川芎嗪基于KDM2B 調控卵巢癌細胞順鉑耐藥的機制

蔡月紅,麥 燕,錢沁佳

三亞中心醫院婦產科，三亞 572000

卵巢癌可分為上皮、間質和生殖細胞腫瘤3 大類型。其中上皮型卵巢癌是最致命的卵巢癌，占所有病例報告的85%［1］。順鉑（cisplatin，DDP）是用于治療上皮型卵巢癌的一線藥物［2］，但是，在晚期上皮型卵巢癌患者中常出現DDP 耐藥性，并預示預后不良［3］。

賴氨酸特異性去甲基化酶2B（lysine-specific demethylase 2B，KDM2B）是含JmjC 結構域的組蛋白去甲基化酶家族的成員［4-5］，KDM2B 通過H3K36me2和H3K4me3 調控基因轉錄［6］。KDM2B 的異常表達會抑制抑癌基因并促進癌基因表達，從而導致細胞生長失控、腫瘤發生［7-8］。

川芎嗪可通過誘導細胞凋亡在體內和體外抑制腫瘤轉移和血管生成［9］。本研究檢測了KDM2B 在DDP 耐藥卵巢癌細胞中的表達水平，并研究了川芎嗪在DDP 耐藥細胞中的潛在作用機制。

1 儀器與材料

1.1 儀器

BIONEER Exicycler 96 熒光定量PCR 儀（韓國Bioneer 公司）；SynergyTM4 酶標儀（美國BioTek 公司）；Epics XL 流式細胞儀（美國Beckman Coulter 公司）；FACSort 流式細胞儀系統（美國FACSCanto Ⅱ公司）。

1.2 試藥

川芎嗪（質量分數≥98%，南京景竹生物科技有限公司）；DMEM-F12 培養基、胎牛血清均購自美國Sigma-Aldrich 公司；順鉑（DDP，大連美倫生物科技有限公司）；siRNA 序列（上海生工生物工程股份有限公司）；Lipofectamine 2000 試劑盒（美國英杰生命技術有限公司）；Invitrogen TRIzol（美國Thermo Fisher Scientific 公司）；Super M-MLV 反轉錄酶（北京百泰克生物技術有限公司）；Annexin V-FITC/PI 雙染色法試劑盒（北京索萊寶科技有限公司）；RIPA 裂解緩沖液、二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）法蛋白質測定試劑盒均購自上海碧云天生物技術有限公司；BCL2-相關X 蛋白（BCL2-associated X protein，Bax）、半胱氨酸蛋白酶-3（caspase-3）、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）均購自美國Abcam 公司。

1.3 細胞

卵巢癌細胞系A2780（武漢普諾賽生命科技有限公司）：B 淋巴細胞瘤-2（B-cell lymphoma-2，BCL-2美國Abcam 公司）。

2 方法

2.1 預處理方法

在含有體積分數10%胎牛血清的DMEM-F12培養基中培養A2780，并在37 ℃、體積分數為5%的二氧化碳環境下維持。A2780 的耐藥株通過終濃度為8 nmol·L-1的DDP 處理12 周構建。

將耐藥細胞接種到4 個6 孔板中，分為對照組、陰性對照組、干擾組和川芎嗪組。 根據Lipofectamine 2000 試劑轉染說明，干擾組和陰性對照組分別用si-KDM2B 和si-NC（一種非靶向siRNA）進行轉染。 轉染序列如下：si-KDM2B 序列為5'-CCCTGTGGAAATATCTGTCAT-3'。 川芎嗪組給予終濃度為5 nmol·L-1川芎嗪培養（培養基溶解）細胞［10］。對照組給予相同體積的培養基培養。每組細胞培養48 h 后，收集耐藥細胞，進行下一步分析。

2.2 實時熒光定量聚合酶鏈反應（real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction，qRTPCR）

用Invitrogen TRIzol 從細胞中提取總RNA，用Super M-MLV 逆轉錄酶試劑盒合成cDNA。qRTPCR 反應在20 μL 的混合體系中進行，該體系包含cDNA 1 μL、 10 nmol·L-1前/后引物0.5 μL、 SYBR Green 0.3 μL 和 2×Power Taq PCR 10 μL，用Exicycler 96 Real-Time 熒光定量PCR 儀進行PCR 擴增。通過2-ΔΔCT法收集和分析數據。用于PCR 的引物序列如下：KDM2B 前引物5'-CTCACTGCTGTT GGCACCAC-3'，后引物5'-TGCTTGCAGTACCTCAGGTCAATA-3'；GAPDH 前引物5'-GCAACTAGGATGGTGTGGCT-3'，后引物5'-TCCCATTCCCCAGCTCTCATA-3'。

2.3 噻唑藍（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）法

將細胞（每孔5×103個細胞）接種在96 孔板法中。每組加入不同濃度（0、5、10、20、40、80 nmol·L-1）的DDP。37 ℃孵育48 h。用含有MTT（0.5 g·L-1）的新培養基替換，將培養皿在37 ℃、體積分數為5% 的CO2下孵育4.5 h，小心取出培養液，每孔加入150 μL 二甲基亞砜（DMSO），使生成的甲臜結晶完全溶解。用酶標儀在570 nm 波長處測定吸光度（A）值。

2.4 細胞凋亡率的檢測

用Annexin V/FITC 和PI 細胞凋亡檢測試劑盒檢測細胞凋亡率。根據試劑盒說明書將收集的細胞輕輕重懸在500 μL 結合緩沖液中，將細胞與Annexin V-FITC 5 μL 和PI 5 μL 一起避光孵育10 min。通過流式細胞儀分析細胞。

2.5 蛋白印跡法（Western blotting）

用RIPA 裂解緩沖液裂解細胞獲得總蛋白。用BCA 蛋白質測定試劑盒測定蛋白質量濃度。蛋白質樣品（30 μg）進行SDS-PAGE，轉移到PVDF 膜，并用50 g·L-1的脫脂牛奶封閉。孵育BCl-2、Bax、caspase-3 和GAPDH 抗體并在4 ℃下過夜，在37 ℃孵育辣根過氧化物酶偶聯的山羊抗兔或抗鼠二抗45 min。 用電化學發光（electrochemiluminescence，ECL）法顯影，用Image J 軟件分析條帶灰度值，以目的蛋白與內參GAPDH 灰度比值表示目的蛋白的相對表達水平。

2.6 統計學方法

實驗至少進行3 次獨立實驗。用SPSS 24.0 統計軟件對實驗數據進行統計學分析，計量資料以（±s）表示，兩組間比較用t檢驗，多組間比較用單因素方差分析，進一步兩兩間比較用LSD-t檢驗，P＜0.05 為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 KDM2B 在A2780/DDP 的表達水平

用DDP（8 nmol·L-1）處理A2780 細胞12 周構建A2780/DDP。用MTT 法測定A2780 和A2780/DDP 的A值，見表1。結果顯示，A2780/DDP 表現出顯著增強DDP 的耐藥性（P＜0.05）。A2780 的IC50值從（6.55±0.92）nmol · L-1顯著增加到（58.35±6.77）nmol·L-1（P＜0.05）。此外，通過qRT-PCR 檢測 KDM2B 在 A2780 和 A2780/DDP 中的表達水平，A2780/DDP 中表達水平為（2.24±0.07），顯著高于A2780 中的（1.00±0.06）（P＜0.05）。結果表明，KDM2B 的表達水平可能與卵巢癌細胞DDP 耐藥的發展有關。

表1 A2780 與A2780/DDP A 值的比較 (±s, n=3)Tab.1 Comparison of the A values between A2780 and A2780/DDP (±s,n=3)

表1 A2780 與A2780/DDP A 值的比較 (±s, n=3)Tab.1 Comparison of the A values between A2780 and A2780/DDP (±s,n=3)

注：與濃度0 比較，*P＜0.05。

濃度/（nmol·L-1）0 5 10 20 40 80 F P A2780/（nmol·L-1）1.05±0.07 0.63±0.07 0.43±0.08 0.38±0.06 0.31±0.05 0.26±0.02 A2780/DDP/（nmol·L-1）0.95±0.10*0.85±0.05*0.65±0.03*0.64±0.02*0.57±0.03*0.52±0.04*263.215＜0.001

3.2 KDM2B 抑制耐藥細胞增殖的結果

用5 nmol·L-1的川芎嗪（培養基作為溶媒）處理A2780/DDP 48 h，另外用si-KDM2B 或陰性對照（si-NC）轉染A2780/DDP 細胞，在48 h 后收取細胞。用qRT-PCR 檢測每組KDM2B 的表達水平。與對照組和陰性對照組比較，川芎嗪組和干擾組中A2780/DDP 細胞KDM2B 的相對表達水平顯著降低（P＜0.05）。用MTT 實驗檢測每組細胞的增殖差異，川芎嗪組和干擾組都顯著抑制了A2780/DDP 的細胞增殖（P＜0.05）。見表2。

表2 各組細胞KDM2B 表達水平和A 值的比較 (±s, n=3)Tab.2 Comparison of KDM2B expression and A value among groups (±s,n=3)

表2 各組細胞KDM2B 表達水平和A 值的比較 (±s, n=3)Tab.2 Comparison of KDM2B expression and A value among groups (±s,n=3)

注：與對照組比較，#P＜0.05；與陰性對照組比較，*P＜0.05。

項目對照組陰性對照組干擾組川芎嗪組F P KDM2B 蛋白表達水平1.00±0.12 0.94±0.07 0.51±0.06*0.68±0.01#27.283＜0.001 A 值1.10±0.06 0.93±0.07 0.78±0.08*0.68±0.06#21.768＜0.001

3.3 KDM2B 調控細胞凋亡的結果

流式細胞術結果分析表明，分別與對照組和陰性對照組比較，用川芎嗪處理或敲減KDM2B 后，A2780/DDP 中細胞凋亡率顯著上升（P＜0.05），見圖1、表3。

圖1 各組細胞凋亡差異的比較Fig.1 Comparison of differences in apoptosis among groups

表3 各組細胞凋亡差異的比較 (±s,n=3)Tab.3 Comparison of differences in apoptosis among groups(±s,n=3)

表3 各組細胞凋亡差異的比較 (±s,n=3)Tab.3 Comparison of differences in apoptosis among groups(±s,n=3)

注：與比照組比較，#P＜0.005；與陰性對照組比較，*P＜0.005。

項目對照組陰性對照組干擾組川芎嗪組FP細胞凋亡率38.15%±4.12%41.62%±3.15%75.63%±5.12%*72.31%±4.13%#66.886＜0.001

3.4 KDM2B 調控凋亡相關蛋白的表達水平

Western blotingt 分析結果顯示，分別與對照組和陰性對照組比較，用川芎嗪處理或者敲減KDM2B后，A2780/DDP 中BCl2 的蛋白水平顯著降低（P＜0.05），而Bax、caspase-3 的蛋白表達水平顯著升高（P＜0.05），見圖2、表4。

圖2 各組凋亡相關蛋白表達水平的比較Fig.2 Comparison of the expression levels of apoptosis-related proteins in each group

表4 各組細胞中BCl2、Bax 和caspase-3 蛋白水平的比較(±s, n=3)Tab.4 Comparison of BCl2, Bax and caspase-3 protein levels among groups (±s,n=3)

表4 各組細胞中BCl2、Bax 和caspase-3 蛋白水平的比較(±s, n=3)Tab.4 Comparison of BCl2, Bax and caspase-3 protein levels among groups (±s,n=3)

注：與對照組比較，#P＜0.05；與陰性對照組比較，*P＜0.05。

項目對照組陰性對照組干擾組川芎嗪組FP BCl2 2.34±0.15 2.24±0.14 0.91±0.12*1.01±0.15#90.071＜0.001 Bax 1.15±0.07 1.12±0.09 2.65±0.07*2.59±0.06#410.693＜0.001 caspase-3 1.17±0.08 1.59±0.07 2.93±0.05*2.80±0.06#482.068＜0.001

4 討論

近期有研究表明KDM2B 以JmjC 依賴性方式調控基因表達，可能參與腫瘤發生，在小鼠胚胎成纖維細胞中過表達可促進細胞增殖并抑制細胞凋亡，從而導致正常細胞的永生化［11-12］。KDM2B 可在癌癥干細胞中過表達并表現出致癌作用［13-14］。在KUANG Y 等［15］的研究中，KDM2B 在正常卵巢組織、良性腫瘤、交界性腫瘤和卵巢癌中的表達水平逐漸升高，并與組織學類型、腫瘤分級、FIGO 分期和淋巴結轉移密切相關。用慢病毒載體沉默KDM2B 基因在體外和體內抑制卵巢癌細胞的增殖和遷移。因此，將KDM2B 作為卵巢癌細胞的分子靶點進行研究。在本研究中，選擇A2780 人卵巢癌細胞，通過DDP 誘導其成為A2780/DDP 耐藥細胞株，并發現KDM2B 高表達，通過RNAi 技術干擾KDM2B 在A2780/DDP 中的表達水平，隨后檢測了其細胞生物學功能，發現KDM2B 被敲減后，可以明顯抑制細胞增殖、促進細胞凋亡。

川芎嗪是中藥川芎的主要生物活性成分，已廣泛應用于心腦血管疾病的治療［16-17］。研究還表明川芎嗪對黑色素瘤有抗癌活性，可抑制腫瘤血管生成和轉移［18］。在川芎嗪處理的細胞中觀察到腫瘤細胞凋亡增加，尤其是多藥耐藥惡性細胞［19-21］。川芎嗪可增加細胞內活性氧的積累，增加腫瘤細胞的凋亡率［22］。本研究表明川芎嗪可下調A2780/DDP 中KDM2B 的表達水平，從而表現出抑制細胞增殖、促進細胞凋亡的生物學作用。

綜上所述，本研究初步發現中藥單體川芎嗪可促進人卵巢癌耐藥細胞株A2780/DDP 細胞增殖和細胞凋亡，其可能通過抑制KDM2B 的表達，從而下調凋亡抑制蛋白BCl-2、上調Bax 和caspase-3。