燈盞花素對(duì)心肌缺血再灌注損傷大鼠的心肌保護(hù)作用

孫玉艷,楊 然,高麗華

1.開灤總醫(yī)院心內(nèi)科，唐山 063000；2.開灤總醫(yī)院藥劑科，唐山 063000；3.滄州市人民醫(yī)院心血管內(nèi)科，滄州 061001

缺血性心臟病是心內(nèi)科常見的心血管疾病，其引發(fā)的急性心肌梗死及心力衰竭是心臟類疾病患者的主要死亡原因［1］。燈盞花素是從傳統(tǒng)苗藥燈盞細(xì)辛中提取制成的制劑，可擴(kuò)張腦血管、增加腦部血流量，臨床常用于治療腦供血不足、腦血管意外、腦血栓等癥［2-3］。有研究表明［4］，其可有效降低炎性因子的表達(dá)水平，抑制氧化應(yīng)激及促凋亡蛋白表達(dá)，從而對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷產(chǎn)生治療作用。本研究通過建立心肌缺血再灌注損傷（myocardial ischemiareperfusion injury，MIRI）大鼠模型，觀察燈盞花素對(duì)其心肌的保護(hù)作用，并探討其可能的機(jī)制。

1 儀器與材料

1.1 儀器

生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)儀（上海玉研科學(xué)儀器有限公司）；CX33 顯微鏡（日本Olympus 公司）。

1.2 試藥

燈盞花素（質(zhì)量分?jǐn)?shù)為99%，上海曙燦實(shí)業(yè)有限公司）；肌酸激酶同工酶（MB isoenzyme of creatine kinase，CK-MB）、心肌肌鈣蛋白T（cardiac troponin T，cTnT）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白細(xì)胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）試劑盒均購自上海撫生實(shí)業(yè)有限公司；兔抗大鼠白細(xì)胞介素-23（interleukin 23，IL-23）、白細(xì)胞介素-17（interleukin 17，IL-17）一抗均購自艾比瑪特醫(yī)藥科技（上海）有限公司。

1.3 動(dòng)物

SD 大鼠60 只，SPF 級(jí)，雄性，8 周齡，體質(zhì)量為（270±20） g，購自上海吉輝實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)有限公司，生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK（滬）2017-0012。

2 方法

2.1 分組與預(yù)干預(yù)

將大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周后隨機(jī)分為健康組、模型組、燈盞花素低劑量組、燈盞花素高劑量組，各15 只；參照文獻(xiàn)方法［5］，燈盞花素低劑量組、燈盞花素高劑量組大鼠腹腔注射燈盞花素生理鹽水溶液（50、100 mg·kg-1）；健康組、模型組大鼠腹腔注射等體積生理鹽水。每日1 次，干預(yù)5 d［5］。

2.2 MIRI 模型的建立

大鼠末次干預(yù)結(jié)束禁食禁水12 h，腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉大鼠，仰臥位固定于工作臺(tái)，頸部、胸腹部備皮消毒，生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)儀連接四肢記錄心電圖，切開頸部及氣管，氣管插管并連接小動(dòng)物呼吸機(jī)機(jī)械通氣，開胸暴露心臟，撕開心包膜，將一直徑為2 mm 消毒軟管與冠狀動(dòng)脈左前支一并結(jié)扎，30 min 后松開結(jié)扎線、取出軟管，再灌注2 h。以結(jié)扎后心電圖ST 段顯著升高、再灌注后ST 段自高點(diǎn)下降1/2 以上為建模成功［6］。模型組、燈盞花素低劑量組、燈盞花素高劑量組大鼠建立MIRI 模型，健康組僅插管開胸，不進(jìn)行結(jié)扎操作，各組均納入10 只進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.3 心電圖指標(biāo)的檢測(cè)

用生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)儀記錄并分析再灌注過程中大鼠室顫（ventricular fibrillation，VF）、室性心動(dòng)過速（ventricular tachycardia，VT）的發(fā)生次數(shù)、持續(xù)時(shí)間。

2.4 組織取材

再灌注結(jié)束后，采集大鼠腹主動(dòng)脈血，低溫離心機(jī)離心10 min （3 000 r·min-1，離心半徑為8 cm），置于4 ℃冰箱中冷藏保存；采血后脊椎脫臼處死大鼠，迅速摘取心臟，切取部分心肌組織分成2份，1 份置于多聚甲醛溶液（40 g·L-1）中保存24 h，常規(guī)脫水、透明、浸蠟、包埋，切成厚度為4 μm 的切片用于組織病理觀察；1 份置于-80 ℃冰箱中冷凍保存，用于蛋白檢測(cè)。剩余部分心臟置于-80 ℃冰箱中冷凍20 min 后，取出，用于2，3，5-氯化三苯基四氮（2，3，5-triphenyltetrazolium chlorid，TTC）染色實(shí)驗(yàn)。

2.5 TTC 染色檢測(cè)心肌梗死面積

取冷凍20 min 的剩余心臟，自結(jié)扎以下均勻切為厚度為2 mm 的心肌切片4 片，浸入TTC 溶液室溫染色30 min，PBS 清洗，40 g·L-1多聚甲醛固定，采集照片后用Image 軟件分析紅、白二色區(qū)域的面積，計(jì)算心肌梗死面積。心肌梗死面積=（白色面積/紅色面積）×100%。

2.6 血清心肌損傷指標(biāo)的檢測(cè)

取冷藏保存的部分血清，經(jīng)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）檢測(cè)血清心肌損傷指標(biāo)CK-MB、cTnT活性水平，根據(jù)試劑盒說明書操作，用酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm 處的吸光度（A）值，繪出曲線，計(jì)算CK-MB、cTnT 活性。

2.7 血清氧化應(yīng)激指標(biāo)的檢測(cè)

取冷藏保存的部分血清，用TBA 法、WST-8 法檢測(cè)血清氧化應(yīng)激指標(biāo)MDA 和SOD 水平，按照試劑盒說明書要求設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)步驟，計(jì)算血清MDA 質(zhì)量濃度、SOD 活性。

2.8 血清炎性因子的檢測(cè)

取冷藏保存的部分血清，經(jīng)ELISA 檢測(cè)血清炎性因子TNF-α、IL-1β水平，根據(jù)試劑盒說明書操作，用酶標(biāo)儀測(cè)定570 nm 處的A值，繪出曲線，計(jì)算TNF-α、IL-1β的質(zhì)量濃度。

2.9 HE 染色觀察心肌組織的病理學(xué)變化

取心肌組織切片，用二甲苯脫蠟，用梯度酒精水化，用自來水沖洗，經(jīng)蘇木精液染色5 min，用自來水沖洗，用鹽酸酒精分化，用氫氧化鈉溶液漂洗，用伊紅液染色2 min，常規(guī)脫水、透明，用中性樹脂封片，于顯微鏡下觀察心肌組織的病理改變。

2.10 檢測(cè)心肌組織IL-23、IL-17 蛋白的表達(dá)水平

取冷凍保存的心肌組織，剪碎后用研磨機(jī)研磨、勻漿，加入預(yù)冷的RIPA 裂解細(xì)胞，用低溫離心機(jī)離心12 min（8 000 r·min-1，離心半徑為10 cm），取上清液，經(jīng)BCA 試劑盒提取總蛋白并定量。取40 μg，以體積比1∶4 混合上樣緩沖液，金屬浴煮沸5 min，同上述離心方法離心，取上清液，恒壓下電泳分離，轉(zhuǎn)至PVDF 膜，用BSA 封閉液封閉2 h，加入兔抗大鼠IL-23、IL-17 一抗（1∶500），4 ℃冷藏過夜，用TBST 清洗，加入二抗（1∶2 000），常溫孵育2 h，用TBST 清洗，ECL 液發(fā)光，暗盒顯色，經(jīng)凝膠分析儀掃描分析蛋白條帶灰度值，以IL-23、IL-17 蛋白灰度值與內(nèi)參GAPDH 灰度值之比表示IL-23、IL-17蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

2.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

用SPSS 21.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析數(shù)據(jù)，用（±s）表示計(jì)量資料，以多因素方差分析檢驗(yàn)多樣本計(jì)量資料，以LSD-t檢驗(yàn)分析兩兩樣本。P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 大鼠心電圖指標(biāo)的比較

與模型組比較，燈盞花素低劑量和燈盞花素高劑量組大鼠VF、VT 發(fā)生次數(shù)減少，VF、VT 持續(xù)時(shí)間縮短，燈盞花素高劑量組的變化更顯著（P＜0.05）。見表1。

表1 各組大鼠心電圖指標(biāo)的比較 （n=10，±s）Tab.1 Comparison of electrocardiogram indexes of rats in each group (n=10,±s)

表1 各組大鼠心電圖指標(biāo)的比較 （n=10，±s）Tab.1 Comparison of electrocardiogram indexes of rats in each group (n=10,±s)

注：與模型組比較，aP＜0.05；與燈盞花素低劑量組比較，bP＜0.05。

組別模型組燈盞花素低劑量組燈盞花素高劑量組VF 發(fā)生次數(shù)/次9.50±0.90 5.10±0.60a 2.70±0.30b VF 持續(xù)時(shí)間/min 23.43±2.52 17.44±2.15a 11.05±0.96b VT 發(fā)生次數(shù)/次9.40±0.9 5.80±0.60a 4.10±0.50b VT 持續(xù)時(shí)間/min 24.43±2.43 20.66±2.72a 14.81±1.85b

3.2 大鼠心肌梗死面積的比較

與模型組比較，燈盞花素低劑量組、燈盞花素高劑量組大鼠心肌梗死面積占比降低，燈盞花素高劑量組的變化更顯著（P＜0.05）。見表2。

表2 各組大鼠心肌梗死面積占比的比較 （n=10，±s）Tab.2 Comparison of the proportion of myocardial infarction area in each group of rats (n=10,±s)

表2 各組大鼠心肌梗死面積占比的比較 （n=10，±s）Tab.2 Comparison of the proportion of myocardial infarction area in each group of rats (n=10,±s)

注：與模型組比較，aP＜0.05；與燈盞花素低劑量組比較，bP＜0.05。

組別模型組燈盞花素低劑量組燈盞花素高劑量組心肌梗死面積占比50.32%±5.41%41.70%±4.44%a 25.42%±2.51%b

3.3 大鼠血清心肌損傷指標(biāo)的比較

與健康組比較，模型組血清CK-MB、cTnT 活性升高（P＜0.05）；與模型組比較，燈盞花素低劑量組、燈盞花素高劑量組血清CK-MB、cTnT 活性降低，燈盞花素高劑量組的變化更顯著（P＜0.05）。見表3。

表3 各組大鼠血清心肌損傷指標(biāo)CK-MB、cTnT 活性的比較 （n=10，±s）Tab.3 Comparison of serum myocardial injury indexes CKMB and cTnT activity levels in each group (n=10,±s)

表3 各組大鼠血清心肌損傷指標(biāo)CK-MB、cTnT 活性的比較 （n=10，±s）Tab.3 Comparison of serum myocardial injury indexes CKMB and cTnT activity levels in each group (n=10,±s)

注：與健康組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與燈盞花素低劑量組比較，cP＜0.05。

組別健康組模型組燈盞花素低劑量組燈盞花素高劑量組CK-MB/（ng·mL-1）0.99±0.11 6.56±0.65a 4.46±0.64b 2.14±0.23c cTnT/（ng·L-1）44.83±4.07 149.91±17.84a 121.23±12.20b 85.34±10.13c

3.4 大鼠血清氧化應(yīng)激指標(biāo)水平的比較

與健康組比較，模型組血清MDA 水平升高、SOD 活性降低（P＜0.05）；與模型組比較，燈盞花素低劑量組、燈盞花素高劑量組血清MDA 水平降低，SOD 活性升高，燈盞花素高劑量組的變化更顯著（P＜0.05）。見表4。

表4 各組大鼠血清氧化應(yīng)激指標(biāo)MDA、SOD 活性的比較 （n=10，±s）Tab.4 Comparison of serum oxidative stress indexes MDA and SOD activity in each group (n=10,±s)

表4 各組大鼠血清氧化應(yīng)激指標(biāo)MDA、SOD 活性的比較 （n=10，±s）Tab.4 Comparison of serum oxidative stress indexes MDA and SOD activity in each group (n=10,±s)

注：與健康組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與燈盞花素低劑量組比較，cP＜0.05。

組別健康組模型組燈盞花素低劑量組燈盞花素高劑量組MDA/（nmol·mL-1）0.40±0.05 2.30±0.32a 1.43±0.13b 0.68±0.08c SOD/（U·mL-1）93.19±9.88 55.88±6.58a 58.48±8.18b 73.30±7.62c

3.5 大鼠血清炎性因子水平的比較

與健康組比較，模型組血清TNF-α、IL-1β水平升高（P＜0.05）；與模型組比較，燈盞花素低劑量組、燈盞花素高劑量組血清TNF-α、IL-1β水平降低，燈盞花素高劑量組的變化更顯著（P＜0.05）。見表5。

表5 各組大鼠血清炎性因子TNF-α、IL-1β 水平的比較 （n=10，±s）Tab.5 Comparison of the levels of serum inflammatory factors TNF-α and IL-1β in each group of rats (n=10,±s)

表5 各組大鼠血清炎性因子TNF-α、IL-1β 水平的比較 （n=10，±s）Tab.5 Comparison of the levels of serum inflammatory factors TNF-α and IL-1β in each group of rats (n=10,±s)

注：與健康組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與燈盞花素低劑量組比較，cP＜0.05。

組別健康組模型組燈盞花素低劑量組燈盞花素高劑量組TNF-α/（ng·L-1）55.64±4.68 99.71±6.92a 84.54±9.90b 69.27±7.98c IL-1β/（ng·L-1）14.28±1.58 62.61±7.61a 41.81±4.98b 29.80±2.94c

3.6 大鼠心肌組織的病理變化

HE 染色結(jié)果顯示，健康組心肌細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)完整，邊界清晰可見；模型組心肌細(xì)胞腫脹變形，細(xì)胞核溶解深染，心肌結(jié)構(gòu)斷裂，界限不清，可見大量炎性細(xì)胞浸潤；燈盞花素低劑量組、燈盞花素高劑量組心肌細(xì)胞水腫減輕，細(xì)胞核溶解減少，細(xì)胞排列較松散但邊界可見，燈盞花素高劑量組的變化更顯著。見圖1。

圖1 HE 染色觀察心肌組織病理變化（×400）Fig.1 The pathological changes of myocardial tissue observed by HE staining (×400)

3.7 大鼠心肌組織IL-23、IL-17 蛋白表達(dá)水平的比較

與健康組比較，模型組心肌組織IL-23、IL-17 蛋白的表達(dá)水平升高（P＜0.05）；與模型組比較，燈盞花素低劑量組、燈盞花素高劑量組心肌組織IL-23、IL-17 蛋白的表達(dá)水平降低，燈盞花素高劑量組降低更顯著（P＜0.05）。見表6、圖2。

圖2 Western blotting 檢測(cè)心肌組織IL-23、IL-17 蛋白的表達(dá)水平Fig.2 Western blotting method to detect the protein expression of IL-23 and IL-17 in myocardial tissue

表6 各組大鼠心肌組織IL-23、IL-17 蛋白表達(dá)水平的比較（n=10，±s）Tab.6 Comparison of IL-23 and IL-17 protein expression in myocardial tissue of rats in each group (n=10,±s)

表6 各組大鼠心肌組織IL-23、IL-17 蛋白表達(dá)水平的比較（n=10，±s）Tab.6 Comparison of IL-23 and IL-17 protein expression in myocardial tissue of rats in each group (n=10,±s)

注：與健康組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與燈盞花素低劑量組比較，cP＜0.05。

組別健康組模型組燈盞花素低劑量組燈盞花素高劑量組IL-23 0.12±0.01 0.88±0.10a 0.41±0.05b 0.22±0.02c IL-17 0.14±0.01 0.72±0.10a 0.31±0.03b 0.24±0.03c

4 討論

MIRI 指心肌缺血一段時(shí)間后恢復(fù)血供，缺血心肌組織反而產(chǎn)生更嚴(yán)重?fù)p傷的病理過程，心肌超微結(jié)構(gòu)在缺血期損傷后進(jìn)一步變化，表現(xiàn)為心肌肌原纖維膜攣縮破裂，線粒體嵴斷裂、溶解［7］。再灌注治療后冠狀動(dòng)脈疏通，梗死區(qū)血氧供給恢復(fù)，缺血期引發(fā)的損傷性變化更為突出，可造成肌張力及血壓驟降、電解質(zhì)紊亂、電生理異常，導(dǎo)致心肌頓抑、心律失常［8-9］。

MIRI 發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，多認(rèn)為是氧化應(yīng)激損傷、細(xì)胞內(nèi)鈣離子超載、炎癥反應(yīng)爆發(fā)及細(xì)胞凋亡、自噬等多種因素相互作用的結(jié)果，其中過度的炎癥反應(yīng)被認(rèn)為是其發(fā)病的重要機(jī)制之一［10］。MIRI 發(fā)生后大量中性粒細(xì)胞活化，產(chǎn)生呼吸爆發(fā)，過量氧自由基損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞，吸附免疫細(xì)胞并刺激其釋放炎性介質(zhì)，促進(jìn)中性粒細(xì)胞浸潤，進(jìn)一步強(qiáng)化炎癥反應(yīng)，加劇心肌組織損傷［11］。因此，尋找高效安全、抑制心肌組織免疫及炎癥反應(yīng)的新治療藥物或方式對(duì)改善MIRI 患者的預(yù)后意義重大。

CK-MB 主要存在于心肌組織，當(dāng)心肌缺血發(fā)生后，其血清含量顯著升高，其是機(jī)體重要的心肌損傷指標(biāo)，cTnT 是心肌細(xì)胞內(nèi)特異性蛋白，當(dāng)心肌細(xì)胞損傷后，其可迅速進(jìn)入血液循環(huán)，高特異性地反映心肌損傷程度［12-13］。燈盞花素是中藥燈盞細(xì)辛的主要活性物質(zhì)，作為一種天然植物黃酮，可抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞過氧化損傷，減緩血小板凝聚，改善血液微循環(huán)［14］。有研究表明［15-16］，燈盞花素可抑制心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)及細(xì)胞凋亡，減輕LPS 誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷，表明其可作為心肌損傷潛在治療藥物。本研究結(jié)果顯示，與模型組比較，燈盞花素低劑量組、燈盞花素高劑量組大鼠VF、VT 發(fā)生次數(shù)減少，心肌梗死面積占比減少，血清CK-MB、cTnT 活性降低，MDA、TNF-α、IL-1β水平降低，VF、VT 持續(xù)時(shí)間縮短，血清SOD 活性升高，表明燈盞花素可緩解心律失常、減輕心肌損傷及氧化應(yīng)激反應(yīng)、炎癥反應(yīng)。

IL-23/IL-17 軸是新發(fā)現(xiàn)的一條免疫炎癥軸，在多種炎性及自身免疫性疾病發(fā)生和發(fā)展過程中扮演重要角色，IL-23、IL-17 是該軸的重要調(diào)控因子［17-18］。其由IL-23 p19、IL-12 p50 2 個(gè)亞單位結(jié)合而成，以異二聚體形態(tài)發(fā)揮生物學(xué)作用，其與受體相互作用，激活下游JAK/STAT 通路，同時(shí)可誘導(dǎo)初始CD4+T細(xì)胞分化為Th17 細(xì)胞，IL-23 與STAT3 共同作用促使其分泌促炎因子IL-17，IL-17 又促進(jìn)前炎癥因子TNF-α、IL-1β及多種趨化因子的分泌，進(jìn)一步加重機(jī)體炎癥反應(yīng)，損害心肌組織［19］。GEHA M 等［20］研究認(rèn)為，抑制IL-23/IL-17 軸活性可減輕小鼠炎癥反應(yīng)及中性粒細(xì)胞浸潤，治療夾閉腸系膜上動(dòng)脈誘發(fā)的小腸缺血再灌注損傷，表明IL-23/IL-17 軸在缺血再灌注損傷中的重要作用。本研究結(jié)果顯示，與健康組比較，模型組心肌組織IL-23、IL-17 蛋白表達(dá)水平升高，經(jīng)燈盞花素干預(yù)后兩者的水平均降低，且表現(xiàn)為劑量依賴，表明IL-23/IL-17 軸在MIRI中處于異常激活狀態(tài)，而燈盞花素可能通過抑制該軸活性保護(hù)MIRI 大鼠的心肌。

綜上所述，燈盞花素可緩解MIRI 大鼠心律失常、減輕心肌損傷及氧化應(yīng)激反應(yīng)、炎癥反應(yīng)，推測(cè)其作用機(jī)制可能與抑制IL-23/IL-17 軸的活性有關(guān)。