組蛋白激活晚期糖基化終末產(chǎn)物受體并引發(fā)炎癥反應(yīng)

孫常津,楊巖,劉國玉,2,中西秀樹*

1(江南大學(xué) 生物工程學(xué)院,江蘇 無錫,214122) 2(中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院有限公司,功能主食創(chuàng)制與慢病營養(yǎng)干預(yù)北京市重點實驗室,北京,100015)

晚期糖基化終末產(chǎn)物受體(receptor for advanced glycation end products, RAGE)是免疫球蛋白超家族的一員,最早作為晚期糖基化終末產(chǎn)物(advanced glycation end products, AGEs)的受體被發(fā)現(xiàn),并因此得名[1-2]。RAGE在人體肺臟組織中高表達(dá),在人體內(nèi)皮細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞等多種細(xì)胞中均有表達(dá)[3]。后來研究發(fā)現(xiàn),RAGE能夠非序列特異性地與多種配體結(jié)合,如S100蛋白、淀粉樣蛋白β、高遷移率族蛋白1、DNA、RNA等,是一個模式識別受體。RAGE作為多配體受體,其配體種類多為損傷相關(guān)分子模式分子(damage associated molecular pattern molecules, DAMPs),RAGE與其配體結(jié)合后,能夠激活細(xì)胞的下游信號通路,盡管其確切的生理功能尚不清楚,但有充分的證據(jù)表明RAGE信號通路能夠通過調(diào)控炎癥反應(yīng)以及細(xì)胞凋亡等生理過程參與免疫反應(yīng),進(jìn)而參與多種疾病的疾病進(jìn)程,如糖尿病、癌癥、敗血癥等[4-6]。

在真核細(xì)胞內(nèi),組蛋白作為染色質(zhì)的主要組成蛋白,能夠參與調(diào)控基因的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄及翻譯等多種生理過程;然而胞外組蛋白卻被認(rèn)為是多種疾病不良預(yù)后的生物標(biāo)志物,其在患者體內(nèi)水平的升高會導(dǎo)致急性炎癥反應(yīng)等并發(fā)癥從而加重病情。例如,胞外組蛋白是導(dǎo)致敗血癥患者死亡的主要原因之一[7];胞外組蛋白水平的升高能夠加重腎損傷、促進(jìn)血栓的生成[8-9];除此之外,在腹膜炎、胰腺炎等多種炎癥反應(yīng)中,胞外組蛋白的濃度均有明顯上升[10-12],因此其也被看作是一種內(nèi)源性DAMPs。當(dāng)細(xì)胞受到損傷時,組蛋白會被釋放到胞外,此外,組蛋白還會通過凋亡、壞死細(xì)胞,以及中性粒細(xì)胞胞外殺菌網(wǎng)絡(luò)(neutrophil extracellular traps, NETs)被釋放。有研究表明,組蛋白能夠通過刺激Toll樣受體2、4(TLR2/4)介導(dǎo)疾病過程,但其引發(fā)炎癥反應(yīng)的具體分子機(jī)制目前尚不清楚,對此深入研究能夠幫助人們理解胞外組蛋白誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)的機(jī)制,開發(fā)抗炎癥疾病的治療手段。

先前研究發(fā)現(xiàn)RAGE能夠介導(dǎo)哺乳動物細(xì)胞對組蛋白修飾的微米級顆粒的吞噬[13],然而目前并沒有報道稱組蛋白是RAGE的配體,對RAGE能否直接識別組蛋白,以及該過程能對細(xì)胞產(chǎn)生何種影響尚沒有研究報道。因此,本研究對組蛋白激活RAGE進(jìn)而引發(fā)的細(xì)胞反應(yīng)做了初步探究,為進(jìn)一步研究組蛋白及RAGE相關(guān)的疾病過程提供了理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

HEK293T細(xì)胞是由HEK293細(xì)胞的衍生細(xì)胞而來,含有SV40大T抗原;RAGE-敲除HEK293T細(xì)胞是由HEK293T細(xì)胞敲除RAGE基因而來;RAW264.7細(xì)胞是小鼠單核巨噬細(xì)胞白血病細(xì)胞;RAGE-敲除RAW264.7細(xì)胞是由RAW264.7細(xì)胞敲除RAGE基因所得;實驗細(xì)胞均由實驗室保存。

DMEM培養(yǎng)基、EDTA-胰酶、PBS、組蛋白,生工生物工程(上海)股份有限公司;標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清,美國Hyclone公司;Lyso-Tracker-Red、Calcein AM/PI染色試劑盒、活性氧檢測試劑盒、Avidin-FITC,上海碧云天生物技術(shù)有限公司;生物素,美國默克公司;賴氨酸,國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;ELISA試劑盒,美國eBioScience公司。

1.2 儀器與設(shè)備

DS-Ri2共聚焦熒光顯微鏡,Nikon公司;TY7622振蕩混合器,易擴(kuò)中國有限公司;QB-128旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)器,其林貝爾儀器制造有限公司;HYL-A電熱恒溫?fù)u床、SF-SW-1100生物安全柜,上海三發(fā)科學(xué)儀器有限公司;MX150高速冷凍離心機(jī),日本日立HITACHI公司;Midi 40二氧化碳培養(yǎng)箱、NanoDrop2000分光光度計,賽默飛世爾科技有限公司;Accuri C6流式細(xì)胞儀,美國碧迪醫(yī)療器械有限公司;iMark酶標(biāo)儀,美國伯樂公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 細(xì)胞消化與傳代

待細(xì)胞鋪板率為80%左右(S/S)時,棄上清,用PBS輕輕洗滌細(xì)胞2次(洗去板底殘留蛋白),加入1 mL 胰酶(含EDTA)并輕輕搖動培養(yǎng)皿,使胰酶與細(xì)胞充分接觸。2～3 min后,加入4 mL新鮮培養(yǎng)基終止胰酶消化,用移液槍輕輕吹打,將貼壁細(xì)胞完全吹打混勻后,吸入離心管中,1 400 r/min離心3 min收集細(xì)胞,棄上清液,用5 mL新鮮培養(yǎng)基將白色沉淀吹打混勻,吸取2～2.5 mL接種到37 ℃預(yù)熱的10 mL 培養(yǎng)基中,在37 ℃含5%二氧化碳的培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)。

1.3.2 綠色熒光標(biāo)記的組蛋白、DNA-組蛋白復(fù)合物的制備

稱取1 000 μg組蛋白凍干粉并用1 mL雙蒸水溶解,使終質(zhì)量濃度為1 000 μg/mL,向組蛋白溶液中加入10 μmol生物素,振蕩混勻,避光室溫孵育30 min后,加入8 μmol賴氨酸避光室溫孵育20 min終止反應(yīng)。向組蛋白溶液中加入10 μL Avidin-FITC,避光室溫孵育1 h后,將組蛋白溶液放在4 ℃透析過夜,以去除未與組蛋白結(jié)合的Avidin-FITC。綠色熒光標(biāo)記的DNA-組蛋白復(fù)合物的制備是將200 μL透析后的綠色熒光標(biāo)記的組蛋白與2 nmol 22-nt DNA(序列為5′-GTCGCGTGCCAGATCGGGGTTC-3′)干粉振蕩混勻,在4 ℃轉(zhuǎn)盤結(jié)合1 h以上。

1.3.3 流式細(xì)胞術(shù)分析對組蛋白的內(nèi)化

將HEK293T細(xì)胞接種于12孔板(1 mL),每孔接種約2×105個細(xì)胞,置于37 ℃含5%二氧化碳的培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)24 h,待鋪板率達(dá)到80%(S/S)左右時準(zhǔn)備實驗。將100 μg提前制備的綠色熒光標(biāo)記的(DNA-)組蛋白與細(xì)胞共孵育1 h,孵育結(jié)束后PBS洗滌細(xì)胞1次,用含EDTA的胰酶消化5 min后再用PBS洗滌2次,上機(jī)檢測內(nèi)化效率。

1.3.4 熒光共定位分析

將HEK293T細(xì)胞接種于1.5 mL共聚焦顯微鏡專用培養(yǎng)皿中,待鋪板率達(dá)到80%(S/S)左右時準(zhǔn)備實驗。將綠色熒光標(biāo)記的組蛋白加入到培養(yǎng)皿中,使其終質(zhì)量濃度為100 μg/mL,在37 ℃含5%二氧化碳培養(yǎng)箱中孵育1 h,然后加入0.06 μL Lyso-Tracker-Red,孵育20 min后,更換新鮮培養(yǎng)基,在顯微鏡下觀察、拍攝。

1.3.5 活性氧檢測

將HEK293T細(xì)胞接種于12孔板(1 mL),每孔接種約2×105個細(xì)胞,待鋪板率達(dá)到約80%(S/S)時準(zhǔn)備實驗。按照說明書操作原位裝載探針,具體步驟為用無血清培養(yǎng)基1∶1 000稀釋熒光探針,使其終濃度為10 μmol/L,去除培養(yǎng)基后,每孔加入500 mL稀釋好的熒光探針,37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育30 min,用無血清培養(yǎng)基洗滌3次,以充分去除細(xì)胞外的熒光探針。向12孔板每孔中加入100 μg(DNA-)組蛋白,使實驗組培養(yǎng)基內(nèi)組蛋白質(zhì)量濃度為100 μg/mL,與細(xì)胞共孵育1 h后使用PBS洗滌一次細(xì)胞,隨后用200 μL PBS吹打混勻并收集細(xì)胞,使用流式細(xì)胞儀進(jìn)行綠色熒光的檢測。

1.3.6 細(xì)胞活性與毒性檢測實驗

使用Calcein AM/PI染色試劑盒進(jìn)行細(xì)胞活性與毒性檢測實驗。接種約1×105個細(xì)胞于鋪有細(xì)胞爬片的24孔板中(0.5 mL),置于37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)24 h后每孔加入250 μL Calcein AM/PI檢測工作液,37 ℃避光孵育30 min,孵育結(jié)束后,在熒光顯微鏡下觀察染色效果,并拍照記錄。

1.3.7 細(xì)胞因子檢測

將RAW264.7細(xì)胞接種于12孔板(1 mL),每孔接種約2×105個細(xì)胞,置于37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)24 h后,每個孔中加入100 μL 1 000 μg/mL的組蛋白或DNA-組蛋白復(fù)合物,與細(xì)胞共同培養(yǎng)8 h后取上清培養(yǎng)基,3 000 r/min離心3 min,每個樣品設(shè)置4個平行;使用ELISA試劑盒檢測炎癥因子TNF-α以及IL-6的釋放水平。具體步驟如下:

(a)按比例混合捕獲抗體及包被緩沖液,渦旋振蕩30 s后加入96孔板中,每孔加100 μL,4 ℃密封條件下過夜,使抗體與孔板底部偶聯(lián),用含0.05%吐溫的PBS緩沖液洗滌3次(后續(xù)步驟中洗滌均使用此緩沖液)。

(b)將200 μL ELISA/ELISPOT稀釋液加入到已包被抗體的96孔板中,室溫下封閉2 h,洗滌1次以上。

(c)用去離子水將TNF-a、IL-6標(biāo)品稀釋至1 000 pg/mL。用去離子水將樣品稀釋10倍,標(biāo)準(zhǔn)品梯度稀釋3次后分別加入孔板中,并用稀釋液設(shè)置空白對照,每孔體積100 μL,室溫密封條件下反應(yīng)2 h,洗滌3次。

(d)按比例混合檢測抗體及稀釋液,渦旋振蕩30 s后加入96孔板中,每孔100 μL,室溫密封條件下反應(yīng)1 h,洗滌3次。

(e)按比例混合Avidin-HRP以及稀釋液,渦旋振蕩30 s后加入96孔板中,每孔100 μL,室溫密封條件下0.5 h,洗滌5次。

(f)將TMB顯色劑按照每孔100 μL加入96孔板,室溫避光條件下反應(yīng)15 min,此時樣品由無色變?yōu)樗{(lán)色;

(g)每孔加入100 μL終止液終止反應(yīng),樣品由藍(lán)色變?yōu)辄S色;

(h)用酶標(biāo)儀測量各孔在450 nm波長下的吸光度值;根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線及稀釋倍數(shù)計算各孔樣品的細(xì)胞因子濃度。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

所有實驗均采用至少3個獨立數(shù)據(jù)樣本分析,使用GraphPad Prism 9軟件計算雙尾非配對t-test檢驗分析統(tǒng)計學(xué)顯著性,在P<0.05時表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。對于本實驗結(jié)果標(biāo)記如下:P≥0.05標(biāo)記為ns;P<0.05標(biāo)記為*;P<0.01標(biāo)記為**;P<0.001標(biāo)記為***;P<0.000 1標(biāo)記為****。

2 結(jié)果與分析

2.1 敲除RAGE降低HEK293T細(xì)胞對組蛋白的內(nèi)化能力

RAGE與其配體綁定后,多引發(fā)吞噬作用[14-15],為了觀察HEK293T細(xì)胞是否能夠識別內(nèi)化可溶性組蛋白分子,本研究使用綠色熒光(FITC)標(biāo)記了組蛋白,將其加入到細(xì)胞培養(yǎng)基中,使終質(zhì)量濃度為100 μg/mL,與HEK293T細(xì)胞共孵育1 h后,在顯微鏡下觀察。結(jié)果顯示,野生型細(xì)胞呈現(xiàn)明顯的組蛋白與溶酶體共定位現(xiàn)象(圖1中箭頭所指黃色熒光點即為綠色熒光標(biāo)記的組蛋白與紅色熒光標(biāo)記的溶酶體共定位,比例尺為10 μm),而在RAGE-敲除細(xì)胞內(nèi)則未發(fā)現(xiàn)有熒光共定位現(xiàn)象(圖1),說明在HEK293T細(xì)胞中,RAGE可以介導(dǎo)識別并內(nèi)化組蛋白。

圖1 熒光顯微鏡分析野生型與RAGE-敲除細(xì)胞內(nèi)化組蛋白Fig.1 Analysis of histone uptake in wild-type and RAGE-KO cells by fluorescence microscopy

為了進(jìn)一步量化比較野生型和RAGE-敲除細(xì)胞對組蛋白的內(nèi)化能力,采用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行分析。將細(xì)胞與100 μg/mL組蛋白共孵育1 h后上機(jī)檢測,結(jié)果顯示,在敲除RAGE后,HEK293T細(xì)胞對組蛋白的內(nèi)化能力降低約80%(圖2-b),說明RAGE在HEK293T細(xì)胞內(nèi)化組蛋白過程中起到了主導(dǎo)作用。有報道稱DNA可以增強(qiáng)組蛋白對TLR2、TLR4的激活作用[16],因此接下來檢測了細(xì)胞對DNA-組蛋白復(fù)合物的內(nèi)化能力。實驗數(shù)據(jù)顯示,將組蛋白與DNA結(jié)合后再與細(xì)胞共孵育可以顯著提升細(xì)胞對組蛋白的內(nèi)化效率,提升約3倍(圖2-b)。該實驗結(jié)果說明DNA可以增強(qiáng)組蛋白對RAGE的激活作用。

a-野生型與RAGE-敲除細(xì)胞綠色熒光通道FACS直方圖對比; b-FACS直方圖的量化表示圖2 敲除RAGE抑制HEK293T細(xì)胞對組蛋白的內(nèi)化Fig.2 Knock out of RAGE inhibits histone uptake in HEK293T cells

2.2 內(nèi)化組蛋白不會導(dǎo)致細(xì)胞死亡

許多研究表明,胞外組蛋白在體內(nèi)、體外均表現(xiàn)出明顯的細(xì)胞毒性[7, 17],因此本研究分析了(DNA-)組蛋白與細(xì)胞共孵育后的對細(xì)胞活性的影響。如圖3所示,將細(xì)胞與100 μg/mL組蛋白共孵育1 h后,不論野生型或RAGE-敲除細(xì)胞,均呈現(xiàn)鈣黃綠素-AM陽性(有綠色熒光)、碘化丙啶陰性(無紅色熒光)現(xiàn)象(圖3),這表明在本實驗條件下,野生型與RAGE-敲除細(xì)胞均未在與(DNA-)組蛋白共孵育后造成細(xì)胞死亡。

a-野生型細(xì)胞染色結(jié)果圖;b-RAGE-敲除細(xì)胞染色結(jié)果圖圖3 內(nèi)化組蛋白不會導(dǎo)致細(xì)胞死亡Fig.3 Uptake of histone does not induce cell death

2.3 組蛋白能夠通過RAGE導(dǎo)致胞內(nèi)活性氧濃度升高

RAGE與其配體的綁定會激活多種信號通路,從而引發(fā)炎癥反應(yīng),例如,由活性氧水平升高導(dǎo)致線粒體損傷所引發(fā)的炎癥反應(yīng)[18]。因此本研究檢測了野生型和RAGE-敲除細(xì)胞與100 μg/mL(DNA-)組蛋白共孵育1 h后胞內(nèi)的活性氧水平。結(jié)果顯示,組蛋白和DNA-組蛋白復(fù)合物均可使野生型細(xì)胞的胞內(nèi)活性氧濃度提高,但(DNA-)組蛋白無法使RAGE-敲除細(xì)胞的胞內(nèi)活性氧濃度升高(圖4-c)。DNA-組蛋白復(fù)合物提升活性氧水平約為組蛋白的3倍(圖4-b),為了排除游離DNA對結(jié)果的影響,研究也設(shè)置了DNA對照組,結(jié)果表明游離DNA不能引起胞內(nèi)活性氧水平升高(圖4-b),這說明組蛋白可以通過激活RAGE導(dǎo)致胞內(nèi)活性氧水平升高,DNA可以增強(qiáng)組蛋白對RAGE的激活。

a-野生型和RAGE-敲除細(xì)胞綠色熒光通道的FACS直方圖對比; b-野生型細(xì)胞FACS直方圖的量化表示; c-RAGE-敲除細(xì)胞FACS直方圖的量化表示圖4 組蛋白通過RAGE導(dǎo)致胞內(nèi)活性氧水平升高Fig.4 Histone induces ROS production via RAGE

2.4 組蛋白通過RAGE誘導(dǎo)細(xì)胞釋放炎癥因子

RAGE與其配體的綁定會通過多條途徑激活下游信號通路,從而導(dǎo)致炎癥因子的釋放,引發(fā)炎癥反應(yīng)[19]。接下來,本研究檢測了組蛋白和DNA-組蛋白復(fù)合物能否激活RAGE誘導(dǎo)炎癥因子的釋放。本實驗選用巨噬細(xì)胞檢測炎癥因子的釋放水平,將細(xì)胞與100 μg/mL組蛋白共孵育8 h后取培養(yǎng)基上清進(jìn)行ELISA檢測,結(jié)果發(fā)現(xiàn),在與組蛋白共孵育后,野生型巨噬細(xì)胞內(nèi)的TNF-α以及IL-6表達(dá)量顯著增加,將DNA與組蛋白綁定后能夠進(jìn)一步提升炎癥因子的水平,而RAGE-敲除細(xì)胞內(nèi)炎癥因子無上調(diào)現(xiàn)象(圖5)。該結(jié)果表明組蛋白能夠激活RAGE信號通路,導(dǎo)致胞內(nèi)炎癥反應(yīng)。

a-ELISA檢測TNF-α水平;b-ELISA檢測IL-6水平圖5 組蛋白通過RAGE誘導(dǎo)細(xì)胞釋放炎癥因子Fig.5 Histones induce pro-inflammatory cytokines in macrophages via RAGE

3 結(jié)論與討論

研究表明,RAGE與其配體結(jié)合后多引發(fā)吞噬作用,例如,使用RAGE特異性抗體封閉的巨噬細(xì)胞或Rage-/-小鼠來源的巨噬細(xì)胞對凋亡細(xì)胞的吞噬活性均有降低[20]。在之前的研究中,發(fā)現(xiàn)RAGE參與了非專職吞噬細(xì)胞對組蛋白修飾的微米顆粒的吞噬,本研究結(jié)果表示,RAGE能夠介導(dǎo)細(xì)胞對可溶性組蛋白分子的內(nèi)化,該結(jié)果支持了組蛋白是RAGE配體的假設(shè)。

近來諸多研究表明組蛋白有強(qiáng)細(xì)胞毒性與促炎活性。胞外組蛋白能夠激活機(jī)體的免疫應(yīng)答,引發(fā)炎癥反應(yīng),造成并發(fā)癥從而加重疾病,例如,胞外組蛋白被認(rèn)為是致死性全身炎癥的潛在介質(zhì),在多種小鼠器官損傷的模型中,胞外組蛋白的含量均有上升,高濃度胞外組蛋白能夠引發(fā)無菌性炎癥,導(dǎo)致急性肺損傷、多器官功能衰竭,甚至死亡[16, 21]。而在本研究中,將哺乳動物細(xì)胞與組蛋白共孵育后并不會造成細(xì)胞死亡,這說明在本研究的實驗條件下,組蛋白不會表現(xiàn)出強(qiáng)細(xì)胞毒性,因此可以將本實驗條件作為研究組蛋白與RAGE相關(guān)機(jī)制的哺乳動物細(xì)胞模型。

RAGE作為模式識別受體,能夠識別多種DAMPs,其配體的種類決定了它可以參與調(diào)控多種病理過程,如糖尿病、神經(jīng)退行性疾病(如阿爾茲海默癥)、慢性炎癥反應(yīng)等[22-23]。與配體結(jié)合后,RAGE能夠通過刺激NADPH氧化酶,促進(jìn)胞內(nèi)活性氧的生成[24],RAGE信號通路的激活還能夠促進(jìn)炎癥因子的釋放,從而介導(dǎo)炎癥反應(yīng)[18-19]。在本研究中,RAGE與組蛋白結(jié)合后能夠顯著提升胞內(nèi)活性氧水平,并能夠促使TNF-α、IL-6等炎癥因子的表達(dá),該結(jié)果說明組蛋白能夠作為RAGE的配體激活其下游信號通路。

生理條件下,胞外組蛋白多以DNA-組蛋白復(fù)合物的形式存在,例如,在炎癥反應(yīng)中被釋放到胞外的NETs,以及細(xì)胞在凋亡、壞死過程中釋放的核小體等。先前研究表明,DNA能夠增強(qiáng)組蛋白誘導(dǎo)的血栓的生成[9],本研究將組蛋白與DNA結(jié)合,模擬胞外組蛋白的核小體存在形式,結(jié)果顯示將組蛋白與DNA綁定能夠增強(qiáng)其對RAGE的激活作用,該結(jié)果更加強(qiáng)化了本研究發(fā)現(xiàn)在病理生理過程的重要性。由于DNA是RAGE的配體之一,因此推測DNA能夠增強(qiáng)組蛋白與RAGE綁定的親和力,從而進(jìn)一步激活RAGE及其下游反應(yīng),該假設(shè)還需要進(jìn)一步的結(jié)構(gòu)分析證明。

目前組蛋白在體內(nèi)誘發(fā)疾病的機(jī)理尚不明晰,本研究結(jié)果表明組蛋白能夠通過激活RAGE誘發(fā)炎癥反應(yīng),初步明晰了RAGE與組蛋白之間的聯(lián)系,為研究RAGE和組蛋白相關(guān)的疾病提供了思路,為后續(xù)探索組蛋白相關(guān)的炎癥反應(yīng)的分子機(jī)制提供了一個新的研究方向。