肌原纖維小片化指數(shù)（MFI）測定 參照Wu等[14]法，將蛋白溶液質(zhì)量濃度調(diào)至（0.5 ± 0.05）mg/mL，記錄波長540 nm 處的光密度，其平均值乘以200 即為MFI。

1.4.4 無氧條件下各生化因子指標測定 pH值測定參照Salih 等[15]法進行。糖原含量、乳酸含量、ATP含量、酸性與堿性磷酸酶（ACP、AKP）活性、Ca2+-ATP酶活性測定使用南京建城生物工程研究所生產(chǎn)的相關試劑盒，按照說明書依次測定。

1.5 數(shù)據(jù)處理

各指標平行測定3 次，數(shù)據(jù)用平均值± 標準偏差表示，采用SPSS 22.0 對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，多重比較采用單因素方差分析，使用Origin 8.5 和GraphPad Prism 8.0作圖。

2 結果與分析

2.1 冷藏期間對蝦肌肉質(zhì)構與纖維斷裂情況變化

質(zhì)構特性能夠反映凡納濱對蝦的新鮮程度[16]。由圖1(A)可知，隨著冷藏時間的增加，對蝦肌肉硬度呈下降趨勢，在冷藏72 h 后硬度迅速降至（2947±113）g。由圖1(B)可知，彈性與硬度呈相同變化趨勢，從初始的1.42±0.05降至120 h的0.66±0.01；由圖1(C)可知，對蝦內(nèi)聚力在冷藏期間持續(xù)下降，由初始的0.62±0.02，降至120 h時的0.32±0.01，而咀嚼性從最初的（2524±127）g降至120 h的（504±51）g（圖1(D)）。說明冷藏時間延長顯著影響凡納濱對蝦肌肉的硬度、彈性、內(nèi)聚力和咀嚼性，直接指示其新鮮度下降。研究發(fā)現(xiàn)，在冷藏條件下，羊肉和鱸（Lateolabrax japonicus）魚肉的硬度隨冷藏時間增加而上升，而對蝦的肌肉質(zhì)構指標則呈下降趨勢[17,18]。這表明不同物種在冷藏后肌肉質(zhì)構指標的變化具有顯著差異。對蝦死后，特定蛋白酶從肝胰腺遷移到肌肉，加速肌原纖維蛋白的降解，導致肌肉快速軟化，通過蛋白質(zhì)組學分析揭示了蛋白酶促進死后肌肉代謝的作用，這可能是對蝦短暫尸僵期和快速軟化的原因[10]。MFI是反映對蝦肌肉完整性的一個重要指標[19]。由圖1(E)可知，對蝦肌肉MFI隨著冷藏時間的增加而增大。對蝦初始MFI 為21.63 ± 0.29，36 h 時升至62.13 ± 3.40，表明24 h 后肌肉纖維快速降解。進一步分析發(fā)現(xiàn)，MFI 與對蝦質(zhì)構相關指標均顯著負相關（P＜0.01）（圖1(F-I)），說明肌原纖維碎片化與質(zhì)構品質(zhì)劣變存在一定的因果關系。MFI 增加表明肌原纖維完整性受到破壞，可能源于細胞內(nèi)結構降解酶活性增加而引起結構蛋白斷裂，使蛋白質(zhì)網(wǎng)狀結構強度降低，肌原纖維中的粗絲加速降解，表現(xiàn)出肌肉組織軟化[20]。李曉等[21]研究發(fā)現(xiàn)，0 ℃貯藏凡納濱對蝦，質(zhì)構指標均與貯藏時間呈負相關；Sun 等[22]發(fā)現(xiàn)在微凍條件下，對蝦在10 d時MFI呈顯著上升，與本研究趨勢一致，而與本研究MFI 顯著上升出現(xiàn)時間上的差異，可能是因為微凍低溫貯藏抑制了對蝦體內(nèi)生物化學反應，延緩了對蝦品質(zhì)劣化。

圖1 冷藏對蝦主要質(zhì)構指標和MFI的動態(tài)變化及其相關性Fig.1 Dynamic variation on primary textural indexes and MFI of refrigerated prawn,and the correlation between MFI and each index

2.2 冷藏對蝦肌肉組織生化代謝變化

在對蝦死后，機體會啟動細胞凋亡過程，伴隨內(nèi)源酶的激活可引起各種生化代謝發(fā)生規(guī)律變化[23]。由圖2 可知，對蝦冷藏24 h 內(nèi)pH 值下降，之后明顯增加（圖2(A)）；肌肉糖原質(zhì)量分數(shù)在初期24 h內(nèi)快速下降，由最初的（0.35±0.02）降至（0.28±0.02）g/100g，而后緩慢下降（圖2(B)）。在氧氣供應不足的環(huán)境下，細胞會啟動無氧糖酵解代謝途徑，將糖原分解為乳酸，并在此過程中不斷積累，導致細胞環(huán)境酸化，這與pH 值的變化相符，提示細胞內(nèi)酸堿平衡受到無氧糖酵解的影響[24]。由圖2(C)可知，丙酮酸質(zhì)量摩爾濃度先快速上升至峰值，由（1.30±0.15）mmol/100g升至36 h的（2.85±0.08）mmol/100g，之后持續(xù)下降，提示細胞代謝類型發(fā)生變化。Chen等[25]指出糖原和乳酸作為糖酵解反應的底物和產(chǎn)物，其含量變化直接反映糖酵解水平和速率。在前24 h 內(nèi)，糖原被快速分解產(chǎn)生丙酮酸后，在細胞缺氧的環(huán)境下乳酸質(zhì)量摩爾濃度快速增加（圖2(D)），由（0.06 ± 0.01）mmol/g 升 至24 h 時 的（0.23 ±0.01）mmol/g，之后快速下降，直至120 h 時的（0.09±0.01）mmol/g，表明冷藏前24 h大多數(shù)丙酮酸轉(zhuǎn)變成乳酸。王源源等[26]研究干露對克氏原螯蝦（Procambarus clarkii）成蝦存活、相關代謝酶及組織結構的影響，發(fā)現(xiàn)其代謝酶活性變化趨勢與本研究類似，說明冷藏初期細胞代謝模式轉(zhuǎn)變?yōu)闊o氧呼吸。

圖2 冷藏對蝦糖酵解過程各指標變化Fig.2 Changes of each index related to glycolysis process

鑒于物質(zhì)代謝與能量代謝的密切相關性，進一步考察冷藏過程中對蝦肌肉中ATP 的含量變化。由圖2(E)可以看出，新鮮對蝦肌肉中ATP 質(zhì)量摩爾濃度為（339.88±8.44）μmol/g，48 h 降至（53.55±1.39）μmol/g，僅為初始值的15%，72 h 時ATP 消耗完畢。通常，乳酸堆積造成pH 值下降，使肌漿網(wǎng)的Ca2+滯留能力下降，Ca2+大量釋放至細胞外，促使肌原纖維間Ca2+濃度增加，進而激活ATP 酶使ATP 迅速降解[27]。磷酸果糖激酶（PFK）是肌肉糖酵解最重要的限速酶。在糖酵解反應中，PFK 催化的反應為不可逆反應，PFK 對糖酵解的驅(qū)動有著至關重要作用[28]。由圖2(F)可知，在冷藏至24 h 時，PFK 活性顯著下降至（20.82±0.32）U/mg，之后逐步降至（11.13±0.10）U/mg。林珩迅等[29]發(fā)現(xiàn)，ATP含量降低可能導致糖酵解途徑中所需的能量供應不足，限制PFK 的催化活性。此外，ATP 的降低也可能引起代謝途徑中其他關鍵酶的活性下降，如磷酸己糖激酶（PGK）和磷酸甘油醛-3-脫氫酶（GAPDH），進一步影響肌肉組織中的代謝類型[30]。

2.3 對蝦冷藏過程中磷酸酶和Ca2+-ATP 酶活性變化

ACP、AKP 參與磷酸基團的代謝，與蛋白質(zhì)代謝有關[31]。由圖3 可知，ACP 和AKP 活性從0 h 至60 h 基本不變，72 h 后開始上升，其中ACP 活性在120 h 升至（26.57±1.53）U/g，AKP 活性升至（1.46±0.10）U/g。此外，肌原纖維蛋白是水產(chǎn)品中最重要的結構和功能蛋白，其中肌球蛋白占肌原纖維蛋白的55%～60%[32]，而肌球蛋白穩(wěn)定性與Ca2+-ATP 酶活性有關，Ca2+-ATP 酶活性越高，肌肉蛋白質(zhì)越穩(wěn)定[33]。如圖3(B)所示，冷藏期間對蝦肌肉Ca2+-ATP酶活性不斷下降，由初始（0.54±0.01）降至120 h 時（0.15±0.01）U/mg，下降近乎4 倍，間接反映肌原纖維的解離降解。通常，ATP 快速下降使Ca2+-ATP 酶可利用的能量不足，影響鈣泵功能，誘導肌漿內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Ca2+大量釋放，從而激活酸性或堿性磷酸酶的活性，促進蛋白質(zhì)分解[34]。

圖3 磷酸酶和Ca2+-ATP酶活性變化Fig.3 Changes in phosphatase and Ca2+-ATPase activity

2.4 冷藏對蝦肌肉軟化與各生化指標間的相關性

各指標間相關性見圖4。對蝦冷藏期間，質(zhì)構指標與MFI 指數(shù)間顯著負相關（P＜0.05），與Ca2+-ATP 酶活性顯著正相關（P＜0.05），其生化規(guī)律可能是對蝦死后肌肉代謝減緩，Ca2+-ATP酶活性下降，細胞內(nèi)Ca2+濃度升高，打破細胞內(nèi)的鈣離子平衡，激活鈣蛋白酶參與肌原纖維降解，隨后肌原纖維碎片化增加和質(zhì)構特性劣變，尤其是硬度和彈性指標快速下降。在各指標中Ca2+-ATP 酶活性與硬度相關性最強（R2=0.98），可能是因為Ca2+-ATP 酶在細胞內(nèi)鈣離子調(diào)控和能量代謝中的關鍵作用，Ca2+-ATP 酶是一種負責細胞內(nèi)鈣離子平衡的酶，其活性直接影響細胞內(nèi)的Ca2+濃度[35]。當Ca2+-ATP 酶驅(qū)動Ca2+從細胞質(zhì)或其他細胞區(qū)域轉(zhuǎn)運到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，導致細胞質(zhì)中的游離Ca2+減少，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Ca2+濃度相對升高，觸發(fā)肌肉細胞中的肌鈣蛋白與肌動蛋白的結合，引發(fā)肌肉的收縮反應[36]。同時可以看出，質(zhì)構指標與磷酸酶活性表現(xiàn)出負相關關系，其原因可能是冷藏后期微生物繁殖使細胞結構破裂，細胞內(nèi)核酸、磷脂和堿性磷酸鹽等細胞成分不斷釋放和聚集，間接誘導ACP或AKP激活，從而加速蛋白質(zhì)降解。這一過程會破壞對蝦肌肉的結構，導致肌肉組織松散，失去原有的緊密結構。Ca2+-ATP酶活性與磷酸酶活性呈顯著負相關（P＜0.05），Ca2+-ATP 酶活性下降通常與細胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)失衡有關，其活性下降被視為一種細胞應激反應，應激響應通常涉及MAP激酶（MAPK）通路，從而通過磷酸化下游目標蛋白來改變其活性或定位[37-40]。

圖4 凡納濱對蝦冷藏過程中各指標相關性分析Fig.4 Correlation analysis of various indexes during cold storage of Litopenaeus vannamei

鑒于物質(zhì)代謝與能量代謝的密切相關性，進一步分析糖代謝相關生化因子與肌原纖維降解的相關性有助于探明肌肉軟化的生物標記物。由圖4可見，MFI 指數(shù)與pH、糖原含量顯著負相關性（P＜0.05），這是因為在對蝦冷藏過程中，肌肉內(nèi)源酶的活性變化會影響肌原纖維降解，能量代謝速率減緩從而導致酸堿平衡失調(diào)。從生化代謝角度分析，ATP 是細胞內(nèi)能量的主要供應者，其通過釋放高能磷酸鍵來提供能量給各種生化反應。糖原作為能量儲存分子被降解成丙酮酸、乳酸和ATP，酸性物質(zhì)堆積使pH 值下降，反過來影響PFK 的催化活性，導致糖酵解速率降低。另外，PFK 是一種依賴于ATP的酶，當ATP 水平較低時，PFK 催化反應所需的高能磷酸鍵就會減少，PFK 的催化速率會受阻，進一步降低糖酵解速率，與經(jīng)典Michaelis-Menten 動力學理論相一致，說明PFK 驅(qū)動的糖酵解可能是觸發(fā)和加速肌肉快速軟化的關鍵前期生化事件。能量代謝是維持細胞生存和功能的基礎，其與對蝦肌肉的質(zhì)構特性密切相關[41]。ATP含量與質(zhì)構指標之間顯著正相關性（P＜0.05），ATP 在肌肉收縮機制中起著關鍵作用，新鮮對蝦中ATP 含量較高，可以維持收縮狀態(tài)，從而使肌肉保持一定的結構穩(wěn)定性和彈性。隨著冷藏時間的推移，ATP 生成減少而消耗增多，造成Ca2+-ATP酶轉(zhuǎn)移Ca2+的能力下降，從而使細胞內(nèi)鈣離子濃度升高，最終激活鈣蛋白酶并降解肌原纖維，增加肌原纖維碎片化的程度。綜上所述，Ca2+-ATP 酶在各指標間相關性最強，可作為冷藏對蝦以肌肉軟化為代表的質(zhì)構劣化的生物標記物。

2.5 Ca2+-ATP酶驅(qū)動肌肉軟化的可能機制

基于細胞內(nèi)生化代謝路徑及其生物學效應，分析Ca2+-ATP 酶驅(qū)動肌肉軟化的可能機制，提出如下科學假說（圖5）。

圖5 Ca2+-ATP酶驅(qū)動冷藏對戲肌肉軟化的可能機制Fig.5 Potential mechanisms of muscle softening driven by Ca2+-ATPase in shrimp during cold storage

在4 ℃冷藏初期，由于對蝦死亡而呼吸終止，細胞失去氧氣供應，無氧呼吸取代有氧呼吸，對蝦肌肉中的糖原通過糖酵解和無氧呼吸生成丙酮酸和少量ATP，隨后丙酮酸被氧化為乙酰輔酶A，轉(zhuǎn)運到線粒體進行三羧酸循環(huán)（TCA 循環(huán)），最終轉(zhuǎn)化為煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）和黃素腺嘌呤二核苷酸（FADH2），通過電子傳遞鏈進行氧化磷酸化產(chǎn)生ATP，而Ca2+-ATP 酶在細胞內(nèi)維持Ca2+濃度平衡起著關鍵作用，其通過消耗ATP主動轉(zhuǎn)運Ca2+，將細胞內(nèi)的Ca2+從低濃度區(qū)域（通常是細胞質(zhì)或細胞膜內(nèi)側(cè)）轉(zhuǎn)運到高濃度區(qū)域（如內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、細胞外區(qū)域）。隨著能量代謝減緩，ATP 生成速率降低，導致Ca2+-ATP 酶的鈣泵功能受阻，影響Ca2+的正常轉(zhuǎn)運，使內(nèi)質(zhì)網(wǎng)釋放的Ca2+在肌肉細胞內(nèi)大量積累，導致細胞內(nèi)Ca2+異常升高，進而激活鈣蛋白酶并降解肌原纖維蛋白和細胞骨架蛋白，引起肌肉軟化。

3 結論

本研究發(fā)現(xiàn)，對蝦冷藏初期肌肉質(zhì)構品質(zhì)指標快速下降，且與肌原纖維碎片化密切相關。伴隨著糖原含量快速下降，丙酮酸和乳酸累積，且ATP含量急劇降低，PFK 活性受抑制，導致糖酵解速率減緩。冷藏24 h 之后，ACP 和AKP 活性快速增加，促使肌原纖維蛋白去磷酸化，影響肌原纖維的結構穩(wěn)定性，從而觸發(fā)和加速肌肉快速軟化。冷藏初期，對蝦質(zhì)構快速劣化受關鍵內(nèi)源酶的協(xié)同激活，PFK 驅(qū)動的糖酵解可能是觸發(fā)和加速肌肉快速軟化的關鍵前期生化事件，其中Ca2+-ATP酶是生物標記物。