基質輔助激光解吸電離-飛行時間質譜法定性分析啤酒中的β-葡聚糖

化敬言

（廈門大學，福建 廈門 361005）

1 前言

啤酒是一種以麥芽、啤酒花、水和酵母為原料，經過液態糊化和糖化，再經過液態發酵釀制而成的酒精飲料。啤酒的歷史可以追溯到美索不達米亞文明，因為其營養價值高、口感好，啤酒已成為世界上消費最多的酒精飲料之一。

在釀造啤酒的過程中，麥芽汁中的淀粉類物質會在淀粉酶的作用下水解，形成葡聚糖和其他副產物。其中，β-葡聚糖是最主要的一種，它是由許多葡萄糖分子通過β-糖苷鍵連接而成的線性高分子。β-葡聚糖對啤酒的質量具有比較突出的影響，包括優化啤酒的口感和泡沫的穩定性與掛杯性等。人體可以輕易地吸收啤酒中的β-葡聚糖，因為β-葡聚糖是一種水溶性多糖，可以很容易地穿過腸道壁，進入血液循環。然而，過量攝入β-葡聚糖可能會導致腸道脹氣、腹瀉、腹痛等不良反應，因此建議適量飲用啤酒。

β-葡聚糖具有多種檢測方法，包括熒光輔助糖電泳法、高效陰離子交換色譜-脈沖安培檢測法等。以上方法均有局限性，且不能檢測聚合度超過7的寡糖。利用基質輔助激光解吸電離-飛行時間質譜法（MALDI-TOF MS），可快速分析啤酒中聚合度大于7的糖類。

MALDI-TOF由離子源（MALDI）和飛行時間質量分析器（TOF）兩部分組成，可以同時測定樣品中的多種成分。實驗時，將微量樣品與過量基質的混合液體點到樣品靶上，經加熱或風吹干形成共結晶后，把樣品靶放入離子源室內。在達到一定真空后，激光照射到靶上的樣品，基質從激光中吸收能量傳遞給樣品分子，樣品分子瞬間汽化。基質的質子轉移給樣品分子使其離子化，然后進入飛行時間質量分析器，根據它們各自的質荷比（m/z）進行檢測，數據處理后得到質譜圖。

離子離開加速區的速度滿足。

其中，m表示離子質量，z表示離子所帶電荷，U表示加速電場電壓。因此，m/z越大的離子飛行的速度越慢，到達檢測器的時間越長。

作為一種重要的質譜分析方法，MALDI-TOF MS在聚合物的表征中起到不可或缺的作用，可用于聚合物的數均和重均分子量的測定、分子量分布、重復單元結構確認、端基確定、雜質及添加物的檢測等。

2 材料與方法

2.1 材料與試劑

2,5-DHB：色譜純，日本TCI公司；三氟乙酸：色譜純，阿拉丁試劑有限公司；雪津啤酒：產于福建省莆田市；乙腈：色譜純，德國Merck公司；醋酸鈉：分析純，國藥集團化學試劑有限公司。

2.2 儀器與設備

Autoflex maX MALDI-TOF MS質譜儀；分析天平：XS205型，美國Mettler-Toledo公司；超純水系統：Milli-Q型，美國Millipore公司；儀器的參數激光源：Nd: YAG激光，采集方法為反射正離子模式。

2.3 樣品的前處理

先用超聲波將啤酒脫氣0.5h，除去啤酒中的氣泡，隨后用超純水對啤酒進行稀釋。

2.4 基質的制備

在100μL乙腈/水溶液（體積比1:1，含0.1%三氟乙酸）中加入1mg2,5-DHB，渦旋均勻，使其溶解，得到10mg·mL-12,5-DHB基質溶液。在乙腈/水溶液（體積比1:1，含0.1%三氟乙酸）溶解醋酸鈉，配制得到濃度為2mg·mL-1醋酸鈉溶液。

2.5 點樣與MALDI-TOF MS分析條件

點樣方式為混合法，即在靶板上，按照順序依次點上1μL基質溶液、1μL待測樣品、1μL醋酸鈉溶液，隨后用移液槍混合均勻，用吹風機豎直吹干。

用分子泵將真空度降低至1.0×10-6mbar以下，根據樣品性質、待測樣品的分子量大小等，選擇合適的模式，即“RP”模式。調整m/z檢測范圍與激光能量，通過累加圖譜等方式，得到合理的圖譜。采樣完畢，打開待分析文件。根據圖譜中的峰值定性分析。

測試完成，打開入口蓋，送出樣品靶，把裝有樣品靶的靶托從樣品靶平臺取出，把樣品靶清洗干凈。取另一塊干凈的靶板，放回儀器樣品靶平臺上，送回儀器內，并選擇方法，使儀器處于待機狀態。

3 結果與分析

3.1 葡聚糖對應峰的尋找

在啤酒中，葡聚糖一般是聚合度不高的二糖或寡糖。不同聚合度的葡聚糖之間會相差n個C6H10O5結構單元，因此，可以尋找一組或多組相對分子質量均相差約為162的化合物。當找到不少于4個峰的時候，可證明該組數據可信。

本實驗中，可觀察到兩組葡聚糖。第一組葡聚糖對應的相對分子質量分別為526.937、689.109、851.185、1013.233、1175.292、1337.3651、1499.340，第二組葡聚糖對應的相對分子質量分別為568.934、731.133、893.1731、1055.224、1217.251。譜圖中（圖1）所有所需的峰對應的m/z已經標出。

圖1 以摻有鈉離子的2, 5-DHB為基質采集到的啤酒稀釋液的MALDI-TOF MS譜圖

3.2 葡聚糖聚合度的分析

不考慮端基時，若葡萄糖發生聚合，二糖的相對分子質量為342，三糖的相對分子質量為504。當葡聚糖存在端基時，其相對分子質量一定大于該聚合度下不存在端基的葡聚糖的相對分子質量。本實驗中，第一組葡聚糖最低、最高相對分子質量分別為526.937與1499.340，其聚合度分布在3～9；第二組葡聚糖最低、最高相對分子質量分別為568.934與1217.251，其聚合度分布在3～7。

4 討論

本實驗條件有限，未選擇各種廠商的啤酒進行測試。同時，若條件允許，可嘗試實驗條件的優化，如改變啤酒稀釋的比例、改變基質的種類與組成以及改變點樣方法等。

實驗時，需要注意各溶液加入的順序，并混合均勻。在其他的某些質譜分析實驗中，可能會采用基質包裹目標物的點靶方法，因此更需要注意溶液加入的順序。值得注意的是，尋找目標物時，m/z較低處的區間內峰的情況較為復雜，可從較大的相對分子質量入手，向下尋找低聚合度的葡聚糖。采集數據時，樣品點邊緣的樣品含量一般較高，且明亮處樣品含量較高。因此，激光發射點應盡量選擇邊緣明亮處。

選擇合適的物質作為基質時，該物質需要具備特性的物理與化學性質，包括但不限于：可吸收激光能量并把能量轉移給分析物，避免過量的能量使分析物裂解；可包埋分析物，避免分析物分子締合導致的質量復雜化；可通過光激發或光離子化作用把質子轉移給分析物，促進分析物分子離子的形成；與待測樣品極性相似、溶解度相近，可以形成良好的共結晶體。若目標物為聚合物，可添加金屬離子作為助離子化劑。不同的樣品中，基質揮發效果不同。使用不同的基質，優化實驗條件，可以改善結晶情況，使樣品均勻分散并有效解吸電離，增強質譜信號，進而提高分析的靈敏度、分辨率和重復性等。

除了本實驗中定性分析β-葡聚糖之外，MALDITOF MS在常規物質檢測，如小分子藥物，以及多肽、細菌等復雜物質檢測方面也有廣泛應用。隨著研究的深入，MALDI-TOF MS在分析檢測中的作用一定會越來越重要。