三七總皂苷對腦缺血再灌注的保護作用研究

祝燕平，高 磊，劉亞芳，祝凌麗，周 蘭

（安慶醫(yī)藥高等專科學(xué)校藥學(xué)院，安慶 246003）

血腦屏障（blood–brain barrier，BBB）是血液和大腦之間的一種獨特的選擇性屏障，在維持中樞神經(jīng)系統(tǒng)穩(wěn)定狀態(tài)方面發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[1]。當(dāng)血腦屏障遭到破壞，腦損傷進一步惡化，顯著提高了出血乃至死亡的風(fēng)險[2-3]。腦缺血再灌注損傷（cerebral ischemia reperfusion injury，CIRI）是由缺氧和缺血引起的神經(jīng)損傷，涉及多種病理生理過程，如氧化應(yīng)激、鈣超載、毒性損傷等[4]。眾所周知，轉(zhuǎn)錄因子NF-E2相關(guān)因子（nuclear factor erytroid 2-releated factor 2，Nrf2）是細胞抗氧化應(yīng)激反應(yīng)的重要調(diào)節(jié)因子[5]。此外，研究證明，Nrf2通路是對抗氧化應(yīng)激介導(dǎo)疾病的有效靶點[6]。

總皂苷（panax notoginseng saponins，PNS）是從三七根中提取的主要活性化合物，具有減小腦梗死體積、抗氧化、抑制血小板聚集等藥理作用[7-8]。PNS的作用在很多疾病中得到廣泛研究，如PNS通過脂質(zhì)代謝調(diào)節(jié)對糖尿病、心肌病的保護作用[9]。LI等[10]發(fā)現(xiàn)，PNS可通過抑制IDO1介導(dǎo)的免疫調(diào)節(jié)預(yù)防結(jié)腸炎相關(guān)的大腸癌。經(jīng)證實PNS在預(yù)防和治療腦缺血再灌注損傷方面具有一定的臨床意義[11]。HU等[12]發(fā)現(xiàn)PNS可激活OGD/R誘導(dǎo)的bEnd.3中的Nrf2通路。綜上所述，本研究旨在探索PNS在腦缺血再灌注損傷中的作用機制。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試材料 小鼠腦微血管內(nèi)皮細胞bEnd.3，購于武漢普諾賽生命科技有限公司。

1.1.2 供試試劑 DMEM培養(yǎng)液、胎牛血清和青霉素-鏈霉素，均購于美國Gibco公司；CCK-8試劑盒、BCA蛋白濃度測定試劑盒、LDH試劑盒，購于碧云天生物技術(shù)有限公司；RIPA蛋白裂解液，購于索萊寶科技有限公司；ZO-1（cat.no.ab276131，1∶1 000）、claudin-5（cat.no.ab131259，1∶1 000）、occludin（cat.no.ab216327，1∶1 000）、PPARα（cat.no.ab272718，1∶1 000）、Nrf2（cat.no.16396-1-AP，1∶5 000）、HO-1（cat.no.ab52947，1∶2 000），6種抗體均購于武漢三鷹生物技術(shù)有限公司；山羊抗兔IgG H&L（cat.no.ab6721，1∶2 000），購于Abcam。

1.2 試驗方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 將bEnd.3細胞在10%胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）的DMEM培養(yǎng)基中，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，當(dāng)細胞貼壁生長至匯合度70%～80%時進行試驗。

1.2.2 細胞模型建立及分組給藥 為建立缺血再灌注損傷模型，用氧糖剝奪/復(fù)氧（oxygen-glucose deprivation/re-oxygenation，OGD/R）方式誘導(dǎo)bEnd.3細胞。用不含葡萄糖的DMEM培養(yǎng)基代替正常培養(yǎng)基，將細胞置于37 ℃、95% N2、5% CO2、1% O2的厭氧室中缺氧6 h。然后換為不含葡萄糖的DMEM培養(yǎng)基，置于37 ℃、78% O2、5% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)12 h。細胞隨機分為對照組、OGD/R模型組、低劑量PNS組（OGD/R+PNS 200 μg/mL）、中劑量PNS組（OGD/R+PNS 300 μg/mL）、高劑量PNS組（OGD/R+PNS 400 μg/mL）。對照組不做處理，正常培養(yǎng)，其余各組細胞均缺氧缺糖處理6 h，再復(fù)氧12 h建立OGD/R細胞模型。各給藥組均需在造模前分別加藥孵育2 h。

1.2.3 CCK-8試驗 采用CCK-8測定細胞活性。取對數(shù)生長期bEnd.3細胞，按照3×104個/孔的密度接種于96孔板中，并如1.2.2進行處理。每孔中滴入15 μL CCK-8溶液避光孵育2 h后，使用酶標儀于450 nm處測量每孔的吸光度，重復(fù)2次。

1.2.4 LDH檢測試驗 取對數(shù)生長期細胞，按照1×105個/孔的密度接種于6孔板中，并如1.2.2進行處理。取細胞培養(yǎng)液上清液，根據(jù)LDH細胞檢測試劑盒說明進行后續(xù)測定。使用酶標儀于450 nm處測量每孔的吸光度，重復(fù)2次。

1.2.5 蛋白印跡試驗 取對數(shù)生長期細胞，按照1×105個/孔的密度接種于6孔板中，并如1.2.2進行處理。采用RIPA裂解緩沖液提取bEnd.3細胞中總蛋白，BCA試劑盒測定蛋白濃度。蛋白煮沸變性后，取20 μg蛋白樣品進行電泳分離，并轉(zhuǎn)到PVDF膜上。使用5% BSA室溫封閉2 h后，將膜與一抗4 ℃過夜孵育。第二日將膜和二抗室溫孵育1 h。最后使用ECL試劑盒對蛋白進行顯影拍照，Image J分析軟件對蛋白條帶進行灰度值計算，重復(fù)2次。

1.2.6 劃痕試驗 取對數(shù)生長期細胞，按照5×105個/孔的密度接種于6孔板中，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，并如1.2.2進行處理。待細胞融合均達到90%時，使用滅菌后的吸頭在設(shè)定好的軌跡上劃線[13]，PBS清洗掉落的細胞并對其進行拍照，將培養(yǎng)皿放在培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)24 h，再次對相同位置進行拍照，重復(fù)2次。

1.2.7 侵襲試驗 取對數(shù)生長期細胞，接種于用Matrigel基質(zhì)膠預(yù)處理的小室上室（1×105個/孔），將600 μL含10% FBS的培養(yǎng)基加入下室，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h[14]。使用4%多聚甲醛固定細胞20 min，0.1%結(jié)晶紫染液染色10 min。在顯微鏡下觀察侵襲的細胞數(shù)，重復(fù)2次。

1.2.8 小管形成試驗 通過在Matrigel基質(zhì)膠上培養(yǎng)bEnd.3細胞評估內(nèi)皮小管形成。取對數(shù)生長期細胞，按照5×103個/孔的密度接種于冷基質(zhì)凝膠膜預(yù)處理的24孔板中，37 ℃培養(yǎng)72 h。使用Image J分析軟件隨機對10個區(qū)域進行成像和分析，以量化管腔形成數(shù)量。

1.3 數(shù)據(jù)分析

試驗數(shù)據(jù)以均值±標準差表示，采用GraphPad Prism 8.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析，多組間比較采用單因素方差分析，并使用Tukey檢驗方法進行檢驗。P<0.05表明數(shù)據(jù)具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 PNS對OGD/R誘導(dǎo)的腦內(nèi)皮細胞bEnd.3活性和屏障損傷的影響

CCK-8試驗和LDH試劑盒檢測PNS處理的bEnd.3細胞活性和細胞損傷。細胞上清液中LDH活性與細胞損傷密切相關(guān)。由圖1A可知，與對照組相比，模型組bEnd.3細胞活性極顯著降低。由圖1B可知，與對照組相比，LDH活性顯著增加。經(jīng)過PNS處理后，bEnd.3細胞活性顯著增加，LDH活性顯著降低，且具有濃度依賴性，當(dāng)PNS濃度為400 μg/mL時，LDH活性呈極顯著下降的趨勢。由圖1C、圖1D、圖1F可知，與對照組相比，模型組中ZO-1、claudin-5、occludin呈極顯著下降的趨勢。PNS處理后，當(dāng)PNS濃度為200 μg/mL時，ZO-1、claudin-5、occludin表達顯著增加；當(dāng)PNS濃度為300 μg/mL和400 μg/mL時，ZO-1、claudin-5、occludin表達極顯著增加。

圖1 PNS對OGD/R誘導(dǎo)的腦內(nèi)皮細胞bEnd.3活性和屏障損傷的影響

2.2 PNS對OGD/R誘導(dǎo)的腦內(nèi)皮細胞bEnd.3遷移和侵襲及血管生成的影響

由圖2A、圖2B可知，與對照組相比，模型組中劃痕寬度極顯著增加，細胞侵襲數(shù)目極顯著降低，說明細胞遷移和侵襲能力極顯著降低。PNS處理后，劃痕寬度極顯著降低，細胞侵襲數(shù)目極顯著增加，說明細胞遷移和侵襲能力極顯著增強，細胞遷移和侵襲能力的增強呈PNS濃度依賴型。由圖2C可知，與對照組相比，模型組中細胞形成的管腔數(shù)量極顯著降低，PNS處理后，細胞形成的管腔數(shù)量極顯著增加。

圖2 PNS對OGD/R誘導(dǎo)的腦內(nèi)皮細胞bEnd.3遷移和侵襲及血管生成受損的影響

2.3 PNS對OGD/R誘導(dǎo)的腦內(nèi)皮細胞bEnd.3細胞中PPARα/Nrf2信號表達的影響

蛋白印跡試驗檢測PNS對bEnd.3細胞中PPARα、Nrf2、HO-1信號相關(guān)蛋白表達的影響。由圖3可知，與對照組相比，模型組中PPARα、Nrf2、HO-1表達極顯著降低。PNS處理后，PPARα、Nrf2、HO-1蛋白表達極顯著增加。然而，在PNS處理基礎(chǔ)上，加入PPARα抑制劑后，細胞中PPARα、Nrf2、HO-1表達極顯著降低。

圖3 PNS對OGD/R誘導(dǎo)的腦內(nèi)皮細胞bEnd.3細胞中PPARα/Nrf2信號表達的影響

3 討論

本研究從內(nèi)皮細胞活性損傷、內(nèi)皮屏障損傷、內(nèi)皮細胞侵襲和遷移及血管生成損傷角度出發(fā)，研究了PNS對OGD/R誘導(dǎo)bEnd.3細胞的影響，發(fā)現(xiàn)PNS通過激活PPARα/Nrf2信號減輕OGD/R誘導(dǎo)的內(nèi)皮細胞活性損傷、內(nèi)皮屏障損傷、內(nèi)皮細胞侵襲和遷移及血管生成損傷。

OGD/R會導(dǎo)致內(nèi)皮細胞的各種損傷，包括細胞活力受損[15-16]。研究表明，PNS處理對細胞活性具有促進作用，本研究發(fā)現(xiàn)，OGD/R誘導(dǎo)顯著降低了bEnd.3細胞活性，經(jīng)過不同濃度的PNS處理后，OGD/R誘導(dǎo)的bEnd.3細胞活性逐漸升高。然而bEnd.3細胞中，OGD/R誘導(dǎo)的LDH高表達經(jīng)過PNS處理后顯著降低。

改善血腦屏障損傷對于減輕缺血再灌注損傷具有重要意義[17]。bEnd.3細胞具有腦微血管內(nèi)皮細胞的屏障特性[18]。毛細血管內(nèi)皮細胞之間的緊密連接（tight-junction，TJ）是血腦屏障結(jié)構(gòu)和功能的基礎(chǔ)[19]。緊密連接蛋白包括claudin 5、occludin和ZO-1，是血腦屏障滲透性特性的關(guān)鍵決定因子[20]。本研究發(fā)現(xiàn)，OGD/R顯著降低了claudin 5、occludin和ZO-1表達水平，這與LI等[21]研究結(jié)果一致。經(jīng)過PNS處理后，claudin 5、occludin和ZO-1表達水平逐漸增加。

內(nèi)皮細胞對維持血腦屏障完整性具有重要意義[22]。大量研究表明，PNS可調(diào)節(jié)內(nèi)皮細胞功能。此外，研究還發(fā)現(xiàn)PNS通過誘導(dǎo)內(nèi)皮細胞遷移和管腔形成數(shù)量發(fā)揮其對急性心肌梗塞的保護作用[23]。本研究發(fā)現(xiàn)，PNS處理促進了OGD/R誘導(dǎo)的bEnd.3細胞遷移和侵襲及管腔形成數(shù)量的能力。

氧化應(yīng)激是導(dǎo)致腦屏障損壞的主要病理過程[24]。研究表明，Nrf2是細胞抗氧化應(yīng)激反應(yīng)的重要調(diào)節(jié)因子[5]。Nrf2通路認為是對抗氧化應(yīng)激介導(dǎo)疾病的有效靶點[6]。此外，研究還發(fā)現(xiàn)，PPARα通路的激活有助于抑制氧化應(yīng)激[25]。本研究借助蛋白印跡法測定PPARα、Nrf2、HO-1表達，發(fā)現(xiàn)PNS顯著提高OGD/R誘導(dǎo)的bEnd.3細胞中PPARα、Nrf2、HO-1表達，表明PNS可激活OGD/R誘導(dǎo)的腦內(nèi)皮細胞bEnd.3細胞中PPARα/NRF2信號。綜上所述，PNS可減輕OGD/R誘導(dǎo)的內(nèi)皮細胞屏障和功能損傷并激活PPARα/NRF2信號，這一結(jié)論豐富了腦缺血再灌注損傷的藥物機制。