紅棗環磷腺苷的提取工藝優化及應用研究

龔頻,龍輝,王小娟,楊文娟,常相娜,陳福欣

1(陜西科技大學 食品與生物工程學院,陜西 西安,710021) 2(西安科技大學 化學與化工學院,陜西 西安,710054)

紅棗是鼠李科棗屬植物,是一種很好的藥食同源的食品,具有很高的的藥用價值和營養價值[1-2]。在目前的研究中表明紅棗中含有多糖、黃酮、環磷腺苷,生物堿等多種活性物質,具有免疫調節、抗疲勞、抗炎、抗氧化等多種活性[3-6]。環磷腺苷(cyclic adenosine monophosphate,cAMP)作為第二信使,可以通過G蛋白偶聯系統抑制或者激活酶的活性,正因為如此,環磷腺苷對于糖脂代謝有一定的調節作用[7-10]。此外,環磷腺苷還具有抑制血小板凝集[11]、抗過敏[12-13]的作用。且環磷腺苷及其衍生物已經用于心絞痛、急性心肌梗死的輔助治療[14-15]。

環磷腺苷的提取多來自于動物內臟,成本偏高,并且采用化學合成方法得到環磷腺苷的副產物多,浪費嚴重,對環境污染大,使成本居高不下[16-18]。紅棗中含有豐富的環磷腺苷[19-20],環磷腺苷作為第二信使,通過調節體內酶、激素等物質,發揮著免疫調節、疾病調控的作用,具有潛在的抗過敏作用[21]。乳霜具有操作簡單、膚感清爽、有較好的鋪展性等優點,為紅棗環磷腺苷的精深加工提供了思路。本研究以金絲小棗為原料,以環磷腺苷的含量為指標,選用響應面法對環磷腺苷的提取工藝進行優化并對提取物進行應用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

金絲小棗,樂天食品有限公司;無水乙醇(分析純)、甲醇(色譜純)、磷酸二氫鉀(分析純),天津市天力化學試劑有限公司;cAMP標準品(色譜純),上海源葉生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

高效液相色譜儀,配有(CSHTMC18 250 mm×4.6 mm,5 μm的XSelect色譜柱),Waters;立式真空冷凍干燥機,上海爭巧科學儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 提取方式

分別考察水浴提取與超聲輔助提取對于環磷腺苷得率的影響。精密稱取干燥紅棗粉末5 g,置入小燒杯中,加入50 mL蒸餾水,分別在數顯恒溫水浴鍋中80 ℃和超聲波輔助下提取30 min,提取液用臺式離心機在6 000 r/min的轉速下離心10 min,分別取其上清液添加蒸餾水至50 mL,并取10 mL上清液定容100 mL。再取少量稀釋液過0.22 μm濾膜,于-20 ℃貯存,備用,用HPLC檢測提取液中環磷腺苷的含量。

1.3.2 單因素試驗

1.3.2.1 料液比對提取率的影響

精密稱取干燥紅棗粉末5 g,分別置入5個小燒杯中,分別加入30、60、90、120、150 mL的蒸餾水配成料液(g∶mL)比分別為1∶6、1∶12、1∶18、1∶24、1∶30的溶液,保鮮膜封住燒杯口,用超聲提取60 min得到提取液,提取液用臺式離心機在6 000 r/min的轉速下離心10 min,分別取其上清液添加蒸餾水至原體積,并取10 mL上清液定容至分別100 mL。再取少量稀釋液過0.22 μm濾膜,于-20 ℃貯存,備用,用HPLC檢測提取液中環磷腺苷的含量。

1.3.2.2 提取時間對提取率的影響

精密稱取干燥紅棗粉末5 g,分別置入5個小燒杯中,加入90 mL的蒸餾水,保鮮膜封住燒杯口,在30 ℃的溫度下,用超聲提取的方式分別提取30、45、60、75、90 min,提取液按照1.3.2.1節的方式處理。

1.3.2.3 乙醇體積分數對提取率的影響

精密稱取干燥紅棗粉末5 g,分別置入5個小燒杯中,分別加入乙醇體積分數為0、25%、50%、75%、100%的溶液90 mL,保鮮膜封住燒杯口,在30 ℃的溫度下,用超聲提取的方式提取60 min,提取液按照1.3.2.1節的方式處理。

1.3.3 響應面試驗

1.3.3.1 響應面試驗因素及水平

本試驗根據單因素試驗的結果,利用Design-Expert V8.0.6軟件進行中心組合設計法設計3因素3水平響應面實驗組,以環磷腺苷的含量為響應值,試驗因素和水平見表1。

表1 響應面優化試驗因素及水平Table 1 Response surface optimization test factors and levels

1.3.3.2 驗證試驗

在響應面模型預測得到的最佳提取工藝的基礎上進行4次重復性驗證試驗,判斷模型的穩定性與重現性。

1.3.4 總環磷腺苷得率的計算

采用HPLC法[22]測定環磷腺苷的含量。

1.3.4.1 色譜條件

色譜條件為:色譜柱為pH 2-11,XSelect色譜柱 CSHTMC18 250 mm×4.6 mm,5 μm,流動相是V(甲醇)∶V(0.05 mol/L磷酸二氫鉀)=20∶80,流速1.0 mL/min,柱溫30 ℃,進樣量10 μL。

1.3.4.2 標曲的制作

精密稱取環磷腺苷標準品50 mg,用超純水定容于1 000 mL的容量瓶中,配制成50 mg/L的標準品母液,并稀釋母液分別得到25、12.5、6.25、3.125、0.125 mg/L的標準品溶液。使用1.3.4.1節的色譜條件檢測,每個標準品溶液進樣3次,取平均值作為峰面積,以標準品濃度為橫坐標,峰面積為縱坐標,得到環磷腺苷的標準曲線。

1.3.4.3 總環磷腺苷的測定及得率的計算

環磷腺苷的得率計算如公式(1)所示:

(1)

式中:W表示環磷腺苷得率,%;c表示根據HPLC峰面積計算出的環磷腺苷的質量濃度,mg/mL;D表示溶液稀釋倍數;V表示供試品溶液體積,mL;m表示紅棗取樣量,mg。

1.3.5 乳霜的制備

1.3.5.1 乳霜配方設計

按照紅棗環磷腺苷的最佳提取工藝得到提取液,利用旋轉蒸發器濃縮除去提取液中的乙醇,并濃縮,凍干成粉末。利用凍干粉設計一款具有抗過敏效果的乳霜,具體的原料及功能如表2所示。

表2 乳霜試劑Table 2 Cream reagents

1.3.5.2 制備工藝

將油相與水相分別加入2個燒杯中,按照配方配比添加試劑。再把油相和水相分別加熱至80 ℃,直到所有試劑全部融化,把水相倒入油相中,攪拌使其充分乳化,室溫冷卻到40 ℃時加入苯氧乙醇和玫瑰純露。

1.3.6 乳霜穩定性檢測

1.3.6.1 感官評價

設計出乳霜的感官評價表,通過涂展性、清爽度、黏稠度、細膩性等4個指標進行判斷。涂展性:檢測產品使用過程中是否會泛白。清爽度:檢測產品使用過程中是否有油膩感。黏稠度:檢測產品的流動性是否合適。細膩性:檢測產品使用過程中是否細膩,是否有顆粒物。

1.3.6.2 耐熱耐寒測試

取適量的樣品,分成3組,分別置入50 ℃烘箱,4 ℃的冰箱和-20 ℃冰箱中,在3種不同的條件下分別放置24 h,觀察是否有油水分離的現象。

1.3.6.3 離心穩定性測試

在離心管中加入適量的樣品,放入到37 ℃的恒溫箱中1 h,然后使用臺式離心機在2 000 r/min的轉速下離心30 min,觀察是否有油水分離。

1.3.6.4 刺激性測試

將該乳霜涂敷手臂內側,每天2次,連續3 d涂抹,并在24 h后觀察涂敷部位,未出現疼痛、紅腫、起疹、水皰等不良反應。可證明本制劑對皮膚無刺激性。

1.4 數據處理

所有實驗均重復3次,采用GraphPad Prism 8.0.2和Design Expert 8.0.6 進行數據的處理和繪圖分析。

2 結果與分析

2.1 提取工藝優化

2.1.1 提取方式的確定

如圖1所示,可以明顯看見超聲提取的環磷腺苷得率大于水浴提取,因此提取的方式選擇超聲輔助提取。這可能是超聲引起的空化現象所造成的。超聲空化中形成的微小氣泡爆裂時會產生極大的壓力,使植物細胞壁快速破裂,同時超聲波產生的振動作用加強了胞內物質的釋放,從而顯著提高提取效率。

圖1 提取方式對環磷腺苷得率的影響Fig.1 Effect of extraction methods on the yield of cAMP

2.1.2 料液比對環磷腺苷得率的影響

如圖2所示,隨著提取液的增加,環磷腺苷的得率在逐漸增加,但是料液比達到一定程度時,環磷腺苷的得率變化不大,說明環磷腺苷的提取量接近飽和,再增大料液比會造成資源的浪費。因此選擇料液比為1∶24(g∶mL)較合適。

2.1.3 提取時間對環磷腺苷得率的影響

如圖3所示,隨著提取時間的延長,剛開始環磷腺苷的得率在逐漸升高,但是到達一定時間后,環磷腺苷的得率反而有所下降,可能是由于長時間的超聲使得環磷腺苷結構被破壞導致得率降低。因此選擇提取時間為60 min較合適。

圖2 料液比對環磷腺苷得率的影響Fig.2 Effect of material-liquid ratio on the yield of cAMP

圖3 提取時間對環磷腺苷得率的影響Fig.3 Effect of extraction time on the yield of cAMP

2.1.4 乙醇體積分數對環磷腺苷得率的影響

如圖4所示,隨著乙醇體積分數的增加,環磷腺苷的得率也在逐漸增加,但在75%以后環磷腺苷的得率變化不大,且從經濟方面考慮,選擇乙醇體積分數為75%時較合適。

圖4 乙醇含量對環磷腺苷得率的影響Fig.4 Effect of ethanol content on the yield of cAMP

2.1.5 響應面優化提取工藝

按照表1的方式設計響應面實驗組,共得到17個試驗點,其中分析的試驗點有12個,中心點有5個。采用響應面法分析實驗結果,以環磷腺苷的得率為響應值,最終得到的回歸方程為環磷腺苷得率=711.358 75+1.247 20A+38.339 04B+11.863 95C+0.102 33AB+0.054 40AC-0.102 64BC-0.059 246A2-0.749 99B2-0.099 243C2。

從表3中可以看出整個響應面模型的P=0.020 5<0.05,所以響應面模型是顯著的,同時失擬項的P=0.924 7>0.1,這說明正交試驗結果和模型擬合良好,可以使用模型推測環磷腺苷得率最大時的最優提取條件。且由表3可以看出,各個因素對于環磷腺苷得率的影響由大到小分別是提取時間>料液比>乙醇體積分數。其中每兩兩因素相互作用的響應面圖如圖5所示。

表3 響應面模型方差分析Table 3 ANOVA of response surface model

在圖5中,X、Y軸為影響因素,Z軸為環磷腺苷的含量,從圖中可以明顯看出乙醇體積分數與料液比的相互作用,乙醇體積分數和提取時間的相互作用以及料液比與提取時間的相互作用。且每2個因素相互作用,都明顯存在最高點。根據響應面法建立的模型,最終得到了最佳工藝,最佳的提取條件是料液比為1∶25.42(g∶mL)、提取時間63.51 min、乙醇體積分數61.63%,理論得率為191.15 μg/g。

2.1.6 驗證試驗

在理論條件下,提取的環磷腺苷的得率為191.15 μg/g。在此基礎上進行4次重復性實驗,結果如表4所示,可見預測值與實際提取值吻合度較好,模型具有良好的穩定性與重現性。

2.2 乳霜制備

2.2.1 乳霜配方

經過配方研究后,最終得到的各成分的占比如表5所示:

a-乙醇體積分數和料液比對cAMP得率影響的響應面和等高線;b-乙醇體積分數和提取時間對cAMP得率影響的響應面和等高線; c-料液比和提取時間對cAMP得率影響的響應面和等高線圖5 兩個因素相互作用的等高線與響應面Fig.5 Contours and response surface of interaction between two factors注:左為等高線,右為響應面。

表4 重復性實驗結果Table 4 Repeatability test results

表5 乳霜配方Table 5 Cream formula

2.2.2 乳霜質量檢測

2.2.2.1 感官評價

選取皮膚刺激性實驗的5名受試者的使用反饋,并對其主觀評價。由乳霜的感官評價(圖6)可知,乳霜在涂展性、細膩性、清爽度、黏稠性方面均有良好的性能。

圖6 乳霜感官評價Fig.6 Sensory evaluation of cream注:優良:9～10分;良好:7～8分;一般5～6分; 較差:3～4分;很差:1～2分。

2.2.2.2 耐熱耐寒試驗

如圖7所示,乳霜在50 ℃烘箱、4 ℃的冰箱和-20 ℃冰箱中,在3種不同的環境中進行測試,未發現有油水分離現象,說明乳霜的乳化體系穩定,且紅棗水溶液對于乳霜并無不良影響。

a-耐寒試驗前;b-耐寒試驗后圖7 乳霜耐熱耐寒試驗前后對比Fig.7 Cream before and after heat and cold tolerance test

2.2.2.3 離心穩定性試驗

如圖8所示,乳霜在2 000 r/min的條件下離心30 min并未發現油水分離現象,可見乳霜的離心穩定性良好。

a-離心穩定性試驗前;b-離心穩定性試驗后圖8 乳霜離心穩定性試驗前后對比Fig.8 Cream before and after the centrifuge stability test

2.2.2.4 皮膚刺激性試驗

在進行感官評價時尋找了5位志愿者,在皮膚上涂抹后并未發現紅腫瘙癢等過敏現象,可見乳霜對機體無刺激性。

3 結論與討論

本研究考查了提取方式對環磷腺苷得率的影響,發現超聲提取比水提取的得率更高,同時查閱文獻發現陳愷等[23]的水浴提取最高得率為157.3 μg/g,明顯小于在超聲輔助下提取的cAMP得率,可見在超聲波輔助下提取能顯著提高cAMP的得率。乙醇體積分數、料液比、提取時間3個單因素對于環磷腺苷得率的影響,然后采用了Design-Expert V 8.0.6軟件進行中心組合設計法設計響應面的實驗組,并建立了模型,得到了預測的最優工藝,在預測的最優工藝基礎上,進行4次試驗驗證,發現理論得率與實際得率吻合度達到98.9%,最終確定了最佳提取工藝為:料液比1∶25.42(g∶mL)、提取時間63.51 min、乙醇體積分數61.63%。在此條件下提取的環磷腺苷理論得率為191.15 μg/g,實際得率為189.07 μg/g。

過敏性疾病大多是細胞內環磷酸腺苷濃度下降所致[24]。由于紅棗產量過剩,本研究對其進行精深加工,促進紅棗資源的合理利用。除了環磷腺苷具有良好的抗過敏活性外,其提取物中還存在大量的多糖、黃酮、酚類等物質,具有良好的抗氧化特性,能有效增加乳霜的功能[25]。本研究利用紅棗提取物制備的乳霜,經穩定性實驗檢驗,發現本乳霜穩定性良好,并有望開發成為一款抗過敏乳霜。